一步法培养恶性疟原虫及其在体外药物试验中的应用

为了克服恶性疟原虫体外标准培养法中每天更换培养液的麻烦,作者观察了连续培养3天换1次培养液时疟原虫的生长繁殖情况。所用虫种为已经在体外培养6个月的科摩罗群岛FCPS25株恶性疟原虫。开始培养时,将含虫血用培养液制成50%混悬液,原虫率分为0.25%和0.05%两组,培养皿直径皆为35mm,每个培养皿各加0.2ml含虫血混悬液,然后再分别加入含有35mMHEPES和10%人血清的RPMI 1640培养液1.5、2.25、3、3.75 ml,连续培养3天,中间不换培养液,比较二组疟原虫的繁殖情况。结果在开始培养时原虫率为0.25%组中,各培养皿     

应用羊带绦虫活化六勾蚴体外短程孵育采集的抗原进行羔羊抗羊带绦虫的免疫接种

从带绦虫蚴体外培养采集的可溶性抗原已应用于免疫羊羔、小牛和家兔以分别抗羊带绦虫(Taenia ovis)、牛肉综虫和豆状绦虫感染。在以往的免疫研究中,作者曾选择为获取“功能抗原”所须的最长发育时间而采用了为期二周的标准体外培养周期。此种培养技术需要专门选择的特异宿主血清和每48小时更换培养液,这不仅给大规模制备疫苗抗原带来困难,也因存在宿主血清蛋白而使抗原纯化困难。近年来一些实验提示带综虫蚴可能在发育早期就释放功能抗原。本文实验     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞的实验研究

目的　体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞 (rMSC)并诱导分化为神经细胞。方法　取 4周龄健康SD大鼠骨髓 ,以percoll淋巴细胞分离液分离rMSC ,以DMEM +15 %胎牛血清 (FBS)培养 ,以 1mmol Lβ巯基乙醇 (BME)及无血清DMEM培养液处理细胞 ,免疫细胞化学鉴定诱导后细胞。结果　rMSC可以在体外大量培养扩增 ,以BME诱导后大部分rMSC分化为神经元样细胞 ,免疫组织化学染色神经元特异性烯醇化酶 (NSE)呈阳性 ,诱导后细胞可在体外生存 2周。结论　rMSC可在体外诱导分化为神经细胞并在体外存活。     

体外培养马来丝虫和彭亨丝虫感染期幼虫至第4和第5期

本文叙述用马来丝虫和彭亨丝虫感染期幼虫在体外培养至第4期和第5期获得了成功。作者所用的体外培养系统能使幼虫存活7周以上并被用作收集这些幼虫分泌、排泄和脱皮抗原的来源。由压碎东乡伊蚊所得的感染期幼虫用加有青霉素(100μ/ml)和链霉素(100μg/ml)的RPMI_(1640)。培养液洗涤3次,然后将其放入30ml容量的有螺旋帽的组织培养瓶中,添加10%灭活人AB血清和LLC-MK_2恒河猴肾细胞作为饲养层的RPMI-1640液进行培养。每瓶盛培养液5ml放入40至50条感染期幼虫并在“空气”中于37℃孵育。在无菌条件下隔天更换培养液一次,使LL-MK_2细胞系长满瓶底和瓶侧。在培养后期,培养液的pH     

体外培养的曼氏血吸虫对抗血吸虫化合物的反应

作者用体外培养方法观察了一些包括已知有效的及有关化合物对曼氏血吸虫童虫、虫龄3周的血吸虫和成虫的作用。培养液系用Earle的乳白蛋白/新生牛犊血清(1∶1)。将上述血吸虫置于2毫升培养液中培养。所试药物皆溶于二甲基亚砜,加至培养液的溶媒最大量为10微升。血吸虫于用加药的培养液培养24、48及72小时后,用显微镜观察其活动,并根据虫体活动或死亡情况评价药效。结果,血吸虫童虫对药物的敏感性较虫龄为3周的血吸虫及成虫的为大。在所筛选的400个化合物中,当药物浓度为1ppm时,有杀童虫作用的为80个(20%)。用20ppm浓度分别观察200个及125个化合物对虫龄为3周     

血清中肿瘤坏死因子对人的恶性疟原虫有细胞毒作用

选6～12周龄C3H/HeN雌雄性小鼠,静脉注射2×10~6活的牛卡介苗,14天后注射10μg细菌内毒素,收集血清,作为测定细胞毒性的卡介苗-脂多糖血清(BCG-LPS血清)。用部分纯化的肿瘤坏死因子(TNF)免疫家兔,制备TNF抗血清。用微量板培养L929鼠成纤维细胞,每井1.5×10~4L929鼠成纤维细胞,0.1mlRPMI-1640+10%灭活马血清(20μg/ml庆大霉素)。加入不同浓度的BCG-LPS血清,孵     

乙型肝炎患者骨髓间充质干细胞培养方法的优化和生物学特性

目的比较乙型肝炎患者骨髓间充质干细胞（MSCs）多种体外培养方法的效果，确定乙型肝炎患者MSCs的最佳体外培养方案；并对其生物学特性进行初步研究。方法比较2种接种方案和5种不同成分培养液的乙型肝炎患者MSCs体外培养成功率。比较5种不同成分培养液和4种换液方案的乙型肝炎患者MSCs生长曲线。进行乙型肝炎患者MSCs的形态观察和表面分子鉴定，传代培养以初步了解其生长特性。结果密度梯度离心接种法的体外培养成功率（88％）高于全骨髓接种法（76％），但差异无统计学意义。5种培养液的体外培养成功率差异有统计学意义（P〈0．01），其中患者自体血清培养液的培养成功率最高（100％），3种FBS培养液的培养成功率次之，健康成人血清培养液的最低（56％）。患者自体血清培养液的MSCs生长曲线最高，健康成人血清培养液的生长曲线最低，3种FBS培养液的MSCs生长曲线集中位于上述两者之间。以2d或者3d一次全量换液的MSCs生长曲线较高。乙型肝炎患者MSCs与正常人MSCs形态相同，表面分子表达一致，生长特性近似。结论乙型肝炎患者MSCs的体外培养方案以密度梯度离心法分离后，自体血清培养液进行培养，2～3d全量换液为佳，可以较快获得纯度较高的MSCs。乙型肝炎患者MSCs的生物学特性和正常人的近似。     

柔肝中药对体外培养软骨细胞增殖能力及关节软骨低聚基质蛋白分泌的影响

目的 探讨柔肝中药对体外培养软骨细胞增殖能力及关节软骨低聚基质蛋白（COMP）分泌的影响。方法 采用分阶段酶消化法体外培养兔软骨细胞，以2×10^4／ml密度接种3代内细胞，以Ⅱ型胶原的免疫组织化学研究鉴定细胞。给予家兔临床等效剂量灌胃后，抽取含药血清培养细胞，分别用5％、10％的柔肝方含药血清（分给药后1、3、5h3个时间点）以及正常兔血清、小牛血清干预7d，采用四甲基偶氮唑蓝（MTF）法观察中药含药血清对体外培养的软骨细胞增殖的影响；体外培养人软骨细胞，采用柔肝复方组及单味柔肝药提取物直接添加体外培养体系3d，添加终浓度为10mg／ml。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测药物对体外培养的人软骨细胞COMP分泌的影响。结果 培养细胞经Ⅱ型胶原的免疫组织化学染色后有阳性表现，在对软骨细胞增殖的影响方面，柔肝方含药血清各组均优于兔血清组和小牛血清组，其中含药血清组的3h时间点总体优于1h及5h时间点（P〈0．05）；在对软骨细胞上清COMP分泌方面，柔肝复方及单方提取物组均有促进细胞分泌COMP的作用（P〈0．05），但两组之间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 柔肝方中药含药血清可以促进体外培养软骨细胞增殖；在药物直接干预的条件下，柔肝复方及单方提取物可以促进软骨细胞分泌COMP。     

Quassinoids在体外对抗氯喹恶性疟原虫的抗疟作用

Quassinoids是类苦木植物,本文研究了它的抗疟作用。实验中采用的Quassinoids类化合物有Glaucarubinone,SoularubinoneSimalikalactone D.Chaparrinone和Simar-olide。前4种化合物以3mg/ml的浓度溶于95%的乙醇中,而后一种化合物则以1mg/ml的浓度溶解。将1ml的乙醇与9ml的不含重碳酸盐的培养液混合配成的药液,经过滤灭菌后备用。对照组以同样浓度的乙醇与培养液混合制备。所使用的疟原虫是从FVO株培育出的FCR-1/越南品系,它在体内、体外对氯喹均有抗性,使用经体外培养5个月后进行冰冻保存的原虫。另一品系是在体外对氯喹有抗性的FCR-3/冈比亚疟原虫。所用的培养液为RPMI 1640,内含25mM的Hepes缓冲液及10%的A型人血清和感染了原虫的红细胞。培养液置于平皿中或置于24孔的直径16mm的井盘中。采用平皿法时,以50%的红细胞混悬液与感染率约1%的红细胞混和,然后用培养液稀释到10%的浓度。每只平皿中倒入1ml的混合液,然后加入含药物的培养液或只加入0.5ml的培     

日本血吸虫PcDNA3.1(+)/MLP核酸疫苗的构建及其对家兔保护性免疫作用的研究

目的 体外扩增日本血吸虫中国大陆株粘蛋白样蛋白抗原的部分基因序列，构建日本血吸虫pcDNA3．1( )／MLP核酸疫苗(SJP)，免疫新西兰家兔，观察它在肌肉组织中的表达、及其对家兔的保护性免疫作用。方法 分子克隆常规操作构建SJP疫苗，免疫家兔，家兔肌肉组织体外扩增查MLP基因，并通过免疫组化观察重组蛋白在局部肌组织中的表达：做血清抗体及细胞因子分析，计算减虫率及减卵率。结果 经酶切、PCR及测序鉴定表明所构建的SJP中含有目的基因序列；免疫家兔8周后可以在免疫家兔肌肉中检测到MLP基因，免疫组化结果阳性；可诱导IgA、IgGl及INF-γ变化，减虫率为24．10％，减卵率为28．10％。结论 成功地构建了含目的基因的核酸疫苗SJP，SJP免疫家兔后，肌组织有重组蛋白的表达，并可产生一定的免疫保护性作用。     

无血清培养液在分泌鼠疫F1McAb杂交瘤细胞中的初步应用

目的应用ADCF无血清细胞培养液对分泌鼠疫F1McAb的杂交瘤细胞进行静止培养,初步了解该瘤株在ADCF中的生长情况,为今后采用无血清培养液体外培养法生产单克隆抗体提供依据。方法通过将杂交瘤细胞直接转入ADCF培养液培养、驯化培养和优化条件后培养,观察细胞在各种培养条件下的生长情况,进行活细胞计数和抗体效价检测。结果用ADCF培养鼠疫F1杂交瘤细胞,细胞直接转入不能较好的生长;通过驯化、在放过含血清培养液的原瓶中能较好的贴壁生长,在新瓶中不能稳定地贴壁生长和增殖;在经含血清的培养液优化后的培养瓶中,细胞能贴壁生长和增殖。结论ADCF培养液可用于分泌鼠疫F1McAb的杂交瘤细胞的培养。     

咪唑类和多烯对抗氯喹恶性疟的作用

本文报道两组抗霉菌药,咪唑类(咪唑-哌嗪和miconazole)和多烯(二性霉素乙)在体外对氯喹敏感株(洪都拉斯I/CDC)和抗氯喹株(印度支那I/CDC)恶性疟原虫的作用。在方法上,作者对Trager等的48小时法作了改进,并采用多井组织培养板测定。培养液RPMI 1640内含0.2%碳酸氢钠,25mM HEPES缓冲剂及10%人血清。每井加入9%用贮藏了21～28天的O型红细胞制备的阳性红细胞悬液0.5ml,置37℃孵育室内培养24小时,然后与含有药物的培养液接触,隔24小时换液一次。接触96小时后换成不含药的培养液,再培养48～96小时。于     

应用脐带血清和红细胞体外培养恶性疟原虫的研究

本文参照Traget-Jensen蜡烛缸培养法,探讨了用新生儿脐带血清和红细胞体外培养恶性疟原虫的效果,并与用正常成人血清和红细胞培养进行了比较。 实验用含脐带血清的培养液长期培养恶性疟原虫8次,每次培养30～60d不等,每培养3～4d加新     

一种体外分析系统对有效抗疟药的鉴定

本文介绍采用体外培养技术,根据~3H标记的次黄嘌呤摄入疟原虫核酸的情况,测定药物抗疟作用的方法。体外培养采用改良的Nguyen-Dinh和Trager蜡烛缸法。恶性疟原虫是对氯喹有一级抗性的FCR_(8TC)株和敏感的洪都拉斯株。塑料微量板分24井和96井两种。在24井板中,先加入20μl含50%红细胞而原虫密度为0.2～0.3%的混悬液,然后用含血清和不同浓度药物的RPMI1640加至500μl;在96井板中,先加入20μl含10%红细胞而原虫密度为1%的混悬液,再用上述含药及血清的培养液加至200μl,分别置于37℃的蜡烛缸中连续培养48小时,并计数此时的原     

用无菌生长的Laredo株溶组织内阿米巴制备的家兔抗血清的抗原结合力的放射免疫分析

为了阿米巴病的血清诊断的需要和研究抗原株的变异性,作者在本文中报告了一种用成倍的抗体系统对家兔阿米巴抗血清的抗原结合力的放射免疫定量分析。以溶组织内阿米巴Laredo株为抗原,按Diamand法无菌培养。I~(125)标记的Laredo抗原是按照Aono等描述的测定法改良的。用Laredo抗原免疫家兔取得抗血清。抗血清用磷酸缓冲盐水(PBS)从1:25稀释至1:50再开始成倍稀释;同时将2%正常兔血清通过10个试管作成倍稀释。试验时将0.5毫升血清加0.3毫升pH7.8的PBS、0.1毫升0.1克分子二胺四乙酸、0.1毫升I~(125)标记抗原于37℃作用1小时,然后再置于4℃     

大肠癌患者外周血来源树突状细胞对T细胞活化作用的研究

目的比较无血清培养液AIM-V和RPMI1640 胎牛血清(FBS)培养液培养大肠癌患者外周血来源树突状细胞(DCs)的形态和免疫表型,检测DCs对T细胞的活化作用。方法对2003年3月至2004年10月首都医科大学附属北京朝阳医院消化内科收治的10例大肠癌患者,采集其外周血分离单核细胞,分别使用2种细胞培养液进行体外培养。观察细胞形态,检测细胞表面CD1a,CD80,CD86,CD83,CD14及HLA-DR的表达。再用丝裂霉素作用后的DCs作为刺激细胞,按照刺激细胞反应细胞(S∶R)1∶1,1∶10,1∶20,1∶40,1∶80的比例进行同种异体混合淋巴细胞反应(MLR),检测DCs刺激同种异体T细胞增殖的能力。结果大肠癌患者外周血单核细胞经2种细胞培养液培养后都可以诱导出DCs。细胞外型均呈毛刺状。细胞均表达CD1a、CD80、CD86和人类白细胞抗原(HLA-DR),不表达CD14、CD83,为不成熟DCs的特点。两组DCs细胞表型表达差异无显著性(P>0.05)。按S∶R不同比例进行同种异体MRL所得刺激指数分别为2.7,4.1,3.1,2.5,1.6,表明树突状细胞(DCs)在不同比例下都刺激T细胞增殖。结论使用AIM-V无血清培养液和传统的含FBS细胞培养液均可成功诱导培养大肠癌患者外周血来源的DCs,但使用AIM-V可以降低含血清培养液应用人体后引起的过敏反应等风险,更适合DCs的临床使用,可以替代含血清培养液。MLR结果显示,DCs在各种S∶R比例下均有刺激T细胞增殖的能力,但S∶R比为1∶10时最佳。     

HCV体外感染正常成人肝细胞的初步研究

由于无理想的体外实验模型 ,丙型肝炎的治疗和疫苗研究无突破性进展。现为进一步研究丙型肝炎免疫发病机制 ,感染后肝细胞代谢功能改变、临床治疗和疫苗研制提供了最接近自然感染状态的理想细胞模型。取意外死亡的正常成人肝组织标本 ,用体外二步灌流法分离上述肝细胞并用ＰＲＭＩ 1640细胞培养液维持培养 1个月以上。用丙型肝炎患者血清感染上述分离的正常成人肝细胞 ,同时设立空白、正常对照 ,于感染后 2ｄ起每 2～ 4ｄ收集细胞爬片、细胞悬液及培养细胞上清液标本 ,并用免疫组织化学法和逆转录 聚合酶链反应 (ＲＴ ＰＣＲ)法检测肝细胞…     

犬恶丝虫感染期幼虫的体外培养

本文比较了犬恶丝虫在3种培养液中的发育情况。犬恶丝虫的感染期幼虫来自阳性埃及伊蚊,处理后接种于下列3种培养液中:(A)含10%人AB型血清,采用HEPES进行缓冲的RPMI 1640。(B)含有机酸(100ml内含失水苹果酸67mg、琥珀酸6mg和α-酮戊二酸37mg、糖(100ml内含葡萄糖70mg和蔗糖2668mg)和10%胎牛血清的TC-199培养液(C)含10%胎牛血清的Grace昆虫培养液。血清在加热灭活后加入培养液。培养液中加入苄青霉素和链霉素并调节pH值为7.2～7.4。以10～12条感染期幼虫培养于盛     

肾上腺髓质素对缺氧性肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

为了探讨肾上腺髓质素 (ＡＭ)在缺氧性肺动脉高压的作用 ,我们检测了ＡＭ对缺氧培养的肺动脉平滑肌细胞(ＰＡＳＭＣ)增殖的影响。材料与方法　ＰＡＳＭＣ获取与培养 :健康成年猪 ,体重12 0ｋｇ ,在无菌条件下取出肺动脉干 ,用组织贴块法进行原代和传代培养 ,实验用第 1～ 2代细胞 ,分别接种于 96孔板 ,10 0μｌ/孔或接种于装有盖玻片的 2 5ｍｌ培养瓶中 (1ｍｌ/瓶 ) ,培养2 4ｈ后换无血清培养液 ,静息 2 0ｈ ,换含 2 0ｍｌ/Ｌ小牛血清的培养液后分组培养。常氧组 :培养液不含ＡＭ ,于体积分数为5 %ＣＯ2 、95 %空气 ,常氧条件下培养。缺氧组…     

针刺血清对体外培养破骨细胞凋亡的影响

目的观察正常大鼠及去卵巢模型大鼠针刺血清对体外培养新生大鼠破骨细胞凋亡的影响。方法将60只12月龄雌性SD大鼠随机分为正常针刺组、正常对照组、假手术组、模型组、针刺预防组和针刺治疗组,制备针刺血清和对照血清。自新生SD大鼠四肢长骨分离破骨细胞,加含10%针刺血清或对照血清的DMEM培养液培养48h后,流式细胞术检测破骨细胞凋亡情况。结果与正常对照组大鼠血清比较,正常针刺组血清使破骨细胞凋亡率提高0.6%。模型组与假手术组比较,破骨细胞凋亡率降低4.0%,针刺预防组和针刺治疗组与模型组比较,破骨细胞凋亡率分别提高了5.4%和1.5%。结论针刺具有促进破骨细胞凋亡的作用。