日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的 构建日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST-Sj32,分析该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达情况.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得Sj26GST和Sj32抗原编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)剪接Sj26GST和Sj32,得到Sj26GST-Sj32融合基因,克隆至原核表达载体pET32α(+),构建重组质粒pET32α-Sj26GST-Sj32,转化人大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析和鉴定.结果 基因拼接法扩增出约1991 bp的Sj26GST-Sj32融合基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST-Sj32融合基因成功插入pET32a(+)中,SDS-PAGE分析显示表达产物为分子质量约82000 Mr的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的22%;Westem-blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.     

日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建并研究日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法从日本血吸虫成虫组织提取总RNA;RT-PCR扩增Sj14-3-3编码基因;将此基因克隆至载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Sj14-3-3;转化入DE3中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达;表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果 RT-PCR扩增出399bp的Sj14-3-3编码基因;并成功将其插入pGEX-1λT构建了重组质粒pGEX-Sj14-3-3;SDS-PAGE显示相对分子质量约为40 000的重组蛋白,与预期结果相符,薄层扫描分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的21%;Western blot显示重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清识别。结论日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3构建成功,重组质粒在大肠埃希菌BL21中可较高效表达,且表达蛋白具有特异的抗原性。     

日本血吸虫重组BCG-sj26GST疫苗免疫小鼠后IgG抗体反应的动态观察

目的：检测日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗免疫小鼠不同时间后的IgG抗体。方法：将10^6CFU疫苗采用皮下和静脉注射分别免疫BABL/C鼠,分别于免疫后0、4、8、10、14和16周各剖杀4只,收集血清,常规ELISA法检测IgG抗体,同时设PBS皮下注射对照组。结果：皮下注射组和静脉注射组IgG抗体水平都于免疫后4周显著增加,免疫后10周达最高水平,并持续在较高水平至免疫后16周。疫苗免疫后10周静脉注射组的抗体水平显著高于皮下注射组。结论：日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗静脉注射免疫效果优于皮下注射。     

血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗接种后保护力的观察

为了探讨血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗免疫鼠后对尾蚴攻击感染的保护性作用,采用１０６ＣＦＵ和１０８ＣＦＵ重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗皮下接种ＢＡＬＢ／Ｃ鼠,接种后８周用日本血吸虫尾蚴进行攻击感染,感染后６周剖杀小鼠,计算减虫率、减卵率,同时进行虫卵肉芽肿周长和面积测量,以及抗体水平和抗原水平测定,同时设有ＰＢＳ对照组。结果表明重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗免疫小鼠后,１０６ＣＦＵ、１０８ＣＦＵ组与对照组相比,减虫率分别为２７．３４％、１６．６４％,减卵率分别为５５．７５％、６０．５０％,虫卵肉芽肿的平均周长和平均面积、免疫后血清抗体水平差别均具有非常显著意义;１０８ＣＦＵ与１０６ＣＦＵ组相比,血清抗原水平差别具有显著意义,说明血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗是一种比较理想的新型疫苗,值得进一步深入研究     

日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗免疫小鼠后IgG及其亚类和CAg的动态观察

目的检测日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗免疫小鼠不同时间后的血清IgG及其亚类和CAg反应.方法 106CFU疫苗皮下和静脉注射免疫BALB/C鼠,分别于免疫后0、4、8、10、14、16周各剖杀4只,收集血清,常规ELISA法检测IgG及其亚类和CAg.结果皮下注射组IgG在免疫后14周,IgG1在免疫后14～16周,IgG2a在免疫后4周和IgG2b在免疫后16周达最高水平,未能测到CAg;静脉注射组IgG在免疫后10周,IgG1和IgG2a在免疫后8周以及IgG 2b在免疫后16周达最高水平,CAg在免疫后10周升高.结论日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗能诱导宿主产生高水平的IgG、IgG2a和IgG2b,静脉注射的免疫效果优于皮下注射.     

日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗免疫小鼠血清IgG动态观察及免疫保护力的研究

为检测血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗免疫小鼠血清IgG动态变化和免疫保护力,采用106CFU疫苗皮下1次和3次接种小鼠,接种后8周用日本血吸虫尾蚴攻击感染。感染后6周剖杀小鼠,计算减虫率和减卵率,同时设有BCG对照组。结果发现实验组免疫后血清IgG抗体迅速升高并持续于高水平;减虫率分别为39.74%和39.74%,减卵率分别为62.86%和55.62%,与对照组相比均有非常显著的差异（P<0.01）。而免疫3次和免疫1次小鼠血清IgG抗体水平及减虫率、减卵率均无显著差异。血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗皮下注射1次即能诱导小鼠较高水平的IgG抗体和免疫保护力,是一种比较理想的新型疫苗,值得进一步研究。     

日本血吸虫重组BCG—Sj26GST疫苗免疫小鼠血清IgG动态观察及免疫保护力的研究

为检测血吸虫重组BCG－Sj26GST疫苗免疫小鼠血清IgG动态变化和免疫保护力，采用10^6CFU疫苗皮下1次和3次接种小鼠，接种后8周用日本血吸虫尾蚴感染。感染后6周剖杀小鼠，计算减虫率和减卵率，同时设有BCG对照组。结果发现：实验组免疫后血清IgG抗体迅速升高并持续高于水平；减虫率分别为39.74%和39.74%，减卵率分别为62.86%和55.62%，与对照组相比均有非常显著的差异（P＜0.01）。而免疫3次和免疫1次小鼠血清IgG抗体水平及减虫率、减卵率均无显著差异。血吸虫重组BCG－Sj26GST疫苗皮下注射1次即能诱导小鼠较高水平的IgG抗体和免疫保护力，是一种比较理想的新型疫苗，值得进一步研究。     

日本血吸虫理组BCG—Sj26GST疫苗免疫小鼠后IgG及其亚类和CAg的动态观察

目的：检测日本血吸虫重组BCG－Sj26GST疫苗免疫小鼠不同时间后的血清IgG及其亚类和CAg反应。方法：10^6CFU疫苗皮下和静脉注射免疫BALB／C鼠，分别于免疫后0、4、8、10、14、16周各剖杀4只，收集血清，常规ELISA法检测IgG及其亚类和CAg。结果：皮下注射组IgG在免疫后14周，IgGl在免疫后14－16周，IgG2a在免疫后4周和IgG2b在免疫后16周达最高水平，未能测到CAg；静脉注射组IgG在免疫后10周，IgGl和IgG2a在免疫后8周以及IgG2b在免疫后16周达最高水平，CAg在免疫后10周升高。结论：日本血吸虫重组BCG－Sj2GST疫苗能诱导宿主产生高水平的IgG、IgG2a和IgG2b，静脉注射的免疫效果优于皮下注射。     

日本血吸虫重组抗原的诱导表达及其免疫学活性鉴定

为了筛选和发现日本血吸虫新的疫苗候选抗原分子我们构建了日本血吸虫抗原ＰＳｊ＾５１４与表达载体ｐＧＥＸ－１λｔ重组体，表达克隆ｐＧＳｊ２４。对工程菌的诱导表达及表达产物分析证实，特异性表达产物是分子量约为２２ｋＤａ的两条十分接近的蛋白带。该蛋白可溶性蛋白，表达方式为分离表达，可被日本血吸虫免疫兔血清，感染兔血清及病人血清特异地识别。     

日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗诱导小鼠脾细胞IL-6变化的研究

目的：研究日本血吸虫重组BCG－Si26GST疫苗对小鼠脾细胞IL－6的影响,方法：实验1采用该疫苗皮下免疫小鼠,免疫后8周用日本血吸虫尾缦进行攻击感染,感染后6周剖杀小鼠,同时设有PBS对照组,实验2用该疫苗皮下和静脉注射分免疫小鼠,于免疫后,0,4,8,10,14和16周各剖杀4只,分离脾脏,用Si26或PHA刺激脾细胞,用ELISA法检测5 清液中IL－6含量,结果：疫苗免疫尾缦攻击后,IL－6水平无明显变化;动态观察发现IL－6于疫苗免疫后8－10周达最高水平,结论：IL－6可能与日本血吸虫重组BCG－Si26GST疫苗诱导的保护性免疫力无关。     

日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗对小鼠免疫应答的影响

采用日本血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。免疫８周时,断头取血,取脾脏,取腹腔巨噬细胞。以淋巴细胞刺激指数（ＳＩ）反映细胞增殖能力,以ＮＯ释放量检测巨噬细胞吞噬活性,以ＥＬＩＳＡ试剂盒检测血清及脾淋巴细胞培养上清的白细胞介素２（ＩＬ－２）和干扰素－γ（ＩＦＮ－γ）的含量。结果表明,ｒＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗以 １０~６ＣＦＵ剂量经皮下免疫小鼠后,小鼠脾淋巴细胞增殖能力明显高于对照组、载体组和ＢＣＧ组（均为Ｐ＜０．０５）;小鼠腹腔巨噬细胞ＮＯ的含量明显高于对照组和载体组（均为Ｐ＜０．０１）;小鼠血清ＩＬ－２的含量明显高于对照组（Ｐ＜０．０１）和载体组（Ｐ＜０．０５）;而小鼠脾淋巴细胞培养上清ＩＬ－２的含量分别高于对照组４４％、载体组４８％和ＢＣＢ组４２％;小鼠血清ＩＦＮ－γ的含量分别高于对照组２０％、载体组１９％和ＢＣＧ组１３％,均有升高趋势、结果提示,ｒＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗能明显增强小鼠的免疫应答反应,其抗感染作用一方面与ＢＣＧ本身的佐剂特性有关,另一方面与机体产生抗Ｓｊ２６－ＧＳＴ特异性抗体有关。     

日本血吸虫重组BCG—Sj26GST疫苗对小鼠免疫应答的影响

采用日本血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。免疫８周时,断头取血,取脾脏,取腹腔巨噬细胞。以淋巴细胞刺激指数（ＳＩ）反映细胞增殖能力,以ＮＯ湫得检测巨噬细胞吞噬活性,以ＥＬＩＳＡ试剂盒检测血清及脾淋巴细胞培养上清的白细胞介素２（ＩＬ－２＿和干扰素γ（ＩＦＮ－γ）的含量。结果表明,ｒＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗以１０＾－６ＣＦＵ剂量经皮下免疫小鼠后,小鼠脾淋巴细胞增殖能力明显高于     

大肠埃希菌耐药性质粒的提取及鉴定

目的检测大肠埃希菌对9种抗生素的耐药性，探讨大肠埃希菌耐药的分子机制。方法采用平皿二倍稀释法测定40株临床分离的大肠埃希菌对抗生素的敏感性，同时用碱裂解法对耐药菌株进行质粒的抽提，将得到的质粒转化至受体菌JM109进行质粒耐药性的鉴定。结果40株大肠埃希菌对头孢菌素等9种抗生素呈现出不同程度的耐药现象。对氨苄西林和青霉素的耐药性分别达到了87．5％和97．5％。从两株耐药大肠埃希菌中提取出质粒，对其中一株进行转化鉴定，确定为耐药质粒，大小约为3．0kb。结论临床分离大肠埃希菌对多种抗生素表现出较高的耐药性，而耐药性质粒的存在是细菌产生耐药性的机制之一。     

大肠埃希菌的耐药性和质粒谱型研究

目的检测大肠埃希菌的耐药性及其对应的质粒图谱，探讨其耐药机制以便正确指导临床用药。方法使用4类（11种）抗生素测试152株致病性大肠埃希菌的耐药情况，K—B法进行药敏试验，碱裂解法抽提标本质粒后凝胶电泳分析。结果152株致病性大肠埃希菌中128株（84．21％）产生耐药，且耐2种以上药物；其中126株检出1—5个大小不等的质粒，有典型的多态性，质粒分布在1．0—30．0Kb范围内，以23Kb、9．41Kb为主。结论大肠埃希菌耐药率高、耐药谱广，其耐药性可能与菌体中含有分子量23kb、9．4kb的质粒有关。     

健康人肠道大肠埃希菌耐药性与质粒图谱的研究

目的 研究深圳市健康人肠道大肠埃希菌携带的质粒与其耐药性之间的关系.方法 分离健康人肠道大肠埃希菌,K-B法测定细菌对16种抗菌素的耐药性,分析细菌的质粒图谱,对耐药菌株进行质粒分子分型.结果 健康人肠道大肠埃希菌对四环素、萘啶酸、磺胺甲基异恶唑、氨苄西林、复方新诺明和链霉素的耐药率分别为63.33%、49.33%、40.67%、38.67%、35.33%、35.33%,全部菌株对头孢美唑和氨曲南敏感.122株菌(81.33%)耐一种以上抗菌素,88株菌(58.67%)耐2种以上抗菌素,44株菌(29.33%)耐5种以上抗菌素,2株菌耐10种抗菌素.结论 深圳市健康人肠道大肠埃希菌耐药性较严重,其耐药性与所携带质粒的数量和大小并无直接联系.     

pET22b-TP17表达载体的构建与鉴定

目的：采用原核基因工程技术构建表达梅毒螺旋体外膜脂蛋白TP17的载体,并进行酶切鉴定,为获得重组抗原TP17及其用于梅毒血清学诊断试剂的研究奠定基础。方法：将化学合成的寡核苷酸（oligo）通过PCIk的方法拼接成TP17目的基因的序列,并将合成好的序列克隆入pMD18-TSimple载体。以pMD18-TSimple-TP17为模板,PCtk扩增TP17基因片段。PCR产物通过1．5％琼脂糖凝胶电泳回收TP17条带,随后用EeoRI和XhoI对TP17回收所得片段及目的载体pET22b进行双酶切并连接。连接产物电转化至感受态细胞DH10B中后,挑取克隆,提取质粒并鉴定。最后将质粒转化至BL21菌株中。挑取克隆,提质粒,进行鉴定。结果：PCR扩增片段、双酶切均出现445bp大小的目的基因条带,与预期结果相符。结论：本研究成功构建了重组质粒pET22b—TP17,为下一步用IPTG诱导BL21菌株表达重组目的蛋白的研究奠定了基础。     

多重耐药大肠埃希菌质粒介导耐药性的研究

目的：了解临床收集的多重耐药大肠埃希菌克隆播散状况及质粒介导耐药性的特性。方法通过K- B纸片法明确细菌耐药谱,脉冲场凝胶电泳（PFGE）进行耐药菌株的克隆分型,了解其克隆播散情况,通过质粒接合实验获得耐药性质粒的接合菌,用PCR方法筛选接合菌株的常见耐药基因,并利用S1酶切质粒再进行PFGE的方法判读分析质粒的分子大小,分析菌株间的质粒水平迁移状况。结果临床分离95株大肠埃希菌均为多重耐药菌,对青霉素类、头孢菌素类、喹诺酮类、四环素类等药物显示出广泛耐药性,PFGE分型显示克隆传播趋势不明显。耐药菌株常携带可接合性耐药质粒,质粒分子量大小分布在40-330kb,编码多种对青霉素类、头孢菌素类等药物耐药的耐药基因,包括CTX- M型、TEM型β-内酰胺酶基因,以及质粒介导喹诺酮耐药基因qnr等等。结论临床大肠埃希菌多重耐药性严重,耐药性的快速传播已非同源克隆细菌的简单播散,可接合质粒造成的耐药基因水平转移可能起到了相当重要的作用。     

重组鼠IL-28的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的: 获取重组鼠IL-28(mIL-28)纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法: 用PCR技术扩增鼠IL-28成熟蛋白的编码序列,克隆入原核表达载体pET-30,构建融合表达载体pET-30a-mIL-28,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达IL-28融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,然后免疫6～8周龄鸡,制备多克隆抗体,采用ELISA 检测抗体效价.结果: 成功构建了表达载体pET-30a-mIL-28,DNA序列测定结果与预期结果一致.在37℃培养条件下,IPTG诱导表达的IL-28融合蛋白进行SDS-PAGE电泳分析,发现其与融合蛋白的理论计算值一致,免疫鸡后收获抗血清, ELISA 显示抗体效价具有高度特异性.结论: 获得了重组鼠IL-28纯化蛋白,制备了鼠IL-28多克隆抗体,为进一步深入研究IL-28的生物活性及其应用打下基础.     

大肠埃希菌质粒型AmpC酶基因的检测分析

目的 调查大肠埃希菌质粒型Ampc酶基因的存在状况。方法 采用MH药敏平板对40株临床分离的大肠埃希菌进行抗菌药物敏感试验和ESBLs纸片法确诊,PcR方法检测DHA和ACT-1型Ampc酶基因。结果 40株大肠埃希菌呈多重耐药,20株ESBLs阳性菌AmpCM基因阳性率90％,20株ESBLs性菌Ampc酶基因阳性率45％,40株大肠埃希菌ACT-1和DHA基因阳性率分别为57．5％,40．0％,有12株大肠埃希菌同时携带ACT-1和DHA基因。结论 临床分离的大肠埃希菌多重耐药严重,质粒型AmpC酶基因携带率高。     

日本血吸虫重组疫苗的研究概况

<正> 血吸虫病是严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病。它威胁着全世界74个国家和地区约6亿人口的健康,估计感染人口约为2亿,患者2千万左右。世界卫生组织(WHO)认为该病是所有寄生虫病中分布范围最广、危害最严重的疾病之一。多年来,防治血吸虫病一直是靠传统的吡喹酮药物化疗和杀灭钉螺的方法。但效果并非尽如人意,其原因包括多方面:首先,吡喹酮对已造成的损害组织作用甚微,且化疗药物的应用,还可能造成临床症状的不典型,使血吸虫的早期诊断难度加大,同时大规模使用吡喹酮治疗时有诱发某些虫株产生耐药性的可能;同时,血吸虫保虫宿主种类繁多,如牛、羊、鼠等哺乳动物,据统计全世界有54万头病畜,都可以作为其传染源;其次,作为血吸虫的中间宿主钉螺,其分布的水域面积广阔,有螺面积估计约34亿平方米,加之山区丘陵地形复杂等原因,使消灭钉螺具有相当难度;第三,血吸虫尾蚴感染速度非常之快及感染后不能获得持久性的免疫力,易重复感染等。因此,要从根本上控制和消灭血吸虫病应考虑借助于疫苗。