曲霉生物膜对常用抗真菌药物的敏感性测定及其耐药的分子机制初探北大核心CSCD

目的探讨曲霉生物膜对常用抗真菌药物的敏感性及其耐药的分子机制。方法利用微量液基稀释法测定22株曲霉游离孢子对两性霉素B、卡泊芬净和伏立康唑的敏感性;同时建立22株曲霉生物膜的体外模型,用抗真菌药物敏感试验联合甲基四氮盐（x1Tr）减低法来评价曲霉生物膜对两性霉素B、卡泊芬净和伏立康唑的敏感性。通过实时RT—PCR测定烟曲霉生物膜形成过程中药物外排泵基因及唑类药物靶酶基因的相对表达量。结果对于曲霉的游离孢子,两性霉素B的最低抑菌浓度（MIC）范围是0．5～2mg／L,卡泊芬净的最低有效浓度（MEC）范围是0．125—0．25mg／L,伏立康唑的MIC范围是0．5—1mg／L;对于曲霉生物膜,两性霉素B的SMIC。（抑制50％固着性曲霉生物膜生长的最小药物浓度）和SMIC。（抑制80％固着性曲霉生物膜生长的最小药物浓度）范围分别是2～〉32mg／L和8～〉32mg／L,卡泊芬净的SMIC∞和SMIC8D范围分别是32～〉256mg／L和256～〉256mg／L,伏立康唑的SMIC∞和SMIC。范围分别是4～〉256mg／L和32～〉256mg／L。烟曲霉生物膜形成过程中药物外排泵基因及唑类药物靶酶基因相对表达量测定显示,与0h相比,7个待测基因在4h时表达量没有变化;8h时AfuMDR1、CYP51A、CYP51B表达量升高,CYP51A表达量升高最明显;12、16、24h时MuMDR1、AfuMDR2、AfuMDR4、CYP51A、CYP51B表达量升高,其中CYP51A表达量升高的最明显;AfuMDR3和atrF在生物膜形成过程中表达量没有明显变化。结论与游离孢子相比,曲霉生物膜对两性霉素B、卡泊芬净和伏立康唑的敏感性明显下降;烟曲霉形成生物膜以后,药物外排泵基因和唑类靶酶基因的表达量升高。     

浅部与深部感染来源白念珠菌氟康唑耐药株药物敏感性及耐药基因突变比较

【摘要】 目的 比较浅部、深部感染来源的氟康唑耐药白念珠菌体外对8种抗真菌药物的敏感性及耐药基因突变。方法 26株深部感染来源白念珠菌耐药株、33株浅部感染来源白念珠菌耐药株,参照CLSI酵母菌检测方案M27-A4测定上述菌株对氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、两性霉素B、氟胞嘧啶、特比萘芬、米卡芬净8种药物单独或联合的体外敏感性。提取所有耐药菌株DNA,通过PCR检测ERG3、ERG11、FUR1 3种耐药基因的突变情况。满足正态分布和方差齐性检验的定量资料两组间比较采用独立样本t检验,不满足者组间比较采用Mann-Whitney U检验,定性资料组间比较采用卡方检验。结果 氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、氟胞嘧啶的最小抑菌浓度（MIC）在浅部感染组和深部感染组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）,而两性霉素B、米卡芬净的MIC两组间差异无统计学意义（均P > 0.05）。96.6%的菌株特比萘芬MIC值＞64 μg/ml,无法进行组间对比。15株白念珠菌（7株深部感染来源、8株浅部感染来源）特比萘芬 + 唑类（氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑）联合药敏试验均显示为协同效应,部分抑菌浓度（FIC）指数0.033～0.187;氟胞嘧啶 + 唑类、氟胞嘧啶 + 两性霉素B、两性霉素B + 氟康唑组合均无明显协同作用,FIC指数0.56～1.125。浅部感染来源白念珠菌ERG3基因突变包括错义突变V351A（33株,100%）,深部感染来源白念珠菌包括错义突变V351A（13株,50%）、A353T（4株,15%）;浅部感染来源白念珠菌ERG11基因突变包括错义突变I437V（32株,97%）、Y132H（23株,70%）、T123I（16株,48%）、K128T（6株,18%）、D116E（5株,15%）、A114S（4株,12%）、E266D（2株,6%）、G448E（2株,6%）、G465S（2株,6%）,深部感染来源白念珠菌包括I437V（23株,88%）、E266D（13株,50%）、E260G（5株,19%）、V488I（4株,15%）;浅部感染来源白念珠菌 FUR1基因突变包括错义突变R101C（11株,33%）,深部感染来源白念珠菌未检出错义突变。结论 浅部与深部感染来源白念珠菌氟康唑耐药株对药物的敏感性及基因突变位点均有所差别。     

耐伊曲康唑烟曲霉临床分离株对四种抗真菌药物的敏感性测定

目的 测定耐伊曲康唑烟曲霉临床株对4种抗真菌药物的敏感性。方法 自一例对伊曲康唑无效的肺曲霉球患者体内系列分离6株烟曲霉。利用美国临床实验室标准化研究所（CLSI）的微量液基稀释法M38-A方案和E-test法测定6株烟曲霉临床分离株对两性霉素B、卡泊芬净、米卡芬净、伏立康唑和伊曲康唑的敏感性。结果 6株烟曲霉中，2株对伊曲康唑的最低抑菌浓度（MIC）为 0.5 μg/mL，其他4株的MIC均 ＞ 16 μg/mL；两性霉素B和伏立康唑对6株烟曲霉的MIC分别为1 μg/mL和0.25 ~ 1 μg/mL，卡泊芬净和米卡芬净对6株烟曲霉的最低有效浓度均 ≤0.03 μg/mL。E-test法测定结果也显示，卡泊芬净和伏立康唑对6株烟曲霉有良好的抑制活性。结论 耐伊曲康唑烟曲霉临床株对两性霉素B、卡泊芬净、米卡芬净和伏立康唑敏感。     

南京某医院201株烟曲霉感染患者临床资料与唑类耐药情况回顾性分析

目的:总结南京某医院烟曲霉感染患者的临床特征,初步评估烟曲霉临床分离株的唑类耐药情况,以及唑类耐药烟曲霉出现的高危因素。方法:收集2017年3月至2021年2月南京市鼓楼医院检验科自住院患者中分离到的烟曲霉菌株,分析感染患者的临床资料,并对分离的烟曲霉进行唑类药物敏感性试验和 cyp51A基因及其启动子区的...     

烟曲霉伊曲康唑耐药株的体外诱导及与CYP51A基因相关性研究

目的构建烟曲霉体外诱导伊曲康唑耐药株,初步探讨与CYP 51A基因的相关性。方法通过含有伊曲康唑的固体培养基对烟曲霉进行梯度浓度体外诱导耐药,微量液基稀释法测定诱导株对伊曲康唑的敏感性;提取诱导株基因组,扩增唑类药物靶酶CYP 51A基因,进行测序和序列分析。结果诱导获得8株烟曲霉体外诱导株,其中6株对伊曲康唑表现出耐药性。耐药株唑类药物靶酶CYP 51A基因发生G54(G54R,G54E)和L98H的点突变。结论伊曲康唑体外梯度浓度诱导是获得烟曲霉伊曲康唑耐药株的有效方法;烟曲霉对伊曲康唑抗真菌药物的耐药性可能与唑类药物靶点基因CYP 51A的点突变相关。     

含额外拷贝ERG3B基因烟曲霉的表型分析

目的克隆烟曲霉ERG3B基因,并构建烟曲霉ERG3B基因额外拷贝株,了解该基因对烟曲霉表型的影响。方法通过同源性比对,在烟曲霉基因组找出烟曲霉可能的ERG3基因的开放读码框(ORF),PCR扩增ERG3B基因ORF连同其上下游各约1kb的DNA片段,将该片段重组到穿梭质粒pRG-AMA1-NotI。用重组后的质粒转化嘧啶营养缺陷株烟曲霉AF293.1。观察转化子的生长速度并测定转化子对抗真菌药物敏感性。结果①烟曲霉ERG3基因有3个拷贝(ERG3A,ERG3B,ERG3C)。Erg3Ap和Erg3Bp与其他真菌的Erg3同源性高。②烟曲霉ERG3B基因被重组到了pRG-AMA1-NotI,产生质粒pERG3B。用pERG3B和空载体pRG-AMA1-NotI转化AF293.1后,分别得到转化子AF-pERG3B和AF-empty。AF-pERG3B与AF-empty的生长速度无差异;两者对伊曲康唑、伏立康唑、特比萘芬、两性霉素B、卡泊芬净、灰黄霉素的敏感性也无差异。结论额外拷贝的ERG3B基因不影响烟曲霉的生长速度及对伊曲康唑、伏立康唑、特比萘芬、两性霉素B、卡泊芬净、灰黄霉素的敏感性。     

不同耐药淋球菌菌株IR基因突变与mtrC基因转录水平的差异性比较

目的：研究不同耐药淋球菌菌株多传递耐药（mtr）系统反向重复序列（IR）区基因突变与mtrC基因转录水平的差异性,进一步探索mtr系统介导耐药的机制。方法：采用琼脂稀释法测定抗生素对菌株的最小抑菌浓度（MIC）,PCR扩增含IR区的目的基因并对扩增产物测序,同时采用反转录（RT）-PCR检测mtrC基因mRNA表达水平的变化。结果：5株敏感株及5株仅耐青霉素菌株无IR区基因突变,16株多重耐药菌株中IR区均有碱基A／T缺失。敏感株mtrC转录水平显著低于耐药株（P〈0．05）,而耐药菌株组中IR区碱基突变组mtrC转录水平显著高于无突变组（JP〈0．05）。结论：淋球菌染色体mtrR启动子区域的IR区基因突变会引起mtrC基因转录增加,进而提高奈瑟淋球菌的耐药性。     

广州淋球菌基因特征及其多抗原序列分型与环丙沙星耐药相关性研究

目的 探讨2014年广州市97株淋球菌环丙沙星耐药株的基因特征及其多抗原序列分型（NG-MAST）与淋球菌耐环丙沙星的相关性。 方法 用琼脂稀释法测定淋球菌对环丙沙星的最低抑菌浓度（MIC）,PCR分别扩增淋球菌的gyrA、parC基因和NG-MAST分型基因porB、tbpB基因并测序,获取耐药菌株的ST型别。 结果 97株淋球菌中95株（97.9%）对环丙沙星耐药。95株环丙沙星耐药菌株均在gyrA基因对应丝氨酸的第91和95位点上发生了突变,其中93株菌出现了parC基因突变。41株高水平耐药株（MIC ≥ 16 mg/L）中35株（85.4%）出现了parC基因87位点突变,54株低水平耐药株中32株（59.3%）出现此突变,差异有统计学意义（χ2 = 7.64,P < 0.05）。96株淋球菌分离株配对后,50株为网站已编号型别,共35个不同的ST型,其中10个ST型含有2 ~ 4个不同的分离株,ST型别中最常见ST5309。对淋球菌菌株系统进化树分析,淋球菌流行株可分为两群,第1群84株中MIC ≥ 16 mg/L的菌株39株占46.4%,第2群12株中只有1株MIC值为16 mg/L,差异有统计学意义（χ2 = 6.27,P = 0.012）。 结论 淋球菌对环丙沙星的高水平耐药主要与parC基因87位点突变相关。NG-MAST分型与环丙沙星耐药程度高低可能存在相关性。     

艾滋病患者白念珠菌ERG11基因突变的研究

目的 探讨艾滋病患者的白念珠菌唑类耐药株中唑类抗真菌药物(氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑)的作用靶位基因ERG 11基因突变与耐药的关系.方法 用PCR对临床分离的93株白念珠菌的Erg11基因进行扩增、测序,DNAman软件将测序结果与基因库中的X13296进行比对,将突变碱基翻译为氨基酸,确定是否发生错义突变.结果 共检出40个碱基突变位点,包括27个同义突变位点和13个错义突变位点.耐一种药物的突变菌株中每株菌只发生一处错义突变或无错义突变,而耐二种或三种药物的菌株中每株菌还可以同时出现两处或三处错义突变.结论 ERG 11基因错义突变与白念珠菌耐药有关.     

不同抗真菌药物对艾滋病合并马尔尼菲篮状菌病临床疗效及体外药敏试验结果分析

目的观察艾滋病合并马尔尼菲篮状菌病患者体外真菌药敏结果和不同抗真菌治疗方案的疗效。方法将酵母相马尔尼菲篮状菌调成菌悬液并转移至药敏培养基中混匀,然后将混匀的酵母菌悬浮液接种到ATBTMFUNGUS 3酵母样真菌敏感性检测试纸条上孵育,可以通过肉眼判读杯状凹中酵母菌的生长情况,获得两性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑、氟康唑、氟胞嘧啶的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC);同时临床观察不同抗真菌药物治疗的疗效。结果84株马尔尼菲篮状菌均显示两性霉素B MIC<0.5 mg/L,伊曲康唑MIC<0.125 mg/L,伏立康唑MIC<0.06 mg/L。73株(86.90%)马尔尼菲篮状菌显示氟康唑MIC≥1 mg/L。69株(82.14%)马尔尼菲篮状菌显示氟胞嘧啶MIC≥4 mg/L。药敏结果显示马尔尼菲篮状菌对两性霉素B、伊曲康唑和伏立康唑的MIC均处于低水平,而对氟康唑和氟胞嘧啶MIC均处于高水平。84例患者中有7例未接受抗真菌治疗者均死亡,77例患者接受了抗真菌治疗,其中74例治疗好转,治疗好转率96.10%。两性霉素B治疗组好转率96.88%,伏立康唑治疗组好转率92.31%,两组比较差异无统计学意义(P=0.43)。结论艾滋病合并马尔尼菲篮状菌病可以选择两性霉素B、伏立康唑和伊曲康唑治疗,不推荐选择氟康唑和氟胞嘧啶治疗。     

小檗碱体外对酵母相马尔尼菲篮状菌的抗菌活性检测

目的:体外检测小檗碱对酵母相马尔尼菲篮状菌（TM）的抗菌活性。方法:TM标准株（ATCC22019）1株,临床分离株10株,野生竹鼠分离株10株。TM以（1~5）× 10 3菌落形成单位/ml菌悬液接种于用微量稀释法制备的小檗碱、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B、卡泊芬净药敏板,在37 ℃下培养48 ...     

抗真菌药单用及联合体外抗皮炎外瓶霉生物膜效应

目的 检测抗真菌药单用及联合对皮炎外瓶霉生物膜的体外抗真菌活性。方法 96孔板构建皮炎外瓶霉生物膜,通过棋盘式微量液基稀释法,检测两性霉素B、伏立康唑、伊曲康唑及卡泊芬净单用或联合抗皮炎外瓶霉生物膜的活性。结果 伊曲康唑、伏立康唑及卡泊芬净对皮炎外瓶霉生物膜50%和80%最低抑菌浓度（SMIC50、SMIC80）均 > 32 mg/L,两性霉素B的SMIC50为1 ~ 2 mg/L,SMIC 80为4 ~ 8 mg/L。两性霉素B与伏立康唑联合抗皮炎外瓶霉生物膜有协同效应;两性霉素B与伊曲康唑或卡泊芬净联合,以及伏立康唑与卡泊芬净联合对皮炎外瓶霉生物膜均无协同作用;所有组合均未见拮抗效应。结论 两性霉素B具有较好的抗皮炎外瓶霉生物膜活性,与伏立康唑联合能够增强对皮炎外瓶霉生物膜的杀伤作用。     

他汀类降血脂药物对曲霉的体外抗真菌作用

目的 观察降血脂药物洛伐他汀、辛伐他汀对曲霉体外抗真菌活性，以及它们与唑类抗真菌药、两性霉素B的联合抗曲霉作用。方法 分别用纸片扩散法和微量液基稀释法，测定洛伐他汀、辛伐他汀对烟曲霉、黄曲霉、土曲霉和黑曲霉的抗菌活性。用纸片扩散法、琼脂扩散联合Etest法测两种药物与伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B的联合抗曲霉作用。结果 纸片扩散法显示洛伐他汀、辛伐他汀有体外抗曲霉活性。洛伐他汀、辛伐他汀对烟曲霉的最低抑菌浓度（MIC）范围分别为8 ~ 128 μg/mL、4 ~ 64 μg/mL；最低杀菌浓度（MFC）与MIC的差异在2个稀释度内。对于非烟曲霉，48 h时，20 μg洛伐他汀或辛伐他汀不能产生清晰抑菌圈。洛伐他汀、辛伐他汀对黄曲霉的MIC分别为128 μg/mL和64 μg/mL；两者对土曲霉和黑曲霉的MIC均 > 256 μg/mL。洛伐他汀、辛伐他汀与伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B均无协同作用。结论 在体外，洛伐他汀、辛伐他汀有抗曲霉活性；但与唑类抗真菌药、两性霉素B无协同作用。     

新生隐球菌生物膜体外抗真菌药物敏感性研究

目的了解新生隐球菌生物膜对氟康唑、两性霉素B、伊曲康唑和卡泊芬净的体外敏感性。方法采用标准微量稀释法测定上述4种抗真菌药物对20株新生隐球菌悬浮状态与生物膜状态的最低抑菌浓度(MIC),MIC结果判定采用四甲基偶氮唑盐[XTT,2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt]-降解法。结果悬浮新生隐球菌20株均对两性霉素B敏感(<1μg/mL),3株对氟康唑耐药(>64μg/mL);1株对伊曲康唑耐药;20株均对卡泊芬净耐药。而生物膜新生隐球菌显示:在20株中,除4株对两性霉素B敏感外,其余各株均对两性霉素B耐药。20株菌均对氟康唑和伊曲康唑耐药,远远高于耐药浓度。对卡泊芬净,均高于其耐药浓度。结论标准微量稀释法结合四甲基偶氮唑盐(XTT)-降解法测定新生隐球菌生物膜对抗真菌药物的敏感性其结果具有可重复性和一致性的特点;新生隐球菌生物膜的明显降低抗真菌药物的敏感性。     

皮炎外瓶霉临床和环境分离株对6种常用抗真菌药物的敏感性测定

目的 探讨临床分离的皮炎外瓶霉对6种常用抗真菌药物的敏感性。方法 参考美国临床实验室标准化研究所M27-A2方案测定特比萘芬（TRB）、伊曲康唑（ITC）、两性霉素B（AMB）、氟康唑（FLC）、伏立康唑（VRC）及卡泊芬净（CAS） 对16株皮炎外瓶霉的最低抑菌浓度（MIC）,同时以E-test法测定VRC、ITC和AMB对16株皮炎外瓶霉的MIC,并进一步测定每种药物的最低杀菌浓度（MFC）。在此基础上,观察TRB与ITC及VRC联合应用时对皮炎外瓶霉的抗菌作用。结果 微量液基稀释法测得TRB、VRC、ITC、AMB、FLC和CAS 对皮炎外瓶霉MIC范围分别为：0.125 ~ 0.25、0.25 ~ 0.5、2.0、2.0、16 ~ 32和16 ~ 64mg/L;TRB、VRC、ITC、AMB和FLC的MFC范围分别为：0.125 ~ 0.5、0.25 ~ 0.5、2.0 ~ 4.0、2.0 ~ 4.0和16 ~ 64 mg/L。E-test法测定VRC、ITC和AMB的MIC范围为：0.032 ~ 0.094、0.047 ~ 0.5和0.125 ~ 3.0 mg/L。TRB与ITC及VRC在体外联合应用对皮炎外瓶霉无协同效应。结论 皮炎外瓶霉在体外对TRB、ITC、AMB、VRC敏感,对FLC和CAS不敏感。     

几种抗真菌药物对马尔尼菲青霉的体外药敏试验

目的 观察马尔尼菲青霉（PM）广西野生银星竹鼠寄生株与临床人分离株对伏立康唑和几种常用抗真菌药物的敏感性。方法 采用美国临床实验室标准委员会（CLSI）M27-A2和M38-A方案中的微量稀释法,测定伏立康唑、伊曲康唑、特比萘芬、两性霉素B 及氟康唑对14株广西野生银星竹鼠PM寄生株与25株临床人PM分离株25 ℃菌丝相及37 ℃酵母相的最小抑菌浓度（MIC）。用两样本均数比较t检验比较PM寄生株与临床人PM分离株MIC的差异性,用配对t检验比较同一株菌在两种不同温度相下的MIC差异性。结果 伏立康唑、伊曲康唑、特比萘芬、两性霉素B、氟康唑对PM寄生株菌丝相的MIC分别为：0.0313 ～ 0.1250、0.1250 ～ 1.0000、0.0313 ～ 0.5000、0.2500 ～ 4.0000、2.0000 ～ 8.0000 mg/L;对PM寄生株酵母相的MIC分别为：0.0078 ～ 0.2500、0.0313 ～ 0.5000、0.0313 ～ 1.0000、0.2500 ～ 2.0000、1.0000 ～ 8.0000 mg/L;对PM临床人分离株菌丝相的MIC分别为：0.0313 ～ 0.2500、0.0625 ～ 1.0000、0.0313 ～ 1.0000、0.2500 ～ 4.0000、2.0000 ～ 32.0000 mg/L;对PM临床人分离株酵母相的MIC分别为：0.0039 ～ 0.2500、0.0313 ～ 0.5000、0.0313 ～ 2.0000、0.1250 ～ 2.0000、2.0000 ～ 16.0000 mg/L。5种抗真菌药物对广西野生银星竹鼠PM寄生株与临床人PM分离株菌丝相和酵母相均敏感。同一温度下伏立康唑对两种不同来源PM的MIC最低,其他药物的MIC依次为伊曲康唑、特比萘芬 < 两性霉素B < 氟康唑。同一药物在同一温度下对广西野生银星竹鼠PM寄生株与PM临床分离株的MIC无明显差异;伊曲康唑、两性霉素B、特比萘芬对同一菌株在菌丝相和酵母相下的MIC存在差异。结论 PM对伏立康唑的敏感性最高;来自于广西野生银星竹鼠的PM寄生株与临床人PM分离株对伏立康唑、伊曲康唑、特比萘芬、两性霉素B及氟康唑的MIC类似;菌相的改变可影响PM对伊曲康唑、两性霉素B、特比萘芬的敏感性。