重组人α2a型干扰素单克隆抗体的研制、特性鉴定及初步应用

应用常规方法建立了5株稳定分泌抗重组人α2a 型干扰素单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系1B8、2B6、3F1、4G5和5G10,并对其免疫学特性进行了较系统的鉴定.5株单抗均为 IgG1,特异性强,与重组人α1 型、γ型干扰素以及受体菌菌体蛋白成分无交叉反应.间接 ELISA 测定小鼠腹水单抗效价1:320,000～1:10,240,000,其中3F1和5G10单抗对重组人α2a 型干扰素具中和活性(中和效价均为1:10,000)。竞争结合 ELISA 证实5株单抗针对3种不同表位。用3F1和5G10单抗建立的夹心 ELISA 能检测到60pg/ml的重组人α2a 和α2b 型干扰素。3F1单抗用于制备亲和层析柱纯化重组人α2a 型干扰素结果与进口单抗NK2相当。     

TNF单克隆抗体的研制及其在内毒素休克中的作用

6株抗重组人肿瘤坏死因子单克隆抗体,其中5株是IgG1,1株是IgG2a。单抗AT-1、2、3对nhTNF-α具有较高中和活性,AT-4、5、6却未表现出中和活性或很弱。同时单抗AT-1、2、3还可以中和天然人和小鼠的TNF-α。这6株单抗均可以与nhTNF-α发生免疫沉淀反应,虽然其中AT-6较其他5株为弱。特异性实验表明,这6株单抗均不能中和人的TNF-β和人IFN,而、其中AT-1,2和AT-4,5,对人TNF-β具有免疫沉淀活性,但AT-3和AT-6却没有。这6株单抗均不与IFN发生免疫沉淀反应。肽_1和肽_2分别是nhTNF-α分子的一部分,其中肽_1是nhTNF-α分子的中间部分,肽_2是nhTNF-α分子的C末端部分,单抗AT-5与肽_1和肽_2均能发生反应,但另外5株却不能。体内实验表明,具有高中和活性和高免疫沉淀活性的单抗AT-1能较好地保护小鼠免遭致死剂量的LPS攻击,而具有高免疫沉淀活性,但中和活性很弱的AT-4保护作用很差。     

运用蛋白质芯片技术鉴定干扰素的亚型

目的：采用自制的6株干扰素单克隆抗体，在本实验室建立的金基底蛋白质芯片平台上对IFN-α1b、IFN-α2a、IFN-α2b、IFN-β及IFN-γ进行鉴定。方法：金基底蛋白质芯片用已知亚型的IFN半成品包被，封闭后与自制的6株干扰素单抗反应，再与Cy3-羊抗鼠IgG反应，反应后GenePix4100A芯片扫描仪扫描读数，将结果与ELISA法、Western blot法比较。同样方法检测IFN成品。结果：金基底蛋白质芯片检测技术结果表明，该平台鉴定干扰素的亚型具有特异性，与ELISA法、Western blot法能得出一致的结论。结论：运用本实验室建立的蛋白质芯片平台可以对干扰素的亚型进行鉴定，具有高通量，操作简单，样品用量少，重复性强等优点。     

特异性IFN-α2b多克隆抗体的制备及鉴定

干扰素a家族至少有15个亚型，彼此之间有78％-98％的同源性，尤其是WNα-1和IFNα-22亚型之间的差异更小。以不同亚型的干扰素制备的多克隆抗体与抗原之间有很多的交叉反应。本文利用自行设计的亲和层析组合柱从复杂的多克隆抗体中除去与其他干扰素有交叉反应的抗体，得到针对IFNα-2b的特异性抗体。这种纯化IFNα-2b多克隆抗体的方法非常简便快捷。     

α干扰素中和抗体对慢性病毒性肝炎疗效的影响

目的　探讨慢性病毒性肝炎患者中α干扰素(αIFN)中和抗体(NA)的产生及其对干扰素疗效的影响。方法　采用抗病毒中和生物测定法检测了30名健康人及116例经三种亚型αIFN治疗的慢性病毒性肝炎患者血清中的NA。结果　健康人及IFN治疗前的患者中未检出NA,治疗后共20例(172%)NA阳性。NA在IFN治疗后2个月即可出现,6个月达高峰(20例全部阳性),至9个月后则有所下降。其中αIFN2a、αIFN2b和αIFN1b治疗组的NA阳性率分别为346%、132%和115%。NA阳性组、高滴度组的病毒阴转率明显低于NA阴性和低滴度组(P<0.01;P<0.05)。而NA阳性组病毒复发率则显著高于NA阴性组(P<0.05)。结论　αIFN治疗后可产生NA,且具有一定的时间规律性。不同亚型的αIFN其NA的产生率不同。NA可中和IFN的活性而影响干扰素的抗病毒疗效。     

人类疱疹病毒6型刺激人脐带血单个核细胞产生α-干扰素的研究

用生物活性法检测人类疱疹病毒6型(HHV-6)GS株和CN8南京地方株感染的人脐带血单个核细胞培养上清中干扰素(IFN),结果表明感染后24h即可检出,48～72h达到峰值,以后逐渐下降。用IFN-α、β、γ的单抗分别处理感染细胞上清,仅IFN-α的单抗可以显著中和其干扰素活性。双向琼脂扩散试验与对流免疫电泳试验以及耐酸性(pH2.0,1h)、热稳定性(56℃,30min)试验都提示上清中的IFN为IFN-α。     

细胞因子调节人肝癌细胞ICAM-1分子的表达及其对CD3AK杀伤功能的影响

应用基因重组人干扰素α（IFN-α）、干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF）体外处理人肝癌细胞系H-7402,ABC-CELISA法检测各处理组和对照组细胞表面细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的表达水平,用 LDH释放法观察CD3单克隆抗体活化的杀伤细胞（CD3AK）对各处理条件下H-7402细胞的杀伤活性。结果表明:经TNF,IFN-α处理的肿瘤细胞ICAM-1表达水平较对照组显著增高,同时对CD3AK细胞的杀伤敏感性亦显著增强,IFN-γ虽能够提高靶细胞ICAM-1分子的表达,但CD3AK的杀伤活性并未因此增强。抗ICAM-1和抗白细胞功能相关抗原LFA-1单抗能够有效地降低CD3AK对靶细胞的杀伤作用,并且能够阻断IFN-α、TNF对CD3AK细胞杀伤效应的促进作用。提示ICAM-1/LFA-1参与了CD3AK粘附杀伤肿瘤细胞过程,TNF、IFN-α的促杀伤效应与肿瘤细胞表面ICAM-1分子的表达水平升高有关。     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原启动子活性的影响

目的 :探讨胰岛素样生长因子 1(IGF 1)和胰岛素对人α1(Ⅰ )前胶原 (COL1A1)基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、干扰素α(IFNα)对这一作用的影响。方法 :构建含COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)报告基因的重组体pCOLH0 2 7与pCOLH2 5 ,它们分别含该启动子序列 2 68～ 4 2bp( 0 2 7kb)与 2 4 83～ 4 2bp( 2 5kb)片段。将这 2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞 ,加入IGF 1或胰岛素 ,部分细胞还加入TNFα或IFNγ或IFNα,测定CAT活性。结果 :13nmol/LIGF 1使转染后的这 2个重组体活性分别增高 3 68倍与 4 0 4倍。 2 5 μmol/L的胰岛素亦使之分别增高 3 69倍与 3 93倍。TNFα、IFNγ、IFNα能降低IGF 1与胰岛素诱导的pCOLH2 5活性。结论 :IGF 1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达 ,TNF α、IFNγ、IFNα能抑制IGF 1和胰岛素的这一作用。     

通过酵母分泌人干扰素

通过建构质粒在酵母菌(saceharomyces cerevisiae)内直接合成干扰素(IFN)α1,α2和γ,这种干扰素表达基因包括含有分泌信号编码序列能在培养液中分泌活性干扰素。从酵母细胞培养液内分离获得的大部分IFN α1,α2,与天然成熟干扰素具有相同的氨基末端,揭示这种移动的信号序列类似人细胞的信号序列.以上结果说明,低等真核生     

vJ16env/IFNα-2b基因共表达颗粒化抗原疫苗的免疫程序

目的：观察国际流行株HIV-lenv与IFNα-2b基因共表达的颗粒化抗原疫苗与质粒DNA核酸疫苗免疫程序优化的效果。方法：将重组质粒pJ16env／IFN廿2b经脂质体介导转染RK细胞，并在痘苗病毒中共表达HIV-lenv与IFNα-2b基因，以间接免疫荧光与斑点酶联免疫法鉴定其表达产物。以表达产物与质粒DNA联合免疫鼠脾淋巴细胞，检测淋巴细胞转化率、细胞毒性T细胞杀伤活性、CIM^ 、CD8^ 细胞计数与体液免疫水平。结果：nJ16env／IFNα-2b基因表达的颗粒化抗原疫苗具有良好的免疫原性，3vJ16env／IFNα-2b pJ16env／IFNα-2b联合免疫效果优于vJ16env／IFNα-2b单独免疫。结论：pJ16env／IFNα-2b基因表达的颗粒化抗原疫苗能诱导机体产生细胞免疫与体液免疫。     

抗重组人干扰素-α2b单克隆抗体的制备与应用

<正> 人α型IFN治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎及白血病有显著疗效。rHuIFN-α2b因其副作用小,疗效高,因而更为广泛使用。其生产过程中亲和层析纯化至关重要。为此我们制备了高特异性单克隆抗体3D9McAb用于分离纯化重组人干扰素α-2b(rHuIFN-α2b),现报道如下。1 材料和方法1.1 rHuIFN-α2b抗原制备 本所自制,用亲和层析柱纯化,比活2.0×10~8IU/mg,SDS-PAGE纯度达99％。1.2 单抗的筛选和制备 取8周龄雌Balb/c小鼠,用适当处理过的抗原免疫5次后进行细胞融合。ELISA法筛选,有限稀释法4次克隆后获得3D9细胞扩大培养,诱生腹水。     

聚乙二醇干扰素α-2a与干扰素α-2b治疗慢性丙型肝炎疗效分析

丙型肝炎病毒(HCV)感染可导致肝脏炎症坏死和纤维化,抗病毒治疗是丙型肝炎治疗的根本疗法。我们对慢性丙型肝炎(CHC)患者分别采用聚乙二醇干扰素α-2a(PEG-IFNα-2a)和干扰素α-2b(IFNα-2b)治疗,并对两种干扰素的临床疗效进行对比分析。1资料与方法1.1病例选择43例CHC患者为20     

ISGF3:IFN-α抗乙型肝炎病毒信号转导机制的重要因子

目的　研究干扰素 α(IFN α)抗乙型肝炎病毒(HBV)的信号转导机制。方法　用定量聚合酶链反应(PCR)检测IFNα2b处理前、后的HepG2 2 15细胞上清的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)水平。半定量逆转录聚合酶链反应(RT PCR)检测IFNα2b处理后不同时点的HepG2 2 15细胞和其母源细胞HepG2 细胞内信号转导和转录活化因子1(STAT1)、STAT2、干扰素刺激基因因子3γ(ISGF3γ)、2′5′寡腺苷酸合成酶(2′5′OAS)、RAN依赖蛋白激酶(PKR)的mRNA表达水平。WesternBlot检测ISGF3γ的蛋白质表达水平。并用染料木黄酮阻断IFNα2b信号转导后再次检测上述指标。结果　IFNα2b处理8h后,HepG2 2 15细胞上清HBVDNA平均减少0 72log 10copies ml,而加染料木黄酮后则无减少。IFNα2b处理后,HepG2 和HepG2 2 15细胞中STAT1、STAT2、ISGF3γ、2′5′OAS和PKRmRNA水平明显升高;加染料木黄酮后前3个因子mRNA水平仍然能检测到,而2′5′OAS和PKRmRNA则受到抑制。WesternBlot检测也提示IFNα2b处理后ISGF3γ蛋白质水平升高,加染料木黄酮后其表达受到抑制。结论　Janus酪氨酸激酶(JAK) STAT途径在IFN α抗HBV中发挥主要作用,而ISGF3是该途径的一个重要因子。     

两种具长效性重组人血清白蛋白／干扰素α融合蛋白表达工程菌的构建及融合蛋白的理化特性研究

目的对两种长效干扰素α融合蛋白原料药的理化特性多项指标开展分析和进行比较。方法利用基因工程技术分别构建了可高效表达重组人血清白蛋白／干扰素α2a融合蛋白（rHSA／IFNα2a）或重组人血清白蛋白,干扰素α2b融合蛋白（rHSA／IFNα2b）的毕赤酵母工程菌。融合蛋白直接分泌到组分简单的无机盐培养基中,并经特别建立的高效分离纯化工艺进行纯化,随后对两个融合蛋白进行详尽的理化特性分析。结果获得的融合蛋白纯度在98％以上;N端前15个氨基酸序列与理论序列相同;质谱分子量分别为85640．8D和85781．5D;圆二色光谱分析比对蛋白空间构象未变;等电点DI约在5．1左右;为非糖基化蛋白;紫外光谱呈典型蛋白质光谱;自由巯基含量测定值为1．4;肽图批次问一致;肽质量指纹图谱可匹配分别达83％和82％;对制备的2个融合蛋白原料药中的细菌内毒素、宿主蛋白质、外源性DNA、甲醇和甘油的残留量检测符合标准要求;融合蛋白的免疫学鉴别为阳性;体外细胞生物比活性约为2．5×10^5IU／mg,并且2个融合蛋白生物比活性测定值无不同,由此,获得了符合临床用药标准的原料药。结论研究所获得的结果可以作为指导《注射用重组人血清白蛋白／干扰素α2a融合蛋白》和《注射用重组人血清白蛋白／干扰素α2b融合蛋白》2个新药的原料药生产质量标准的建立和检定方法的确定。     

干扰素及其临床应用(续)四干扰素制剂及其应用

1 干扰素临床应用的种类和剂型 不同亚型干扰素各有其独特的性质,反映在临床应用上也有所不同.目前,临床上使用的干扰素型别主要有α2a、α2b、α1b、β1 a、β1b、γ1等及各种自然干扰素和长效干扰素,主要剂型有冻干粉针剂、水针剂、栓剂、滴眼液等.干扰素喷雾剂虽然未批准上市流通,但我国SFDA已经批准北京远策药业有限责任公司研制的重组人干扰素α2b喷雾剂及军科院研制的重组人干扰素ω喷雾剂为预防SARS的储备药物.详见表4-1及表4-2.     

重组人干扰素α-2b喷雾剂在人群中对风疹、麻疹病毒减毒活疫苗鼻腔接种后干预免疫效果的初步研究

目的初步观察重组人干扰素α2b(rhIFNα2b)鼻腔喷雾剂对风疹、麻疹减毒活疫苗鼻腔接种后免疫效果的干预作用。方法选择合适人群进行对比试验,一组为干扰素(IFN)试验组,一组为对照组。IFN试验组提前2天使用rhIFNα2b喷雾剂,然后IFN试验组和对照组分别使用风疹、麻疹减毒活疫苗进行鼻腔接种。在疫苗接种前以及接种后第21和28天分别采集试验对象血清测定其对应的IgG特异性抗体,以抗体滴度的差异观察IFNα2b对病毒感染的干预效果。结果麻疹试验组和对照组的抗体差异分别为1.26(21d)和2.96(28d),差异有统计学意义;风疹试验组和对照组的抗体差异为0.95(21d)和0.37(28d),差异不明显。结论⑴单价麻疹和风疹疫苗鼻腔喷雾接种可以加强基础免疫;⑵rhIFNα2b鼻腔喷雾剂对风疹和麻疹减毒活疫苗鼻腔接种的免疫效果有一定的干预作用。     

干扰素对淋巴细胞Frc受体的调变作用与ADCC活性

干扰素(IFN)的免疫调节机理与改变免疫活性细胞膜表面结构密切相关。本文研究发现α干扰素对淋巴细胞表面Fcr受体表达的调变作用与ADCC活性的调节呈正相关(γ= 0.98),而且干扰素的该调变作用可被IFNα抗体所取消。     

重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂预防治疗恒河猴感染SARS-CoV的试验研究

目的评价重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂对恒河猴感染SARS-CoV的预防治疗作用。方法采用鼻腔喷雾法(剂量为60万单位/鼻孔)研究了重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂对感染SARS-CoV的恒河猴预防治疗效果。结果试验组(5只)和对照组(5只)相同时间检测的咽拭子等标本中,Real-time PCR检测和病毒分离均未检出病毒。攻毒后病毒导致机体产生的中和抗体和IgG抗体的反应也较对照组弱。血液学指标检测结果表明试验组动物攻毒后各项指标较试验前比较没有显著性改变;病理结果显示试验组2只恒河猴肺组织形态基本正常,其余3只猴有肺间质性炎,表现肺间隔增厚、单核样细胞为主的炎细胞浸润,其中1只增厚的肺间隔有局灶相互融合,这3只猴肺部病变与对照组的病变表现相似,且病变累及范围较对照组小;其他各受检脏器均未见明显异常。结论重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂可以有效阻断或减弱SARS-CoV对恒河猴的感染。     

基因1b型丙型肝炎病毒NS5A区变异及其与聚乙二醇干扰素α-2a联合利巴韦林治疗应答的相关性

目的探讨基因1b型慢性丙型肝炎患者NS5A区基因变异与聚乙二醇干扰素α-2a（PEG—IFNα-2a）联合利巴韦林（RBV）抗病毒治疗疗效的关系。方法回顾性选择15例应用PEG—IFNα-2a／RBV抗病毒治疗的基因1b型慢性丙型肝炎患者,其中7例为快速应答（RVR）,8例为无应答（NR）,应用RT—PCR法扩增NS5A全长片段,用克隆测序方法进行核苷酸和氨基酸序列测定。结果没有发现与治疗应答相关的单个氨基酸或基序变异,RVR组和NR组在NS5A、ISDR、PKRBD和IRRDR区的氨基酸突变数目差别均无统计学意义,RVR组在V3区（aa2356～2379）的氨基酸突变数目高于NR组（分别为5．3±0.5和3．4±0．6,P=0．03）。结论V3区的氨基酸突变数目与PEG—IFNα-2a联合RBV抗病毒疗效可能相关。