乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建

目的为了探讨HBx基因与肝癌发生的关系,构建HBx基因重组腺病毒载体。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统,首先从质粒pCDNA3．1-HBx中酶切得到HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV中,得到pAdTrack—CMV—HBx,将其PmeI酶切线性化后,转到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中,通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pAd—HBx,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚肾293细胞,产生重组腺病毒颗粒Ad—HBx。结果、PCR和酶切鉴定证明重组腺病毒Ad—HBx构建成功,在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白GFP。结论成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,为后续研究奠定了基础。     

重组表达乙肝病毒x蛋白的腺病毒构建及在HepG2细胞的表达

目的:构建重组表达HBx的腺病毒,并通过感染细胞建立HBx高表达的细胞模型。方法:首先将HBx基因插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack中,限制性酶切鉴定正确后将其用PmeⅠ酶切线性化,转到BJ5183感受态细菌进行同源重组,重组后的腺病毒载体pAd-HBx经PacⅠ酶切线性化后,转染到QBI-293A细胞中,根据EGFP的表达判断重组腺病毒的包装情况。RT-PCR鉴定重组腺病毒的HBx基因表达。根据GFP的表达检测病毒滴度和感染效率。将病毒感染人肝癌HepG2细胞,48h后收集裂解细胞,Westernblot检测HBx蛋白的表达。结果:重组腺病毒载体pAd-HBx经酶切鉴定确认构建成功。将pAd-HBx转染到QBI-293A细胞,荧光检测提示病毒获得成功包装,RT-PCR检测到细胞中HBx基因的表达。重组病毒感染人肝癌HepG2细胞,Westernblot检测到HBx蛋白表达。结论:成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒,感染肝癌HepG2细胞后检测到了HBx蛋白的表达,提示建立了HBx高表达的细胞模型,为后续的HBx的功能研究奠定了基础。     

Ad-HBx的构建及在肾小球足细胞系的表达

目的 构建携带HBx基因的非复制型重组腺病毒载体,并感染小鼠肾小球足细胞株MPC5,使目的 基因HBx在该细胞株有效表达.方法 由质粒PCI-neo-HBx中扩增目的 基因HBx.插入至pShuttle-CMV(-)穿梭质粒中,而后再与pAdxsi质粒酶切连接为重组腺病毒质粒pAd-HBx,经酶切及测序鉴定正确后,以Pac Ⅰ酶切线性化转染293细胞进行包装扩增得到Ad-HBx.以Ad-HBx感染MPC5细胞,Western blot检测感染后目的 蛋白HBx的表达.结果 重组腺病毒载体经限制性内切酶酶切、电泳和基因测序鉴定,证实Ad-HBx构建成功;当MOI=50时.MPC5细胞即可100%被重组腺病毒感染,且持续至感染后72 h仍有较强水平的表达;感染Ad-HBx的MPC5细胞可稳定表达HBx蛋白.结论 成功构建了Ad-HBx,并能在MPC5细胞中稳定表达,为进一步研究HBx基因在乙型肝炎病毒相关性肾炎发病中的作用奠定了基础.     

endostatin基因重组腺病毒的构建及在人肺腺癌细胞的表达

目的 利用AdEasy系统构建鼠内皮抑素(ES)基因重组腺病毒Ad.ES,并观察其在人肺腺癌细胞SPCA-1的表达.方法 采用酶切、连接和转化等方法,将质粒pcDNA3.ES中的ES片段插入腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV,构建重组腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV.ES,经Pme Ⅰ酶切线性化后与含腺病毒基因骨架的质粒载体pAdEasy-1在细菌BJ5183内进行同源重组得到腺病毒质粒pAd.ES,重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切后,转染人胚肾293细胞包装成腺病毒颗粒Ad.ES,将病毒上清反复感染293细胞获得高滴度病毒,应用氯化铯(CsCl)梯度离心的方法纯化病毒,利用AdEasy系统上的绿色荧光蛋白(GFP)标签测定重组腺病毒的功能滴度.用2 MOI重组腺病毒Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h,流式细胞仪检测GFP表达阳性率,ELISA法测定细胞培养上清液中ES的含量.结果 双酶切证实重组腺病毒穿梭载体pAdTrack.CMV.ES质粒构建正确,卡那霉素抗性筛选和Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d,约20%的细胞表达GEP,回收病毒重复感染293细胞,CsCl梯度离心纯化最终获得约5.6×1010TU/mL滴度的重组病毒.Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h后,细胞GFP阳性率为93%,细胞培养上清液中ES的含量较Ad.GFP感染组和阴性对照组明显增加(P＜0.05).结论 应用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和ES的重组腺病毒,Ad.ES体外感染人肺腺癌细胞SPCA-1可显著提高ES表达,为进一步研究抗血管生成治疗肺癌奠定了基础.     

利用Adeasy-1系统构建npcl基因非复制型腺病毒载体并鉴定

目的以复制缺陷的腺病毒为载体,细菌内同源重组法构建有npcl基因的腺病毒载体.方法利用限制性内切酶kpnl HindⅢ从带有朊病毒启动子的质粒prp-pro-mlpcl中切下目的基因npcl-1,克隆至穿梭质粒PAdtrack-CMV,再与PAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,经抗性筛选和酶切鉴定的质粒再利用脂质体转染人293例细胞中扩增,利用Adeasy-1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒,RT-PCR鉴定目的基因的表达.结果切酶切鉴定,正确的目的基因片断已克隆至穿梭质粒PAdtrack-CMV;卡那霉素进行抗性筛选及Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d后见明显的绿色荧光蛋白表达.回收病毒,可重复感染293细胞,证实有感染能力的病毒颗粒包装成功.结论利用腺病毒载体系统Adeasy-1可构建能成功表达Pac Ⅰ基因的腺病毒载体,为对Niemann pick' s病C型的进一步研究提供了条件.     

人CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:用AdEasy腺病毒载体系统构建CTLA4Ig重组腺病毒,以感染树突状细胞使其递呈抗原至T淋巴细胞功能受阻.方法:双酶切、凝胶回收方法从质粒pCDM8-CTLA4Ig提取目的基因CTLA4Ig,构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CTLA4Ig;经酶切线性化后的pAdTrack-CTLA4Ig与AdEasy-1进行同源重组,经酶切线性化转染入HEK293细胞进行包装.结果:卡那霉素抗性筛选和PacⅠ酶切确证重组腺病毒质粒pAd-CTLA4Ig,PacⅠ酶切产生30 kb和4.5 kb 2个片断为同源重组.重组腺病毒质粒经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获病毒并制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为1.6×109).结论:成功构建了携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体,为利用CTLA4Ig基因转染树突状细胞的基因治疗奠定了基础.     

HBx-shRNA重组腺病毒的构建及功能鉴定

目的：构建携带绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）标签的乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X pro－tein,HBx）特异性shRNA重组腺病毒,并对其干扰效果进行鉴定。方法：将前期构建的真核表达载体pGenesil-1-HBx-shRNA和pGenesil-1-Scramble sequence的表达启动子U6连同shRNA 亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建pAdTrack-CMV-U6-HBx-shRNA和对照pAdTrack-CMV-U6-Scramble sequence穿梭质粒;酶切及DNA测序鉴定后,经PmeⅠ线性化后转化入感受态AdEasier细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramble sequence,PacⅠ酶切后转染AD293细胞获得重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA和Ad-U6-Scramble sequence;扩增病毒,测定滴度;以RT-PCR和real-time PCR鉴定重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA对HBx的干扰效果。结果：酶切鉴定得到阳性pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramble sequence重组质粒;转染到AD293细胞并包装成功;RT-PCR以及real-time PCR表明,重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA携带的干扰片段能够明显干扰HBx表达（P=0.01）。结论：成功构建了HBx特异性shRNA重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA,它能抑制HepG2.2.15细胞中的HBx的表达,为研究HBx作为肝癌基因治疗作用的一个靶点以及机制奠定基础。     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建人GST-π基因的重组腺病毒

目的：利用AdEasy腺病毒载体系统构建人谷胱甘肽转移酶-π（GST-π）基因重组腺病毒并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法：从质粒中通过PCR的方法扩增出目的基因GST-π并带有适宜的酶切位点,双酶切后连pAdtrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrack-GST-π,经酶切线性化后,采用电穿孔转化到含腺病毒骨架质粒AdEasy1的BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中,挑选同源重组质粒AdEasy-GST-π,酶切线性化重组质粒并转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达。重组病毒上清乒乓交互感染HEK293细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果：经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带GST-π基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论：成功地构建了携带GST-π基因的重组腺病毒载体,为利用GST-π基因转染造血干细胞的基因治疗奠定了基础。     

大鼠促红细胞生成素重组腺病毒载体的构建及其在大鼠SGNs中的表达

目的构建大鼠促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)重组腺病毒载体,并转染于体外培养的大鼠螺旋神经元(spiral ganglion neurons,SGNs)。方法全基因合成大鼠EPO基因,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-EPO。经酶切、PCR及测序鉴定,再经PacⅠ酶切线性化后电转化感受态细胞,获得重组腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO,经PacⅠ酶切后转染至293细胞进行包装,制备重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度测定及RT-PCR和Western blot鉴定。并转染至体外培养的螺旋神经元,免疫荧光检测及蛋白水平检测螺旋神经元中EPO表达。结果经KpnⅠ、HindⅢ酶切与测序鉴定显示,腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO构建成功,重组腺病毒AdEPO在293细胞中成功包装,扩增后病毒滴度为1.17×1011U/ml;经RT-PCR和Western blot检测EPO在293细胞中成功表达。重组腺病毒载体AdEPO经鉴定均构建正确;免疫荧光及Western blot检测转染腺病毒后螺旋神经元中EPO表达显著增强。结论成功构建了EPO重组腺病毒载体,并成功转染螺旋神经元,可显著增强螺旋神经元中EPO表达水平。     

小鼠降钙素基因相关肽基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞的表达

目的:利用AdEasy腺病毒载体系统,构建小鼠降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)基因重组腺病毒载体,并验证其在心肌细胞中的表达.方法:采用RT-PCR方法扩增出含有小鼠CGRP全长cDNA的基因片段,并将其插入PUC57载体,经EcoRⅤ和SalⅠ双酶切,将小鼠CGRP基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV,形成重组质粒pShuttle-CMV-CGRP.经PmeⅠ酶切线性化后,在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组产生重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP.重组腺病毒质粒在XL-Gold 细胞中扩增,经PacⅠ酶切线性化后,转染人胚肾293细胞进行重组腺病毒的包装,并经氯化铯纯化得到重组腺病毒AdEasy-pShuttle-CGRP.用纯化后的重组腺病毒转染原代培养的乳鼠心肌细胞,荧光显微镜下观察转染效果.通过尾静脉导入重组腺病毒7 d后,放免法测定心肌中CGRP的表达量.结果:测序证实PUC57 -CGRP重组质粒中含有小鼠CGRP基因的cDNA;重组穿梭质粒pShuttle-CMV-CGRP经双酶切鉴定后可见约7.5 kb和423 bp片段;重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP经Pac Ⅰ酶切可见长约3 kb与30 kb DNA片断.转染293细胞进行包装,7 d后细胞出现病变效应,回收病毒重复感染293细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达.提取病变293细胞中重组腺病毒进行目的基因的PCR鉴定为阳性.构建好的重组腺病毒经纯化后具有很高的滴度,并且成功转染了原代培养的乳鼠心肌细胞.通过放免法证实,该载体可以显著增加小鼠心脏中CGRP的表达.结论:成功构建携带CGRP基因的重组腺病毒载体,该重组腺病毒载体AV-CGRP可以显著增加心脏中CGRP的表达量,为进一步研究CGRP基因治疗奠定了基础.