小干扰RNA(siRNA)对小鼠乙型肝炎病毒复制和表达影响的实验研究

目的建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,并在此基础上观察小干扰RNA(siRNA)对小鼠乙型肝炎病毒复制和表达的影响。方法用水动力学方法,向小鼠尾静脉注射1.5倍的HBV真核表达质粒pHBV1.5建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染模型,明确感染后,再将其与针对乙型肝炎病毒核心区的siRNA表达载体(psiHBV4)共注射,于注射后第6天取血测血清HBsAg,HBeAg(MEIA),通过RT-PCR检测肝组织HBVC区mRNA转录子的水平。同时设立PBS对照组,空载体对照组和无关干扰对照组。结果注射后第6天血清中HBsAg,HBeAg在pHBV1.5感染组中高表达。psiHBV4干扰组中HBeAg的表达受到了明显的抑制,与感染组比较差异有显著性(P<0.01),RT-PCR显示肝内HBVCmRNA水平亦明显降低。而无关干扰对照组则无相应的干扰作用。结论RNAi能特异,高效的抑制小鼠体内HBV的复制和表达,同时通过水动力学方法,成功建立了小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,为进一步研究乙型肝炎病毒奠定了基础。     

慢病毒载体携带siRNAs对乙型肝炎病毒抑制作用的体内研究

目的:建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染动物模型,在此基础上观察慢病毒载体携带小干扰RNA (small interferingRNAs,siRNAs)对乙型肝炎病毒(HBV)复制和表达的影响.方法:36只Balb/c小鼠随机等分为3组(n=12):①空白对照组(NC组):通过尾静脉注射pTHBV2(包含HBV全基因组真核表达质粒).建立小鼠急性HBV感染模型;②干扰组(E组):将pTHBV2与pWPT-HBV-siRNA1(携带靶向HBV S区的siRNA1的慢病毒)通过尾静脉共注射小鼠;③无关干扰组(I组):pTHBV2和pWPT-HBV-siRNA2(携带非靶向HBV的无关siRNA2的慢病毒)通过尾静脉共注射小鼠.于注射后第4大和第7天取小鼠血清和肝脏组织.采用ELISA法检测血清中HBsAg(HBV表面抗原);选择逆转录聚合酶链反应方法(RT-PCR)检测肝组织HBVS-mRNA水平;用免疫组织化学法检测肝组织HBcAg(HBV核心抗原)和HBsAg.结果:与NC组比较,E组小鼠血清中HBsAg水平在第4和第7天分别下降89.76%和94.81%(P<0.01);RT-PCR结果提示E组肝组织HBV S-mRNA水平明显降低(P<0.05);免疫组织化学法检测结果显示示E组肝组织HBcAg、HBsAg阳性细胞数明显减少(P<0.05).I组与NC组比较,上述检测指标无统计学差异(P>0.05).结论:慢病毒载体携带siRNAs能够显著抑制小鼠体内HBV的复制和表达,并儿抑制作用在第7天较第4天更强.没有减弱的趋势.     

人白介素22对刀豆蛋白A致小鼠急性肝损伤的保护作用

目的建立小鼠急性肝损伤模型,分析和评价人白介素22在小鼠急性肝损伤模型中的保护作用。方法利用刀豆蛋白A致小鼠急性肝损伤模型,分析并评价模型效果。在此基础上将雌性小鼠随机分为正常组、保护组及模型组;保护组和模型组分别尾静脉注射重组IL-22蛋白和生理盐水6h后,尾静脉注射ConA致小鼠急性肝损伤,正常组尾静脉注射等量生理盐水。16h后检测小鼠血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）活性,同时取小鼠肝组织进行病理学检查。结果IL-22能明显降低小鼠血清的ALT、AST水平,减轻ConA对肝组织的病理损伤。结论IL-22对ConA致小鼠肝损伤具有保护作用。为进一步研究其保护作用机制奠定了基础。     

双表达小干扰RNA抑制小鼠体内HBV感染

目的运用水压法复制HBV小鼠急性模型,用于研究双表达siRNA在小鼠体内对HBV复制的抑制作用。方法使用HBV质粒DNA对BALB/c小鼠进行尾静脉大剂量快速推注,获得急性HBV体内表达模型。同时使用相同方法对推注后的小鼠进行RNAi干预。对不同处理组动物的HBsAg、HBeAg、HBcAg和HBV DNA进行ELISA、免疫组织化学和实时定量RT-PCR检测。结果水压法复制HBV小鼠急性模型与HBV DNA感染剂量无明显相关。与单表达siRNA相比较,双表达siRNA对HBV抗原表达抑制较为明显。结论双表达siRNA不失为一种体内抑制HBV感染的一种策略。     

小鼠抗GBM肾炎模型的复制与鉴定

目的 为研究人类新月体性肾炎的发病机制,建立小鼠抗肾小球基底膜（GBM）肾炎的动物模型.方法 60只健康昆明小鼠随机分为肾炎模型组和正常对照组.肾炎模型组小鼠一次性尾静脉注射兔抗小鼠GBM血清（16 ml/kg）,正常对照组注射等量正常兔血清.肾炎模型组小鼠尾静脉注射兔抗小鼠GBM血清前1周,背部皮内注射正常兔血清进行预免疫.于兔抗小鼠GBM血清注射后第7、14、21、28天取尿液、血清、肾组织标本,检测尿蛋白、血肌酐、血尿素氮含量,观察肾组织病理变化.结果 肾炎模型组小鼠注射兔抗小鼠GBM血清后,第2天蛋白尿、血肌酐和血尿素氮含量均明显升高,于第14天尿蛋白浓度达到高峰,而血肌酐和血尿素氮含量仍持续上升.肾炎模型组肾组织病理表现为：第7天大量炎症细胞浸润;第21天 GBM增宽增厚,足突融合,大量免疫复合物沉积,内皮细胞及系膜细胞显著增生,新月体形成.结论 成功建立了小鼠抗GBM肾炎模型.     

两种方法建立小鼠抗GBM肾炎模型的比较

目的探讨建立小鼠抗肾小球基底膜（GBM）肾炎模型的方法。方法72只昆明小鼠随机分为3组,肾炎模型A组、B组和正常对照组。肾炎模型A、B组小鼠一次性尾静脉注射兔抗小鼠GBM血清（16ml／kg）,正常对照组小鼠注射等量正常兔血清。肾炎模型A组小鼠尾静脉注射兔抗小鼠GBM血清前1周,背部皮内注射正常兔血清进行预免疫;肾炎模型B组小鼠尾静脉注射兔抗小鼠GBM血清后24h,尾静脉注射脂多糖（1mg／kg）。于实验第7、14、21、28天取尿液和血清标本,分别检测尿蛋白、血肌酐、血尿素氮含量。并于上述时间点分别取。肾组织观察病理变化。结果。肾炎模型组小鼠注射兔抗小鼠GBM血清后,第7天尿蛋白、血肌酐和血尿素氮含量均明显升高,均高于正常对照组,且A组升高更明显（P〈0．05）。肾组织病理表现为：。肾炎模型A组肾小球基底膜明显增厚,系膜区大量电子致密物沉积,足突融合;壁层上皮细胞增生,大量新月体形成,肾小球囊腔变窄,并可见肾小球纤维化形成,其病变程度均高于肾炎模型B组。正常对照组小鼠肾组织无明显病理变化。结论免疫球蛋白预免疫法可以更好地建立小鼠抗GBM肾炎模型。     

Con A诱导急性免疫性肝损伤Wistar大鼠模型的构建

【目的】探讨刀豆蛋白A(Con A)诱导急性免疫性肝损伤Wistar大鼠模型的剂量和注射途径。【方法】(1)按不同剂量Con A尾静脉注射分组:将42只雌性Wistar大鼠随机分为A、B、C、D、E、N组,每组7只。N组为空白对照组,大鼠尾静脉注射生理盐水。A、B、C、D、E组大鼠尾静脉注射Con A,剂量分别为4、8、16、30、40 mg/kg。注射后第8 h,检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)及细胞因子白细胞介素(IL)-2、IL-10、干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达水平,采用苏木素—伊红(HE)染色法观察肝组织病理变化。(2)按Con A不同注射途径分组:将21只Wistar大鼠随机分为正常对照组、腹腔注射组、尾静脉注射组,每组7只,尾静脉注射组和腹腔注射组分别经尾静脉和腹腔注射16 mg/kg Con A。注射后第8 h,检测血清ALT、AST、ALB水平。【结果】实验结束时Con A各剂量组大鼠非正常死亡数:A、B、C组0只,D组2只,E组7只。A、B组的肝组织可见少量点状坏死,炎性细胞浸润,小叶结构基本完整;C、D组可见明显的桥接样坏死。尾静脉注射组大鼠血清ALT、AST、ALB水平显著升高,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。【结论】尾静脉注射16 mg/kg Con A可成功诱导Wistar大鼠急性免疫性肝损伤模型。     

LBP抑制肽对内毒素诱导的脓毒血症小鼠的保护作用

目的 研究脂多糖结合蛋白抑制肽(P12)对内毒素脂多糖(LPS)诱导的脓毒血症小鼠TLR4、CD14及肿瘤坏死因子a(TNFa)表达和小鼠生存率的影响.方法 40只小鼠随机分为5组:对照组、内毒素血症组、低剂量P12组、中剂量P12组和高剂量P12组,每组8只.腹腔内注射LPS复制脓毒血症模型,尾静脉注射P12,蛋白定量方法 (Western blot)检测TLR4和CD14蛋白的表达,ELISA法检测小鼠血清中TNF-a的含量.结果 抑制肽组TLR4和CD14蛋白的OD值较LPS组低,较正常组高.脓毒血症组小鼠血清中TNF-a的含量显著高于对照组[(180.17±39.14)pg/mL比(24.88±5.82)pg/mL,P<0.01];低剂量P12组、中剂量P12组和高剂量P12组血清中TNF-a的含量分别为(112.69±19.78)、(86.34±9.25)和(70.48±8.48)pg/mL,均明显低于脓毒血症组(均P<0.05).结论 脂多糖结合蛋白抑制肽通过抑制由TLR4和CD14介导的LPS跨膜信号转导,降LSP诱导的TNFa的释放,提高了脓毒血症小鼠的生存率.表明脂多糖结合蛋白抑制肽对急性肺损伤或脓毒血症可能具有潜在的预防和早期治疗作用.     

四氯化碳致小鼠急性肝损伤模型的研究

目的：通过追踪观察模型小鼠肝损伤程度,筛选四氯化碳（CC l4）致昆明种小鼠急性肝损伤模型的最佳剂量。方法：采用随机对照分组的方法,对各模型组的昆明种小鼠给予不同剂量的CC l4,进行腹腔注射,检测血清ALT、AST水平,并观察肝组织病理变化。结果：与正常组相比,CC l4高浓度组（0.3%）和中浓度组（0.2%）显著升高血清中ALT和AST的活力（P〈0.05）。结论：0.2%10m l/kg为CC l4致昆明种小鼠急性肝损伤模型较好的剂量。     

亲和软胶囊降糖及降脂作用实验研究

目的:观察亲和软胶囊的降血糖、降血脂作用.方法:实验分别选用腹腔注射高浓度葡萄糖和尾静脉注射四氧嘧啶法复制小鼠高血糖模型,采用腹腔注射75%新鲜蛋黄乳液复制小鼠高脂血症模型,采用灌胃10 mL/kg脂肪乳复制大鼠高脂血症模型,观察了亲和软胶囊的降血糖、降血脂作用.结果:亲和软胶囊能显著降低两种高血糖小鼠模型的血糖值,降低高脂血症模型小鼠血清中TC、TG的含量和模型大鼠血清中TC、TG、LDL-C和MDA的含量,且大鼠血清中HDL-C的含量和SOD的活性也有明显升高,与模型组相比,具有显著性差异(均P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001).结论:亲和软胶囊具有一定降低血糖、降血脂作用,其降脂作用可能与抑制血液内异常升高的脂质过氧化物含量,减少氧自由基的损伤有关.     

Inhibition of HBV replication by VPS4B and its dominant negative mutant VPS4B-K180Q in vivo

This study examined the anti-hepatitis B virus (HBV) effect of wild-type (WT) vacuolar protein sorting 4B (VPS4B) and its dominant negative (DN) mutant VPS4B-K180Q in vivo in order to further explore the relationship between HBV and the host cellular factor VPS4. VPS4B gene was amplified from Huh7 cells by RT-PCR and cloned into the eukaryotic expression vector pXF3H. Then, the VPS4B plasmid and the VPS4B-K180Q mutation plasmid were constructed by using the overlap extension PCR site-directed mutagenesis technique. VPS4B and HBV vectors were co-delivered into mice by the hydrodynamic tail-vein injection to establish HBV vector-based models. Quantities of HBsAg and HBeAg in the mouse sera were determined by ElectroChemiLuminescence (ECL). HBV DNA in sera was measured by real-time quantitative PCR. Southern blot analysis was used to assay the intracellular HBV nuclear capsid-related DNA, real-time quantitative PCR to detect the HBV-related mRNA and immunohistochemical staining to observe the HBcAg expression in the mouse liver tissues. Our results showed that VPS4B and its mutant VPS4B-K180Q could decrease the levels of serum HBsAg, HBeAg and HBV-DNA. In addition, the HBV DNA replication and the mRNA level of HBV in the liver tissues of treated mice could be suppressed by VPS4B and VPS4B-K180Q. It was also found that VPS4B and VPS4B-K180Q had an ability to inhibit core antigen expression in the infected mouse liver. Furthermore, the anti-HBV effect of mutant VPS4B-K180Q was more potent than that of wild-type VPS4B. Taken together, it was concluded that VPS4B and its DN mutant VPS4B-K180Q have anti-HBV effect in vivo, which helps develop molecular therapeutic strategies for HBV infection.     

shRNA表达质粒对转基因小鼠HBV的抑制作用

目的观察shRNA表达质粒对转基因小鼠HBV的抑制作用。方法将质粒DNA采用Hydrodynamic技术注入HBV转基因小鼠体内,观察血清ALT和AST水平、血清HBsAg和肝组织HBcAg表达和HBVmRNA的变化。结果在注射质粒后,ALT和AST呈一过性升高,3天后降至正常;血清HBsAg和肝细胞内HBcAg表达减少,蛋白抑制至少持续14天;质粒注射后第5天,实验组肝脏HBVmRNA与注射前相比明显减少,而对照组HBVmRNA信号无明显变化。结论shRNA表达质粒对HBV转基因小鼠HBV有抑制作用。     

抑制LSD1酶活性对HBV模型小鼠的作用

目的研究组蛋白赖氨酸去甲基化酶1（LSDl）酶活性下降对乙型肝炎病毒（HBV）模型小鼠的作用。方法尾静脉高压注射重组HBVl．3质粒建立HBV小鼠模型;将雌性BALB／c小鼠随机分为正常组、模型组、LSDl小干扰RNA（siRNA）处理组和反苯环丙胺（TCP）治疗组。取各组小鼠外周血,通过酶联免疫吸附试验、全自动微粒子化学发光法和Real—TimePCR检测小鼠体内乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）和HBVDNA的表达;免疫组织化学法检测HBsAg在肝脏中的分布;Western blotting检测小鼠脾淋巴细胞LSDl的表达。结果HBV模型小鼠造模成功;LSDlsiRNA处理组和TCP治疗组小鼠HBsAg、HBVDNA和LSDl的表达水平均较模型组明显下降（P〈0．01）,肝组织中HBsAg的分布也明显减少。结论抑制LSDl酶活性对HBV模型小鼠体内HBV的清除有一定的作用。     

应用RNA干扰治疗小鼠急性乙型肝炎病毒感染

目的建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,在此基础上观察小干扰RNA(siRNA)对HBV复制和表达的影响。方法通过尾静脉注射1.3倍的HBV真核表达质粒pHBV1.3建立小鼠急性乙型肝炎感染模型,再将其与针对乙型肝炎病毒核心区的siRNA表达载体(pSI C)共注射,于注射后第6天取血测血清HBsAg(ELISA),做肝组织HBcAg免疫组化,通过RT PCR检测肝组织HBVC区mRNA转录子的水平。同时设立PBS对照组、无关干扰组与突变干扰组。结果转染后第6天血清HBSAg在pHBV1.3感染组中高表达(A值为4.08～9.04,平均值为5.07±1.07,A值≥2.1为阳性),肝内HBcAg阳性率为5%～10%;pSI C干扰组HBSAg,HBcAg的表达均受到抑制,血清HBsAg阴性,A值为0.04～1.5,平均值为0.62±0.59,与感染组相比有显著性差异(P<0.01),肝内HBcAg几乎无表达,RT PCR示肝内HBVCmRNA水平明显降低。而无关干扰pGFP及突变的干扰序列pSI Cmut则无此作用。结论RNAi技术能特异,高效地抑制小鼠体内HBV的复制和表达,提示siRNA作为一种新型抗病毒药物的巨大潜能,而通过水动力法建立的小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,一定程度上解决了长期以来缺乏合适的HBV感染动物模型的问题,为今后进行药物筛选及抗病毒治疗的研究拓展了新的思路。     

PreS1Ag与HBcAg检测在诊断乙肝病毒复制的意义

目的分析乙型肝炎病毒（HBV）前S1抗原（PreS1Ag）、核心抗原（HBcAg）与HBV DNA之间的关系,探讨对判断乙肝病毒的复制与指导乙肝的治疗的意义。方法收集门诊和住院乙型病毒性肝炎患者血清标本435例,检测血清乙肝标志物（两对半）、PreS1Ag、HBcAg及HBV DNA,统计分析其中的HBV DNA≥103拷贝/ml（HBV DNA阳性）的393例。结果在HBV DNA阳性393份标本中PreS1Ag、HBcAg和HBeAg表达阳性率分别为83.7%（329/393）,44.3%（174/393）与52.5%（205/393）。PreS1Ag的阳性表达率最高,与HBcAg和HBeAg的表达阳性率差异有统计学意义（P〈0.05）。而HBcAg和HBeAg的表达阳性率无统计学差异（P〉0.05）,PreS1Ag阳性标本中的,HBcAg阳性和阴性百分率的差异有统计学意义（P〈0.05）。结论检测PreS1Ag和HBcAg与HBV DNA关系密切,反映乙肝病毒复制状况。建议在传统两对半的基础上联合检测PreS1Ag和HBcAg。     

利用纳米和RNA干扰技术抑制HBV-DNA 在HepG2 2.2.15细胞中的复制和表达

目的：通过RNA干扰和纳米技术抑制HBV-DNA在体外的复制和HBV核心抗原的表达。方法：制备靶向HBV核心抗原（HBcAg）的纳米小干扰RNA（siRNA）,利用U6启动子质粒转染入HepG2 2.2.15细胞;RT-PCR和Western印迹检测转染细胞HBV核心抗原在mRNA和蛋白水平的表达情况;real-time PCR 检测上清液HBV-DNA,放射免疫法检测细胞HBV表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）、核心抗原（HBcAg）。结果：成功构建了含磁性纳米的siRNA质粒;多种方法检测均显示转染后的细胞HBV核心抗原表达明显下降;其表面抗原、e抗原和HBV-DNA值均较对照组降低。结论：RNA干扰联合纳米技术可明显下调HBV核心抗原的表达,抑制HBV-DNA复制。     

Specific anti-viral effects of RNA interference on replication and expression of hepatitis B virus in mice

HHepeaptaitdisan Bv ivriidruase.is HthBeV p riontofetcyptieon m eism obnere o off t hthee fa mmoilsytcommon and severe viral infections because infectedindividuals are at high risk of developing liver cirrhosis,and eventually,hepatocellular carcinoma.While aneffective vaccine is available,present treatment regimentsfor hepatitis B are costly and often have limit of effects.Only about one-third of patients treated with alphainterferon show a sustained response.Nucleosideanalogues do not elimi…     

抗HBe阳性慢性肝炎患者的HBV感染状态研究

本文结合肝内HBsAg与HBcAg的表达情况对15例抗-HBe阳性慢性肝炎患者进行了肝细胞内HBV DNA原位杂交分析。发现其HBV感染状态可分为3种类型;①HBV活动复制型(4例,26.7％),肝内HBV DNA、HBsAg、HBcAg三者或HBsAg、HBcAg阳性;②HBV不完全复制或表达型(8例,53.3％),肝内HBV DNA、HBsAg阳性;③HBV非复制型(3例,20.0％),肝内HBV DNA及HBV标志均阴性。提示:在血清HBeAg向抗-HBe转换的病例中,HBV感染状态不尽相同,部分患者仍存在HBV活动性复制,少数病例的HBV复制已停止,半数病例处于由活动性复制相向非复制相过渡阶段。     

慢性乙型肝炎患者肝组织内HBcAg表达的临床研究

目的 探讨慢性乙型肝炎（CHB）患者肝组织内HBcAg的表达与肝组织的炎症、纤维化程度、血清中的HBV DNA、HBsAg以及HBeAg定量之间的关系。方法 选择安徽医科大学第一附属医院2013年3月至2014年3月收治的103例CHB患者,按病理学结果分为S1组（36例）和S2~3组（67例）。利用免疫组化技术检测肝细胞内HBcAg的表达,同时利用FirbScan仪器测定患者的肝纤维化程度。结果 在S2~3组中,肝组织HBcAg的表达与血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg水平及肝纤维化指标均呈现显著的相关性（P<0.05）,在S1组中均无显著相关（P>0.05）。结论 HBcAg在肝细胞中的表达与机体血清中DNA、HBsAg、HBeAg水平及无创肝纤维化程度存在一定的相关性。