基因芯片用于鼠疫快速诊断的初步研究

目的将基因芯片技术用于鼠疫的快速诊断。方法分别采用RD标记技术对鼠疫耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌的DNA样品进行标记,与芯片上的探针进行杂交。结果芯片能将鼠疫耶尔森菌与同属的2种致病性细菌鉴别开。结论基因芯片是一种有效的诊断工具,可用于鼠疫的诊断。     

基因芯片用于鼠疫快速诊断的初步研究

目的 将基因芯片技术用于鼠疫的快速诊断。方法 分别采用RD标记技术对鼠疫耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌的DNA样品进行标记，与芯片上的探针进行杂交。结果 芯片能将鼠疫耶尔森菌与同属的2种致病性细菌鉴别开。结论 基因芯片是一种有效的诊断工具，可用于鼠疫的诊断。     

食源致病菌96 微孔板DNA 诊断芯片的研制及在一起食物中毒突发事件中的应用

目的研制能同时检测9种常见食源致病菌的96微孔板DNA诊断芯片。方法针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7(Stx1和Stx2)、志贺氏菌、产单核细胞李斯特菌、蜡样芽胞杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌等9种最常见的食源性致病菌,首先选择合适的保守基因,设计种特异性的PCR引物(5'端标记生物素)和检测探针,通过参数优化建立一管多重PCR扩增体系;然后按5×5的阵列格式将探针点制到96微孔板的微孔内,通过条件优化建立稳定的PCR产物与固化探针的微孔杂交体系;采用链霉抗生物素蛋白碱性磷酸酶和化学显色底物NBT/BCIP来检测特异性的PCR杂交产物。结果20株标准菌株验证已建立的食源致病菌微孔板DNA诊断芯片,获得比较特异和稳定的实验结果。在一起食物中毒事件中,该芯片在采样后12h内检出金黄色葡萄球菌,与传统的细菌分离培养和生化鉴定的结果相符。结论本研究建立的新型食源致病菌96微孔板DNA诊断芯片具有快速、准确、自动化和高通量等特点,为快速应对食物中毒等突发公共卫生事件提供了非常有价值的检测技术。     

葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌肠毒素液相悬浮芯片方法的建立

目的 采用Luminex液相悬浮芯片检测方法,建立一管同时检测19种葡萄球菌肠毒素和蜡样芽胞杆菌肠毒素的快速筛查方法.方法 根据GenBank公布的葡萄球菌肠毒素entA-entR基因、蜡样芽胞杆菌cesB,nheB基因,设计特异性引物和探针,优化反应体系和条件,建立19种肠毒素的Luminex液相悬浮芯片检测法.结果 Luminex液相悬浮芯片体系检测19种肠毒素互不干扰,经验证80株金葡菌和蜡样芽胞杆菌菌株,均出现特异性荧光中值信号.Luminex液相悬浮芯片技术从样品处理到检测结果需3.5h左右.结论 Luminex液相悬浮芯片筛查方法可应用于食物中毒等应急检测的快速和高通量筛查.     

阳性血培养中的布鲁菌的快速分子鉴定

目的 建立一种快速、简便、准确的方法,直接检测阳性血培养液中的布鲁氏菌,用于布鲁菌病的早期诊断。 方法 将疑似布鲁菌病患者的阳性血培养液在生物安全柜内涂片,并转种至血培养皿及巧克力平皿进行培养。应用特异性的布鲁菌探针Bru-996,采用荧光原位杂交法检测涂片上的细菌;分别采用Vitek2自动细菌鉴定仪和16SrRNA基因测序法鉴定经培养的细菌。将荧光原位杂交法检测结果与Vitek2自动细菌鉴定仪和16SrRNA基因测序法检测结果进行比较。 结果 35份阳性血培养液经检测,荧光原位杂交法检出布鲁菌34株,非布鲁菌1株;基因测序法检出马耳他布鲁菌34株,洋葱伯克霍尔德菌1株;Vitek2鉴定法分别检出马耳他布鲁菌28株、洋葱伯克霍尔德菌1株、吉拉尔玫瑰单胞菌5株,支气管鲍特菌1株。荧光原位杂交法与基因测序法检出结果一致,6株布鲁菌经Vitek 2鉴定错误。 结论 荧光原位杂交法可直接快速简便准确地检测阳性血培养液中的布鲁菌。     

特异引物PCR鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌方法的建立和优化

目的以16S rRNA编码序列为靶基因,建立特异引物PCR鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌方法并优化。方法以类鼻疽伯克霍尔德菌标准菌株K96243的16S rRNA编码序列为靶序列,通过Primer Premier 5软件搜索特异的引物,以该菌为模板,优化特异引物PCR的退火温度、退火时间和反应循环数等条件。得到最优PCR反应条件后,将该方法用于检测临床分离的类鼻疽伯克霍尔德菌菌株和常见细菌感染病原体(大肠杆菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌、幽门螺旋杆菌、金黄色葡萄球菌、甲型链球菌和乙型链球菌),评价该方法的有效性和特异性。结果共设计3对引物,分别扩增16S rRNA编码序列283～672、760～1 061、771～1 193片段,优化后PCR反应条件为:94℃预变性4 min,94℃变性40 s,54.5℃退火20 s,72℃延伸40 s,24个循环,最后延伸1 min;特异性分析发现此方法能将类鼻疽伯克霍尔德菌与其他常见感染病原菌进行有效地鉴别诊断。结论成功建立并优化一种快速鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的方法,通过此方法能有效的从单个菌落中和基因组水平鉴定临床分离的8株类鼻疽伯克霍尔德菌。     

悬浮芯片HPA基因分型方法的建立及评价研究

目的:建立一种准确、高通量的人类血小板抗原(HPA)基因分型方法。方法:采用多重PCR及连接酶技术扩增22种HPA基因,将扩增产物与包被在微球上的特异性探针杂交,通过Bio-Plex悬浮芯片阅读仪判定HPA基因型,将检测结果与聚合酶链反应-测序分型(PCR-SBT)结果比较。结果:成功建立了悬浮芯片HPA基因分型方法并对西安市汉族献血者血液样品进行基因分型,检测结果与PCR-SBT分型结果完全一致。结论:真正建立了一种准确、高通量的HPA分型方法,对临床血小板HPA分型输注以及建立已知HPA供者库具有重要意义。     

广西地区类鼻疽伯克霍尔德氏菌的分布调查

目的 调查类鼻疽伯克霍尔德氏菌在广西地区的详细分布情况.方法 于2007年底对广西地区的14个地级市进行了大规模调查,共采集了77个地点的154个土壤样品和130个水样.采样通过细菌分离培养方法、16S rDNA基因测序和鞭毛基因检测的方法进行鉴定分析,对类鼻疽伯克霍尔德氏菌检出情况的地理分布进行绘图记录.结果 154份土壤样品中分离纯化出13株类鼻疽伯克霍尔德氏菌,阳性率为8.4％,没有在水样中发现该菌;分离纯化结果与16S rDNA基因测序和鞭毛基因检测的结果完全一致.分离纯化类鼻疽伯克霍尔德氏菌阳性的采样点分布在中东、南宁、钦州、放城、北海5个地区.结论 广西地区的类鼻疽伯克霍尔德氏菌主要分布在北回归线以南,南海附近地区.     

3种方法对鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的鉴定

目的 用3种检测方法对同源性较高的鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌进行鉴定,比较该3种检测方法的鉴定效果.方法 分别利用基于MALDI-TOF-MS的蛋白指纹图谱方法、双重荧光定量PCR方法和16S rRNA基因序列分析方法对5株鼻疽伯克霍尔德菌和5株类鼻疽伯克霍尔德菌进行鉴定,综合判断鉴定结果,并与传统的形态学和生化鉴定结果比较,寻找更适合于该两种菌的鉴定方法.结果 在10株受试菌株中,2株排除是鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌的可能,剩余8株之中,MALDI-TOF-MS方法正确鉴定了6株,双重荧光定量PCR方法正确鉴定了8株,16SrRNA基因序列分析方法正确鉴定4株.结论 MALDI-TOF-MS的蛋白指纹图谱方法和双重荧光定量PCR方法对鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌具有很好的鉴定能力,16S rRNA基因序列分析方法不适合用于该2种菌的鉴定.     

液态芯片监测铜绿假单胞菌多重耐药基因的研究

目的建立以液态芯片为检测手段的快速、高通量的铜绿假单胞菌多重耐药基因监测技术平台,探索建立能够常规应用于临床并解决现行临床表型测定局限性的分子生物学技术。方法针对铜绿假单胞菌中常见的OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP共8个耐药基因序列进行分析,依次对这8个耐药基因设计多重PCR扩增引物和序列特异的核酸探针,选取临床鉴定的含各耐药基因的耐药菌株作为阳性参比品进行检测工艺优化,进行铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片监测平台的研发。结果初步建立了铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片监测平台,组装了铜绿假单胞菌多重耐药检测液态芯片试剂盒1套。选择了8株含各耐药基因铜绿假单胞菌阳性菌株,用组装的试剂盒重复检测10次,耐药基因检测阳性率为100%,各耐药基因检测信号间无交叉,灵敏度﹑特异度以及重复性都很好。利用此平台进行了一定数量的临床标本检测分析。从检测结果来看,40份标本中,18份标本耐药基因阳性,其中含多耐药基因的标本有9份,占50%。18份阳性标本的耐药基因与耐药表型分析结果一致。结论此监测平台是将一种多重扩增技术和芯片技术-悬浮阵列技术相结合的方法,具有特异性高、可组合筛查、检测通量高的优势。     

中国地鼠基因组微卫星富集文库的构建与分析

目的筛选中国地鼠微卫星位点,为中国地鼠种质资源的分类、进化等遗传研究奠定基础。方法中国地鼠基因组DNA经超声打碎,用2%琼脂糖凝胶电泳回收500～1000 bp的DNA片段,与SNX连接头连接,连接产物与生物素标记的14种微卫星探针变性及退火,再通过链亲和素偶联磁珠亲和捕捉,经吸附、洗涤及洗脱,然后以洗脱产物为模板,通过PCR扩增,与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH10B,构建中国地鼠微卫星DNA富集文库。结果测序结果发现,微卫星DNA序列的阳性克隆占70.3%。结论中国地鼠微卫星文库的建立和微卫星的筛选将为下一步进行中国地鼠遗传连锁图谱的构建、分子进化和系统发育研究提供大量的微卫星标记。     

基于核酸适体的比色技术检测肿瘤标志物血管内皮生长因子

目的 基于核酸适体和磁珠,提出一种检测肿瘤标志物血管内皮生长因子(VEGF)的比色方法.方法 核酸适体与标记脲酶的单链结合,通过生物素-亲和素的特殊识别作用固定在链霉亲和素修饰的磁珠上;待检测的肿瘤VEGF标志物与适体结合形成茎环结构,使标记脲酶的单链脱落下来;经磁分离,转移上清液,加入到含一定量尿素和酚红试剂的溶液中.利用上清液中的脲酶水解尿素产生氨,使得溶液的pH值升高,导致溶液的颜色变化,通过肉眼或紫外分光光度计分析显色结果.结果 该检测体系在最佳条件下,检测VEGF的线性范围为0.1～10 pmol/L,检测限达0.06 pmol/L.并利用此体系,检测人肺癌患者血清中的VEGF浓度,其结果与ELISA方法检测出的结果基本一致.将本方法与ELISA方法同步盲法测定10例血清样本,结果显示本方法的准确率为90％,表明其具有较高的有效性和敏感性.结论 该检测方法操作简单方便,同时具有较高的灵敏度和选择性,在临床VEGF检测中具有潜在的应用前景.     

Management in the wound-care center outpatient setting of a diabetic patient with forefoot osteomyelitis using Cerament Bone Void Filler impregnated with vancomycin: off-label use

Several nonbiodegradable and biodegradable antibiotic cement delivery systems are available for the delivery of antibiotics for adjunctive therapy in the management of osteomyelitis. A major nonbiodegradable delivery system is polymethylmethacrylate beads. Antibiotics that can be incorporated into this delivery system are limited to the heat-stable antibiotics vancomycin and aminoglycosides, tobramycin being the most popular. Calcium sulfate and hydroxyapatite (Cerament Bone Void Filler) is a unique biocompatible and biodegradable ceramic bone void filler that can successfully deliver heat-stable and heat-unstable antibiotics in musculoskeletal infections. The use of Cerament as antibiotic beads has not been previously reported. An off-label case of diabetic foot osteomyelitis successfully managed with surgical bone resection and vancomycin Cerament antibiotic beads is presented. Subsequent surgery for the bone infection and staged removal of the antibiotic beads was not necessary.     

Vero细胞培养过程中球转球接种工艺的可行性研究II.静态球转球过程

研究了静态球转球接种Ｖｅｒｏ 细胞培养过程中的细胞生长特性,提出了细胞球转球的机理,通过与消化接种的比较,证明在静态球转球接种的细胞培养过程中,细胞在新球与老球表面的生长和细胞的生理状态很不平衡,因而认为不适合于大规模细胞培养过程,并对消化接种在大规模操作中的可行性进行了讨论     

Vero细胞培养过程中球转球接种工艺的可行性研究I.动态球转球过程

研究了动态球转球接种Ｖｅｒｏ 细胞培养过程中的细胞生长特性,提出了细胞球转球的机理,通过与消化接种的比较,证明在动态球转球接种的细胞培养过程中,细胞的比生长速率和增殖倍数均较低,因而认为以动态方式实现细胞球转球接种不适合于细胞的大规模培养过程。     

藻酸盐万古霉素微球制备优化评价

目的 探讨藻酸盐万古霉素缓释微球的制备与优化.方法 将不同分子结构和理化特性的藻酸盐不同配比,应用滴注法制备不同浓度万古霉素藻酸盐微球,经过冻干、低压冻干直至重量不再变化,取样微球进行裂解,取上清液在高效液相色谱仪上测定万古霉素浓度,并按公式计算包封率,对各组所得包封率数值和微球颗粒大小结果进行统计观测.结果 不同种类...     

河豚鱼基因组格式化粘粒文库的构建

目的 构建河豚鱼基因组文库,为人类基因组的研究提供资料。方法 以红鳍东方豚的精子ＤＮＡ为材料,采用含有”外显子捕获”元件的粘粒（ｓＣＯＧＨ２）作为载体,构建肖豚鱼的基因组粘粒文库。结果 该文库共有５７６００个克隆,分别被保存在６００块９６孔细胞培养板中,插入片段的大小平均为３５ｋｂ,相当于５．０个库容量,即从本文库中筛选到河豚鱼基因组任一单拷贝序列的机率为９９．２％。     

藻酸盐微球的制备及其对共培养的MSCs的影响

目的 检测藻酸盐微球对间充质干细胞生长的影响,探讨其在骨组织工程中可能的应用.方法 应用滴注法制备藻酸盐微球,检测不同浓度的藻酸盐微球pH值的动态变化及通过MTT法和流式细胞仪检测藻酸盐微球溶液中间充质干细胞的生长情况,评价藻酸盐微球对细胞的影响. 结果间充质干细胞可黏附在藻酸盐微球上生长,浓度为0.02 g/L、0.2 g/L和2.0 g/L的藻酸盐微球溶液的pH值分别在7.20、7.20和6.70左右波动,MTT法检测这3个浓度组同细胞对照组D(490)值几乎无差异,提示对间充质干细胞的生长影响不具有统计学意义.细胞周期分析显示,3 d时各组S期细胞比例均等于或大于对照组,且随着藻酸盐微球浓度的增加而增加;7 d时各组S期细胞比例与对照组相对差值在±3.15之间,0.2 g/L 组比例最高,达24.40%. 结论浓度等于或低于2.0 g/L的藻酸盐微球溶液对间充质干细胞生长影响很小,适合与之共培养进行有关研究.     

一种用于芯片质控的通用序列标签寡核苷酸探针的设计

目的设计一种带有通用序列标签的寡核苷酸探针以应用于寡核苷酸芯片点样的质量控制。方法以HIV寡核苷酸探针作为核心序列,在其一端或两端连接上多种通用序列标签（usz）构建新型探针。然后打印芯片,以Cy5标记的通用引物（Cy5-UP,与UST互补）进行杂交,筛选出5条荧光信号强的探针,重新打印芯片。再分别以不同浓度梯度的、Cy5标记的通用引物（Cy5-UP）和随机引物（Cy5-RP）与芯片杂交,比较两者杂交效率。结果Cy5-UP的杂交结果显著优于Cy5-RP的杂交结果,特别是在较低浓度时。结论利用Cy5标记的通用引物检测探针上的通用序列标签,可以为芯片点样的质量控制提供一种更有效的方法。     

小细胞肺癌免疫磁性微珠的构建及鉴定

目的 :构建能特异地与靶细胞结合并赋有磁响应性的小细胞肺癌免疫磁性微珠 ,检验其在分离微量癌细胞中的效率。方法 :将微量小细胞肺癌H12 8细胞加入到外周血单个核细胞悬液中混匀 ,再通过特异性单抗包被的免疫磁性微珠吸附、富集、免疫细胞化学鉴定。最后 ,计算癌细胞的回收率和检测敏感性。结果 :包被的小细胞肺癌免疫磁性微珠与H12 8能敏感而特异地结合。与免疫细胞化学方法结合可检出 5 4 .4 %混入外周血单个核细胞中的微量癌细胞 ,未有假阳性。结论 :免疫磁性微珠能有效地从外周血单个核细胞中分离出微量肺癌细胞 ,经进一步研究后将来可能具有较高的临床价值