低氧对人骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的 探讨二氯化钴(CoCl2)诱导的化学性低氧对人骨髓间充质干细胞(hBMSC)增殖的影响.方法 采用密度梯度离心法分离、培养hBMSC;用流式细胞仪检测其表面标志物;用CoCl2建立化学性缺氧模型,分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞仪检测hBMSC在不同CoCl2浓度(0、100、150、300 μmol/L)和不同时间(0,12 h及1、2、4、6、7 d)的增殖情况,0 μmol/L CoCl2组为常氧组,后3个浓度组为低氧组.结果 化学缺氧12 h内,hBMSC增殖被抑制;1、2、4 d时各低氧组细胞增殖均高于常氧组,但300 μmol/L CoCl2组与常氧组比差异无统计学意义(P＞0.05);而100μmol/L CoCl2组(0.139±0.003、0.178±0.005、0.224±0.005)和150 μmol/L CoCl2组(0.202±0.020、0.224±0.019、0.263±0.004)增殖明显高于常氧组(0.134±0.005、0.167±0.004、0.206±0.005),其中150μmol/L CoCl2组1 d时增殖最显著(均P＜0.05).6 d时100、150 μmol/LCoCl2组细胞增殖(0.258±0.020、0.264±0.008)仍高于常氧组(0.248±0.004),但优势逐渐减弱(P＜0.05).7 d时这种低氧促增殖的效应消失.结论 CoCl2诱导的化学性缺氧可以促进hBMSC增殖.     

低氧增强骨髓间充质干细胞增殖维持分化潜能

目的观察低氧增强人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)体外增殖并维持其多向分化潜能的作用。方法分离10例骨髓血标本BMMSCs,分别进行低氧(低氧组)及常氧(常氧组)培养,观察BMMSCs的形态、增殖能力及成骨、成脂分化能力。结果低氧组BMMSCs保持其长梭形,鱼群样分布,增长状态良好,常氧组BMMSCs形态呈多角形或扁平状,低氧组BMMSCs数量及生长速率较常氧组增加(P0.05),且低氧组BMMSCs具有成骨、成脂分化能力。结论低氧能促进BMMSCs的体外增殖且维持其多向分化潜能。     

六味地黄丸对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的:观察不同浓度六味地黄丸水提液对体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的影响.方法:应用全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠BMSCs,并传代扩增,倒置显微镜进行细胞形态学观察,免疫组化检测细胞表面抗原鉴定其表面标志.将BMSCs分为对照组及不同浓度六味地黄丸干预组,采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)观察其增殖情况.结果:采用全骨髓贴壁法获取的BMSCs形态呈长梭形,呈集落样生长;免疫细胞化学鉴定,CD44、CD29阳性,CD34阴性.MTT检测结果显示,与空白对照组相比,相当于生药含量4～0.25mg/ml浓度范围内,六味地黄丸水提液干预24h后,干预组吸光度均增高(P<0.05),其中1mg/ml浓度干预组吸光度升高最明显(P<0.01).结论:所培养的大鼠骨髓细胞在表型表达和细胞形态上具备MSC特征.在一定浓度范围内,六味地黄丸水提液可以提高BMSCs的体外增殖能力.     

孤啡肽对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的 观察孤啡肽(OFQ)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)增殖的影响.方法 Percoll法分离大鼠骨髓间充质干细胞,传2代后分别在含有浓度为0、10-13、10-12、10-11、10-10、10-9、10-8和10-7 mol/L的OFQ培养基中继续培养,MTT法测定细胞活性.结果 当OFQ浓度小于10-11 mol/L时,OD值随着浓度的增大而增大,而当OFQ浓度大于10-11mol/L时,OD值随着浓度的增大而减小.结论 适当浓度的孤啡肽可促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖.     

低氧对人骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响

目的 探讨低氧对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向神经细胞分化的影响.方法 将第2代hBM-SCs进行传代、纯化,取第4代hBMSCs进行流式细胞仪检测鉴定;以含1％ FBS的α-MEM为基础诱导培养基,根据处理条件不同分为4组:常氧对照组、低氧对照组(3％氧浓度)、常氧诱导组[添加20 ng/mL表皮生长因子(E GF)及20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)]、低氧诱导组(3％氧浓度下添加20 ng/mL EGF及20 ng/mL bFGF).连续诱导3d后,采用RT-PCR及Western blot技术检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白2(MAP-2)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在基因及蛋白水平表达变化.结果 第4代hBMSCs流式鉴定结果示:骨髓基质标志CD105、CD90、CD29表达分别为95.8％、98.2％、95.1％,而造血细胞标志CD19表达为0.2％;与常氧对照组比较,低氧对照组NSE、MAP-2、GFAP在基因及蛋白水平表达均无明显改变(P＞0.05),而常氧诱导组及低氧诱导组相应表达均升高(P＜0.05),且低氧诱导组表达高于常氧诱导组(P＜0.05).结论 低氧促进EGF联合bFGF对hBMSCs向神经元细胞及神经胶质细胞分化的诱导作用.     

rno-miRNA-133b对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的:探讨miRNA-133b对骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖及凋亡的影响,分析miRNA-133b影响BMSCs增殖的可能机制。方法:体外全骨髓贴壁法原代培养大鼠BMSCs,取生长良好的第2代细胞作为本实验的研究对象。利用siPORT NeoFX转染rno-miRNA-133b模拟物(mimic)、抑制剂(inhibitor)及其各自相对应的阴性对照(NC)。用带GFP荧光的miRNA和TaqManqRT-PCR验证转染效率,采用MTS法和Brdu细胞增殖比色法检测细胞增殖,TUNEL免疫荧光分析细胞凋亡。利用生物信息学方法预测miRNA-133b的靶点基因,并对其靶点基因进行基因功能分析。结果:①利用siPORT NeoFX转染大鼠BMSCs能有效实现细胞中miRNA-133b的过表达和抑制。②过表达miRNA-133b能明显促进BMSCs的增殖(P<0.05),而抑制miRNA-133b能明显减少BMSCs的增殖(P<0.05)。③miRNA-133b对BMSCs的凋亡无明显作用(P>0.05)。④生物信息学分析结果提示miRNA-133b的靶点中存在部分调节细胞增殖的基因位点。结论:miRNA-133b对BMSCs的增殖能力存在促进作用,其可能通过负调控多种增殖调节靶基因发挥作用。     

三维立体培养SD大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的 建立三维立体培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的方法.方法 分离SD大鼠胫骨、股骨,冲洗骨髓腔,通过密度梯度离心并结合贴壁法培养BMSCs,流式细胞仪检测其生长周期,电子显微镜观察其内部结构,免疫细胞化学法进行细胞表面抗原标志物鉴定.后将其接种到细胞外基质(extracellular matrix,ECM)胶中,加入DMEM-F12细胞培养液进行三维立体培养.结果 培养的细胞呈梭形,成纤维细胞样,单核,增殖能力强.流式细胞术显示93.10%细胞处于G0～G1期.透射电镜结果显示细胞核质比例较大,核仁大而明显,细胞表面有较多微绒毛,细胞质细胞器丰富,表现出未分化细胞的特征.免疫组织化学结果显示细胞表达波形蛋白(vimentin)、纤维连接蛋白(fibronectin),不表达角蛋白(keratin).BMSCs在ECM胶中生长良好.结论 分离、培养的细胞为骨髓BMSCs,在三维培养体系中生长良好.     

鱼卵小分子多肽对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖作用的影响

目的观察不同浓度的鱼卵小分子多肽对SD大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)增殖作用的影响。方法分离、培养SD大鼠BM-MSCs,并采用流式细胞仪进行鉴定。选取第3代细胞进行观察和检测。实验组选取25、50、75、100、125、150、200、250、300μg/ml 9个多肽浓度,对照组加入不含小分子多肽的DMEM完全培养基。各组孵育24 h后采用MTT法检测其细胞增殖情况,确定其最佳作用剂量。在最佳作用量下,于12、16、20、24、32、40、48 h 7个时间点观察鱼卵小分子多肽对SD大鼠BM-MSCs增殖的情况。并采用流式分析鱼卵小分子多肽对BM-MSCs细胞周期的影响。结果鱼卵小分子多肽对BM-MSCs的促增殖作用的最佳浓度为100μg/ml,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。流式分析显示鱼卵小分子多肽可提高SD大鼠BM-MSCs非G1/G0期细胞比例。结论鱼卵小分子多肽对SD大鼠BM-MSCs有促增殖作用,最佳作用浓度为100μg/ml。     

低氧对人骨髓间充质干细胞向胆碱能神经元分化的影响

【目的】观察低氧对体外培养的人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）向胆碱能神经元分化的影响。【方法】将对照组和常氧分化组hBMSCs置于常氧（20％O2）环境中培养,低氧分化组细胞置于低氧（3％O2）环境中。采用免疫细胞化学法和高效液相色谱-电化学法,分别检测胆碱能神经元的数量和诱导分化后乙酰胆碱（ACh）的含量。【结果】对照组未见胆碱乙酰化酶（ChAT）阳性神经元,低氧分化组ChAT阳性神经元数量明显增多,约为常氧分化组的4倍（P〈0．01）,并且该组诱导分化后的细胞合成的ACh含量也高于常氧分化组（P〈0．05）。【结论】低氧可促进hBMSCs向胆碱能神经元方向分化,这为临床应用hBMSCs治疗阿尔茨海默病提供了新的思路。     

杜仲对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

【目的】探讨杜仲对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的影响。【方法】分别取10日龄SD大鼠胫骨、股骨的骨髓,过滤离心后将所得BMSCs进行体外单层培养、扩增,采用DMEM培养基,37℃、体积分数5%CO2条件培养。在细胞达到80%～90%融合时,使用2.5 g/L胰酶消化传代。将传代细胞分别置于空白血清培养液(对照组)、杜仲水提取物含药血清及杜仲醇提取物含药血清培养液进行培养,观察细胞在3种条件下的形态、贴壁生长、增殖、集落等情况,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法绘制生长曲线,比较3种培养条件下达到100%融合的时间。【结果】杜仲水提取物组、杜仲醇提取物组对大鼠BMSCs增殖的影响显著高于空白血清对照组(P<0.05),且杜仲醇提取物组作用优于杜仲水提取物组(P<0.05)。【结论】杜仲对大鼠BMSCs增殖具有一定促进作用。     

Effect of Electromagnetic Fields on Proliferation and Differentiation of Cultured Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

Previous clinical observations and animal ex periments showed that EMFs could stimulate newbone formation of the fractures and increase thebone mineral density[1], but the manner in whichEMFs influence the behavior of bone remains poor ly understood. Recent studies[2] found that signaltransduction system plays an important role in thebiological effect of EMFs. Intracellular cAMP wasan important second messenger in signal transduc tion pathway. The cellular proliferation …     

成鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养和向神经元样细胞分化的能力.方法:利用Percoll分离液(1.073×103g/L)梯度分离成年大鼠MSCs,采用3种不同的方法对其诱导分化,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、星形胶质细胞特异性标志(GFAP)和神经前体细胞(Nestin)的表达.结果:成功进行了成年大鼠MSCs的原代和传代培养,3种诱导方法均能使MSCs分化为神经元样细胞,都能表达NSE、NF和Nestin,而不表达GFAP.结论:MSCs能在体外分离、扩增、传代,并能向非间充类细胞分化.     

小鼠骨髓间质干细胞的生物学特点及分化潜能鉴定

目的：建立一种体外分离，培养和鉴定小鼠骨髓间质干细胞的方法，探讨体外培养中间质干细胞的一些生物学特点，为利用MSCs促进创伤修复提供实验基础，方法：分离5－6周龄的小鼠胫骨，股骨，用预冷的IMDM培养基冲洗出骨髓，经密度梯度离心得到骨髓单个核细胞，接种后12－16d形成意志贴壁的成纤维状细胞，体外多向诱导分化鉴定分离的细胞，用传代的细胞进行生长曲线的测定，观察其接种贴壁率，检测细胞周期和超微结构。结果：体外传代培养的MSCs具有分化形成成骨和成脂细胞的能力；MSCs倍增时间约为38h，传代后12h贴壁达90％以上，细胞周期显示有80％细胞处于G0／G1期，并用电镜照片显示其超微结构。结论：在本实验条件下，体外培养的MSCs具有多向分化潜能,体外生长稳定，传代后的细胞适应性强，增殖较快，超微结构和细胞周期表现出较早期细胞特点，可望用于自体创伤促愈。     

支架荷载的骨髓间充质干细胞的分化实验研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架上向表皮干细胞分化的可行性。方法体外诱导改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架荷载的大鼠骨髓间充质干细胞向表皮干细胞分化,免疫组织化学法检测表皮干细胞标志物CK19和整合素β1的表达。结果诱导液作用2周后,免疫组织化学法检测到改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架荷载的大鼠BMSCs中大量阳性双表达CK19和整合素β1。结论改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架荷载的大鼠BMSCs仍具有向表皮干细胞分化的潜能,此支架具备作为组织工程皮肤支架材料的条件。     

碱性成纤维细胞生长因子对羊骨髓间充质干细胞体外增殖和分化的影响

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外增殖与分化的影响。方法：体外分离培养的羊原代BMSCs分为实验组和对照组,实验组添加bFGF(2 μg•L^-1)于L-DMED培养液中,对照组使用L-DMED常规培养液。分别测定2组BMSCs生长曲线以及碱性磷酸酶（ALP）活性。应用诱导剂对2组细胞进行成骨、成脂肪诱导,分别在显微镜下观察其分化潜能。 结果：单个核细胞接种大约1周成纤维细胞样集落开始出现,2周后形成的集落数量增加,每个集落的体积变大。当第1代BMSCs细胞生长到汇合期时,实验组细胞数是对照组的2.5倍。于第16天实验组ALP活性比对照组明显降低（P＜0.05）。2组BMSCs经成骨诱导培养3周后,经Von Kossa染色,已经成骨的细胞内均可见钙盐沉积;已经成骨的细胞内油红-“O”染色显示,成脂肪诱导培养2周后,2组BMSCs均能分化形成脂肪细胞,2组每高倍视野下脂肪细胞计数差异无显著性（P>0.05）。 结论：bFGF能提高羊BMSCs集落形成数量及扩增效率,并抑制其ALP活性,同时保持了BMSCs向成骨细胞、脂肪细胞的分化潜能。     

大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养及初步鉴定

目的探讨并建立一种简便有效的体外分离纯化及扩增大鼠骨髓间质干细胞的方法,并研究其生物学特性,对其进行初步鉴定,为进一步诱导分化为胃黏膜上皮细胞奠定基础。方法利用贴壁培养法分离纯化SD大鼠骨髓间质干细胞,体外培养,传代扩增,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化,并用免疫组化方法鉴定骨髓间质干细胞表面CD29,CD44,CD34的表达。将加入成骨、成脂肪诱导剂的骨髓间质干细胞体外培养2～3周,观察细胞形态变化,并做油红0染色,鉴定成骨及成脂肪分化的结果。结果原代培养8—10d后可分离得到骨髓间质干细胞,且骨髓间质干细胞体外培养生长状况良好,呈均一的成纤维细胞样,传代周期为3～4d。免疫组化显示90％以上的骨髓间质干细胞CD29、CD44阳性,CD34阴性,且可以将其定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结论利用贴壁培养法可分离培养出大量大鼠骨髓间质干细胞,且此方法简便易行。     

atRA抑制大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化

目的探讨高浓度全反式视黄酸(all-trans retinoic acid,atRA)抑制大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs)向脂肪细胞分化的机制。方法体外分离、培养和诱导大鼠BMSCs;在成脂诱导液中加入0.1、0.5、1.0、5.0μmol/L atRA,光学显微镜下观察细胞形态及油红O染色变化;油红O染色提取法分析不同浓度atRA对BMSCs成脂分化的影响;real-time PCR测定细胞视黄酸受体(RARα、RARγ)、CCAAT增强子结合蛋白α(CEBPα)及过氧化物酶体增殖激活受体γ2(PPARγ2)mRNA水平的变化。结果细胞形态及油红O染色观察发现,在0.1、0.5、1.0、5.0μmol/L atRA作用下大鼠BMSCs向脂肪细胞分化受到抑制,且呈浓度依赖性;油红O染色提取法半定量测定结果显示,随着atRA浓度升高,分化细胞内脂肪含量降低(P<0.01);real-time PCR检测显示与血清组(未加atRA)相比,加入atRA后,大鼠BMSCs的CEBPα和PPARγ2表达显著降低(P<0.05),RARα表达无显著差异[血清组vs 1.0μmol/L atRA组:(0.008 4±0.001 9)vs(0.009 1±0.001 3),P>0.05],但RARγ表达显著增加[血清组vs 1.0μmol/L atRA组:(0.022 6±0.001 2)vs(0.053 1±0.002 3),P<0.01]。结论 0.1、0.5、1.0、5.0μmol/L atRA可抑制大鼠BMSCs向脂肪细胞分化,其机制可能与RARγ的上调及CEBPα、PPARγ2的下调有关。     

褪黑激素体外定向诱导骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨褪黑激素(melatonin,MT)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)不同时段向神经细胞分化的情况。方法:采用细胞培养技术分离培养和纯化大鼠MSCs,以MT为诱导剂诱导大鼠MSCs向神经细胞分化。分别在诱导后3,7,10,14 d以免疫荧光法测定神经干细胞特异性标志(nestin)、神经元细胞特异性标志(neurofilament,NF)和星形胶质细胞特异性标志(GFAP)的表达。结果:MT诱导分化3 d,部分细胞胞体收缩成三角形,有些成为简单的双极或多极细胞。诱导3 d细胞开始表达nestin,7~14 d表达nestin和NF,细胞不表达GFAP。结论:MT可诱导大鼠MSCs分化为神经细胞。     

大鼠骨髓间质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的建立大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)最佳的体外分离培养方法,并研究其基本的生物学特性。方法采用密度梯度离心和贴壁培养两种方法分离大鼠的MSCs,进行形态学观察及增殖生长方面的测定;免疫细胞化学染色鉴定表面标志。结果大鼠MSCs体外培养呈梭形;细胞生长曲线为“S”型;密度梯度离心法原代培养15d达到80%～90%的融合,而改良的直接贴壁法只需要5d;细胞周期显示G0/G1期88.29%;免疫细胞化学染色显示CD44表达阳性,CD34、CD45为阴性。结论两种方法均可获得骨髓间质干细胞,但贴壁培养法操作更简便、快速,具有对细胞活性影响较小,更利于其贴壁和增殖的优点。MSCs体外培养条件下生长性状稳定,适于做组织工程的种子细胞。     

碲化镉量子点对大鼠骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化潜能的影响

目的：探讨碲化镉量子点（CdTe QDs）对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖与成骨细胞分化潜能的影响,阐明CdTe QDs的体外毒性,并为CdTe QDs 作为BMSCs体外活细胞标记应用提供实验依据。 方法：荧光光谱法检测CdTe QDs 在DMEM/F-12培养液中的分散情况。大鼠原代培养BMSCs,经不同浓度CdTe QDs（0、0.195 3、0.390 6、0.781 3、1.562 5、3.125 0、6.250 0、12.500 0、25.000 0和50.000 0 nmol·L^-1）作用24 h后,MTT法检测CdTe QDs
对BMSCs增殖的影响。体外地塞米松、甘油磷酸钠和维生素C诱导BMSCs向成骨细胞分化茜素红染色显示钙结节。计算半数增殖抑制浓度（IP50）和成骨半数分化抑制浓度（ID50）。结果：荧光光谱法检测,CdTe QDs 在DMEM/F-12培养液中分散良好,未发生聚合。随着BMSCs暴露于CdTe QDs的时间延长,其细胞的生长逐渐减慢,暴露24、48和72 h的回归系数分别为－23.96,－29.61和－24.30（P<0.05）, IP50分别为7.25、1.63和0.67 nmol?L-1。随着CdTe QDs浓度的增加,BMSCs分化成的成骨细胞逐渐减少,暴露48 h的成骨分化回归系数为－56.15（P<0.05）, ID50为0.0412 nmol·L^-1,增殖分化抑制比（IP50/ ID50）= 39.56。结论：在一定浓度范围内（0.195 3、0.390 6、0.781 3、1.562 5、3.125 0、6.250 0、12.500 0、25.000 0和50.000 0 nmol?L-1）,CdTe QDs抑制BMSCs的增殖;在一定浓度范围内（0.012 2、0.024 4、0.048 8、0.097 6和0.195 3 nmol·L^-1,CdTe QDs抑制BMSCs向成骨细胞的分化。在使用CdTe QDs作为活细胞标记物时,需要考虑其对细胞增殖及分化的影响。