HPV16 E6和E7对乳腺癌MCF-7细胞中基质金属蛋白酶-9蛋白表达的影响

目的探讨HPV16 E6和E7稳定高表达对HPV16阴性的人低转移乳腺癌MCF-7细胞中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达的影响。方法利用脂质体介导在体外将HPV16 E6和E7转染人低转移乳腺癌MCF-7细胞,利用反转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)和Western blotting方法检测转染之后E6和E7的表达,筛选高表达克隆,并采用免疫细胞化学实验观察HPV16 E6和E7对MCF-7细胞中MMP-9蛋白表达的影响。结果转染之后RT-PCR和Western blotting结果显示:4个MCF-7-E6细胞克隆中E6均表达阳性,克隆1中E6 mRNA和蛋白的表达水平均显著高于其他3个阳性克隆(P均<0.05);4个MCF-7-E7细胞克隆中E7均表达阳性,克隆4中E7 mRNA和蛋白的表达水平均显著高于其他3个阳性克隆(P均<0.05);而MCF-7-vect和MCF-7亲本细胞克隆中HPV16 E6和E7的表达均为阴性;免疫细胞化学结果显示:与MCF-7亲本细胞和MCF-7-vect细胞相比,MCF-7-E6细胞和MCF-7-E7细胞中MMP-9蛋白的表达均明显增高(P均<0.05)。结论 HPV16 E6和E7稳定高表达可以促进MCF-7细胞中MMP-9蛋白的表达。     

HPV16 E6/E7融合基因真核表达载体的构建

目的构建pEGFP-N1-E6/E7融合基因真核表达载体。方法应用聚合酶链反应技术(polymerasechain reaction,PCR)从SiHa细胞中扩增出人类乳头瘤病毒16型(HPV16)E6/E7基因全长片段,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1上。结果获得了包含全长阅读框架的HPV16E6/E7基因,并成功克隆到真核表达载体中。结论成功构建了pEGFP-N1-E6/E7融合基因真核表达载体。     

宫颈腺癌细胞中HPV18-E7与上皮间质转化的关系研究

目 的:探究宫颈腺癌细胞中HPV18-E7与上皮间质化(EMT)之间的关系。方法: 针对HPV18-E7的siRNA转染入人宫颈腺癌HeLa细胞,观察细胞形态变化,并运用Realtime PCR技术、免疫印迹实验和细胞免疫荧光染色实验在mRNA水平和蛋白水平检测E7、EMT相关的标记因子的表达及定位变化;应用细胞划痕愈合实验及Transwell细胞体外侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果: 特异性沉默HPV18-E7表达后HeLa-siE7细胞间连接变得疏松,细胞中E7与间质性标记物的mRNA及蛋白表达水平较对照组细胞显著下降,上皮性标记因子较对照组细胞明显增加（P<0.01）;随着HeLa细胞E7表达的下调,E-cadherin在细胞膜上的表达增加,间质性标记因子在细胞质内的表达随之下降。HeLa-siE7细胞迁移及侵袭能力明显低于对照组（P<0.01）;沉默HPV18-E7表达的HeLa细胞其增殖能力也明显减弱。结论:宫颈腺癌细胞中HPV18-E7能够引起EMT发生,促进肿瘤发生侵袭转移。     

雌二醇促进正常宫颈上皮永生化细胞系End1/E6E7增殖的研究

[目的 ]研究在 17- β -E2 作用下正常宫颈上皮永生化细胞End1/E6E7的生长增殖和HPV16 /E6E7基因、ERβ表达的变化 ,探讨雌激素及HPV与ERβ在宫颈上皮病变发展过程中的作用。[方法 ]选取ERα(- ) /ERβ( )的正常宫颈上皮永生化细胞系End1/E6E7细胞 ,应用MTT比色实验及流式细胞术研究 17- β -E2 对其生长与增殖的调控作用 ;应用RT -PCR方法半定量研究 17- β -E2 对该细胞中HPV16 /E6E7基因及ERβ基因表达的影响。 [结果 ]随 17- β -E2 浓度增加 ,倍增时间缩短 ,MTT吸光度值增高 (P =0 .0 4 5 ) ,细胞周期G0 、G1期比例下降 ,G2 、M及S期比例上升 (P =0 .0 0 2 ) ;HPV16 /E6E7mRNA表达增强 (P =0 .0 19) ;ERβmRNA表达无明显改变 (P =1.0 0 )。 [结论 ]雌激素可能通过ERβ以外的途径促进HPV16 /E6E7基因的表达 ,进而促进永生化宫颈上皮的增殖生长。     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞侵袭表型和VEGF表达的影响

目的 探讨特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞侵袭表型和VEGF表达的影响。方法 以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,分别为CaSKi-R和CaSKi-P。测定CaSKi,CaSKi-R和CaSKi-P 3种细胞的生长曲线、软琼脂克隆形成率和裸鼠体内成瘤性,RT-PCR检测3种细胞中VEGF的表达。结果 CaSKi、CaSKi-P细胞生长速率和软琼脂克隆形成率相近,CaSKi-R细胞的生长速度和软琼脂克隆形成率明显降低。CaSKi 、CaSKi-P致瘤性无显著差异,而CaSKi-R致瘤性显著低于CaSKi(P<0.05)。RT-PCR检测CaSKi-R细胞的VEGF mRNA的表达水平明显低于CaSKi、CaSKi-P细胞的表达,而后者的VEGF mRNA的表达水平相近。结论 特异性抗HPV16E6核酶的导入降低了宫颈癌CaSKi细胞的增殖和侵袭表型,可能与宫颈癌CaSKi细胞内VEGF的表达下降有关。     

稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆的建立

目的构建针对HPV16 E6基因的逆转录病毒载体，感染HPV16阳性宫颈癌细胞，筛选稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆。方法采用DNA重组技术构建表达靶向HPV16E6基因的pSUPER．retro RNAi逆转录病毒载体，脂质体法将逆转录病毒载体转染人包装细胞PA317，G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆，收集病毒上清，感染靶细胞SiHa，G418筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆，RTPCR检测细胞中E6 mRNA表达，细胞增殖实验检测细胞增殖力。结果获及稳定产生逆转录病毒的细胞克隆，病毒感染靶细胞SiHa后，筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆，RTPCR示HPV16 E6 mRNA表达受到抑制。细胞增殖实验示克隆细胞增殖率明显下降。结论成功建立稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆，特异性的siRNA能抑制细胞生长、HPV16 E6 mRNA表达，HPV16 E6 siRNA可能成为治疗宫颈癌的一种新方法。     

乳腺癌细胞中E1AF,MMP-1和MMP-9的表达及其相关性

目的 探讨雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌细胞MCF-7和雌激素受体阴性(ER-)乳腺癌细胞MDA-MB-231及MDA-MB-435s中E1AF,MMP-1和MMP-9表达情况及相关性.方法 应用免疫细胞化学技术检测3种不同乳腺癌细胞中MMP-9的表达,采用RT-PCR方法检测细胞株中E1AF,MMP-1及其mRNA表达.结果 ER(-)乳腺癌细胞MDA-MB-231中E1AF基因、MMP-1及其mRNA的表达水平与MMP-9的表达高于ER(+)乳腺癌细胞MCF-7和ER(-)乳腺癌细胞MDA-MB-435s.结论 乳腺癌细胞中E1AF的表达与MMP-1,MMP-9的表达存在相关性,E1AF可能是乳腺癌侵袭转移的重要因子.     

E1A抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖及其分子机制

目的：本研究将E1A基因转染HER-2表达阳性的乳腺癌细胞系MCF-7，并研究E1A对MCF-7细胞增殖的抑制作用及其分子机制。方法：利用基因转染技术检测MCF-7细胞中E1A的表达，RT-PCR和Western杂交检测E1A基因对HER-2mRNA和蛋白表达水平的调控，MTT法检测E1A对MCF-7细胞增殖的抑制作用，软琼脂集落法检测E1A对MCF-7细胞集落形成的影响，并利用流式细胞术检测E1A对MCF-7细胞凋亡的调控。结果：MCF-7细胞无内源性的E1A表达，E1A在MCF-7细胞内的表达显著性地降低了细胞中HER-2mRNA和蛋白表达水平，诱导MCF-7细胞发生凋亡。细胞增殖曲线显示E1A基因显著性抑制MCF-7细胞增殖和细胞集落形成能力。结论：E1A基因能降低人乳腺癌细胞MCF-7的HER-2表达，诱导细胞发生凋亡，从而抑制细胞的增殖和细胞集落形成能力。     

靶向ATP6L的RNA干扰抑制乳腺癌细胞的体外侵袭能力

目的:通过靶向ATP6L的RNA干扰抑制质子泵的功能,检测MCF-7/ADR乳腺癌细胞的体外侵袭情况.方法:采用有效ATP6L干扰片段及干扰对照分别转染MCF-7/ADR细胞,通过荧光分光光度计检测BCECF与细胞分泌上清孵育后在不同激发光激发后发射的荧光量;用实时荧光定量PCR检测细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达情况;用明胶酶谱方法检测细胞分泌上清中的MMP-2活性;用细胞侵袭实验(Transwell) 检测细胞体外侵袭能力.结果:在MCF-7/ADR细胞中,下调ATP6L基因的表达可以使细胞的泌H+能力减弱;细胞中MMP-2表达水平无变化;细胞分泌上清中的MMP-2活性减弱;细胞的体外侵袭能力下降.结论:靶向ATP6L的RNA干扰可抑制质子泵的功能,从而抑制MCF-7/ADR乳腺癌细胞的体外侵袭能力.     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞增殖和侵袭力的影响

目的 研究特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞增殖和侵袭能力的影响。方法 以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,分别为CaSKi-R和CaSKi-P。观察细胞的生长状态,测定CaSKi,CaSKi-R和CaSKi-P3种细胞的生长曲线、软琼脂克隆形成率、细胞侵袭力实验、裸鼠体内致瘤性,以及RT-PCR检测细胞中COX-2、血管内皮生长因子(VEGF)的表达,同时,免疫组化检测3种细胞COX-2、VEGF抗原表达,分析特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞增殖和侵袭力的影响。结果 CaSKi、CaSKi-P细胞生长速率、软琼脂克隆形成率、致瘤性和侵袭力相近,而CaSKi-R细胞的细胞生长速率、软琼脂克隆形成率、致瘤性和侵袭力与以上两种细胞相比却明显降低。RT-PCR检测CaSKi-R细胞的COX-2、VEGF表达水平也低于CaSKi、CaSKi-P细胞的表达。细胞免疫组化测定CaSKi、CaSKi-P和CaSKi-R细胞都有COX-2、VEGF抗原表达,而CaSKi-R细胞的抗原染色程度较弱。结论 特异性抗HPV16E6核酶的导入降低了宫颈癌CaSKi细胞的增殖和侵袭表型,可能与宫颈癌CaSKi细胞内COX-2、VEGF的表达水平降低有关。     

二烯丙基二硫下调p38活性抑制乳腺癌MCF-7细胞侵袭和转移

目的探讨大蒜提取物二烯丙基二硫(DADS)对乳腺癌MCF-7 细胞侵袭转移的作用及其机制。方法采用不同浓度（0, 100,200,400 μmol/L）DADS处理MCF-7人乳腺癌细胞24 h,Transwell侵袭实验检测DADS对细胞侵袭的作用,划痕愈合实验 观察DADS对细胞迁移的改变,Western blotting 检测细胞中上皮标志蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）、间质标志蛋白波形蛋白 （Vimentin）和基质金属蛋白MMP-9的表达和p38活性;TGF-β1上调p-p38表达后上述作用的变化。结果Transwell和划痕愈 合实验发现DADS呈浓度依赖性抑制MCF-7 细胞的侵袭和迁移能力,Western blotting 结果表明DADS可抑制Vimentin 和 MMP-9 的蛋白表达,上调E-cadherin 的表达而下调p38 活性;TGF-β1 可上调p-p38 和MMP-9 表达,明显抵消DADS对MCF-7 细胞的抑制效果。结论DADS可下调p38活性,抑制MCF-7细胞的侵袭转移。     

人乳头瘤病毒早期癌蛋白E6/E7稳定表达细胞系的构建及其对Rab12表达的影响

目的 探究人乳头瘤病毒(HPV)编码的早期癌蛋白E6/E7对小GTP酶蛋白Rab12表达的影响。 方法 利用逆转录病毒包装系统获得含pBabe-Vector质粒和pBabe-16E7质粒的高滴度病毒颗粒,感染细胞,并用嘌呤霉素筛选获得稳定表达HPV16E7的UMSCC 10A-16E7细胞系,Western blotting检测E7相关蛋白p53和E2F1的表达变化,比较UMSCC 10A-Vector细胞系和UMSCC 10A-16E7细胞系的Rab12蛋白表达水平。用同样方法在HaCaT、RPE1细胞系中进一步验证。用siRNA干扰SiHa、Caski细胞(HPV-16阳性的宫颈癌细胞)中16E6/E7及HeLa细胞(HPV-18阳性的宫颈癌细胞)中18E6/E7的表达,通过Western blotting比较siRNA干扰前后E6和E7相关蛋白(E2F1、p53和Rab12)的表达差异。 结果 利用逆转录病毒包装系统成功构建稳定表达的细胞系,过表达E6/E7的细胞系中Rab12表达升高,干扰E6/E7的细胞系中Rab12的表达降低。 结论 HPV编码的早期癌蛋白E6/E7可调控Rab12的表达。     

Pokemon对乳腺癌MCF-7细胞侵袭迁移能力的影响

目的 建立稳定表达pokemon乳腺癌细胞系,并观察pokemon对乳腺癌细胞系MCF-7侵袭转移能力的影响. 方法 构建表达pokemon慢病毒载体,将Pokemon表达慢病毒载体转染MCF-7细胞,通过Westernblot方法检测稳定性表达pokemon MCF-7细胞中Pokemon-GFP融合蛋白的表达情况,应用Transwell试验及划痕实验观察pokemon的高表达对MCF-7细胞侵袭迁移能力的影响. 结果 成功建立稳定表达pokemon的MCF-7细胞系,pokemon可抑制MCF-7细胞侵袭能力. 结论 Pokemon可抑制MCF-7细胞侵袭能力.     

核糖核酸酶抑制因子过表达抑制B16细胞的侵袭和转移

目的 构建人核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)真核表达载体,检测其对B16细胞侵袭和转移能力的影响.方法 提取人7703细胞中的总RNA,RT-PCR特异性扩增RI编码区序列,利用基因重组技术将其克隆到载体pIRES2-EGFP中,稳定转染B16细胞以后,经G418筛选出阳性克隆.根据转染质粒不同分别命名为B16细胞组(未转染组)、空质粒对照组(pIRES2 -EGFP组)和实验组(pIRES2-EGFP-RI组).RT-PCR检测B16细胞中RI mRNA水平的表达,并通过Western blot和细胞免疫化学检测RI蛋白水平的表达;HE染色观察细胞形态的改变,黏附实验、划痕实验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化;Western blot检测MMP-2、MMP-9和nm23-H1以及E-cadherin的表达;建立C57BL/6小鼠肺转移模型,观察肺上肿瘤转移灶的变化.结果 酶切和测序结果证明重组质粒构建成功,实验组细胞RI的mRNA和蛋白的表达较B16细胞组和空质粒对照组显著升高(P＜0.05);HE染色结果显示,细胞铺展良好,核质比减小;转染pIRES2-EGFP-RI质粒的实验组细胞的黏附、迁移及侵袭能力明显降低(P＜0.05);与两对照组相比,实验组细胞MMP-2和MMP-9的表达水平明显降低,nm23-H1和E-cadherin的表达水平明显升高(P＜0.05);动物实验结果显示与对照组相比,实验组的肺转移灶明显减少.结论 成功构建的RI真核表达质粒能升高RI基因及蛋白水平的表达,显著抑制了B16细胞的转移和侵袭能力.     

人乳头瘤病毒16型E6/E7基因对人角质形成细胞增殖及其调控因子的影响

目的 研究人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６型Ｅ６／Ｅ７基因对人角质形成细胞增殖及细胞周期调控因子ｐ５３,ｐＲｂ的影响。方法 Ｌｏｐｏｆｅｔａｍｉｎｅ介导法进行 染,筛选阳性克隆,免疫荧光染色检测ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７在转染细胞内的表达,流式细胞仪分析细胞周期变化,免疫印迹分析ｐ５３,ｐＲｂ表达情况。结果 免疫荧光染色检测见转染细胞内有ＨＰＶＥ６／Ｅ７表达,汉式细胞仪显示转染细胞Ｇ１期细胞为４９．２％比正常     

人乳头瘤病毒E6蛋白通过上调氯离子蛋白通道5的表达促进宫颈癌细胞迁移

目的: 探讨人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）E6蛋白与氯离子通道蛋白5（chloride voltage gated channel 5,CLCN5）之间的关系以及CLCN5对宫颈癌细胞迁移的影响。方法: 采用RNA干扰技术敲低HPV E6基因,实时荧光定量PCR（RT qPCR）和蛋白质印迹法检测敲低HPV E6后宫颈癌HeLa细胞中CLCN5 mRNA及蛋白的表达水平。通过PCR扩增CLCN5基因片段,并将其克隆至表达载体pCDNA3.1 3×Flag（简称pCDNA3.1）质粒中,构建重组质粒pCDNA3.1 CLCN5。将目的质粒pCDNA3.1 CLCN5及其对照pCDNA3.1质粒分别转染宫颈癌HeLa细胞,蛋白质印迹法检测CLCN5蛋白的表达。Transwell迁移实验检测过表达CLCN5对宫颈癌HeLa细胞迁移的影响。同时,将CLCN5的小干扰RNA及其阴性对照分别转染宫颈癌HeLa细胞,Transwell迁移实验检测敲低CLCN5对宫颈癌HeLa细胞迁移的影响。结果： RT qPCR和蛋白质印迹检测结果显示,敲低HPV E6可显著降低CLCN5的mRNA和蛋白表达水平。质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果证实重组质粒pCDNA3.1 CLCN5构建成功。蛋白质印迹检测结果显示CLCN5蛋白在宫颈癌HeLa细胞中被有效过表达或敲低。Transwell迁移实验结果表明,过表达CLCN5可促进宫颈癌细胞的迁移,敲低CLCN5可抑制宫颈癌细胞的迁移。 结论： HPV E6蛋白通过上调CLCN5的表达促进宫颈癌细胞迁移。     

人乳头瘤病毒16L1-E5表达质粒的构建及其蛋白表达

目的构建人乳头瘤病毒16L1-E5的原核表达质粒,并进行表达融合蛋白,为下一步探讨该蛋白是否能作为疫苗的研究作准备。方法以本室已构建好的阳性质粒pET32（＋）／HPV16E5为模板,PCR获得E5基因,经SalI和NotI双酶切插入已构建好的pGEX4T-1／HPV16L1,通过筛选获得正确的阳性克隆pGEX4T-1／HPV16L1-E5。pGEX4T-1／HPV16L1-E5转化入BL21感受态细胞,经IPTG诱导进行目的蛋白的表达,通过测定不同时间、不同IPTG浓度和不同温度时目的蛋白表达情况,获得蛋白表达的最佳条件,SDS-PAGE和Westernblot检测蛋白表达。结果成功构建了质粒pGEX4T-1／HPV16L1-E5,在1mmol／L IPTG、34℃、4h诱导获得最大量的目的蛋白表达。结论成功构建的pGEX4T-1／HPV16L1-E5质粒能表达出目的蛋白,为进一步研究目的蛋白功能打下了坚实的基础。     

人乳头瘤病毒16型E6蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的人乳头瘤病毒16型早期蛋白6真核表达载体pcDNA3．1（-），E6，为研究HPV16 E6蛋白在细胞永生化作用中的机制奠定实验基础。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增E6基因。将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接，经蓝白斑筛选、双酶切鉴定及序列分析后，亚克隆至pcDNA3．1（-）真核表达载体中；阳性克隆经双酶切鉴定后转染RAW264．7巨噬细胞，Western blotting鉴定其在RAW264，7细胞中的表达。结果重组载体经酶切、PCR及测序证明插入片断序列正确无误，转染RAW264．7细胞后可在细胞中表达HPV16E6蛋白。结论成功构建的HPV16E6真核表达载体pcDNA3，1（-）／E6能在RAW264．7细胞中表达E6蛋白。