Fas配体在髓系白血病细胞中的表达及功能研究

为了解Fas配体 (FasL)在髓系白血病细胞中的表达水平及其诱导Fas+敏感细胞发生凋亡的功能 ,用流式细胞术检测 38例髓系白血病患者 (外周血白细胞 >10 0× 10 9/L)的白血病细胞在新鲜分离及IL 2和IFN γ刺激后表面膜FasL的表达水平 ,将白血病细胞 ( 1× 10 6/ml)与Jurkat细胞 ( 1× 10 5/ml)混合培养 2 4小时后 ,用DNA电泳和流式细胞术双标法检测Jurkat细胞发生凋亡的情况。结果表明 :白血病细胞表面FasL表达量 ( 3.5 9± 1.0 5 ) %高于正常人 ( 0 .36± 0 .16 ) % ,P <0 .0 0 1,经IL 2和IFN γ刺激后其表达量明显增加 ( 7.78± 3.4 0 ) % ,P <0 .0 1;白血病细胞刺激前后诱导Jurkat细胞发生的凋亡率分别为 ( 8.2 8± 1.6 1) % ,( 10 .73± 2 .16 ) % ,差异具有显著性意义。结论 :FasL在髓系白血病细胞表面高表达且对Fas+的敏感细胞具有杀伤功能 ,推测Fas/FasL途径可能在白血病的“免疫逃逸”中发挥作用     

通过Fas-FasL途径体外清除小鼠同种异体反应性T细胞

目的　通过Fas Fas配体 (FasL)途径清除小鼠同种异体反应性T细胞 (ARTC) ,为减轻异基因骨髓移植 (allo BMT)后的移植物抗宿主病探索新的手段。方法　用磁性细胞分离系统分离BALB c小鼠 (H 2 d)Sca 1+早期造血细胞 (HC) ,然后借助逆转录病毒基因转移技术对其转染外源小鼠FasL(mFasL)cDNA基因 ;扩增 1周后与异基因BAC小鼠 (H 2 d ×b)脾细胞进行单向混合淋巴细胞培养(OWMLC) 6d ,观察处理后的BAC小鼠脾细胞对Na251 CrO4标记的BALB c小鼠脾细胞的杀伤作用。结果　成功分离出BALB c小鼠Sca 1+HC ,纯度为 (89.0± 6 .1) %。BAC小鼠脾细胞与转染外源mFasL的BALB cHC以 1∶5比例共培养 6d后 ,对BALB c源脾细胞杀伤率在不同效、靶比例时均呈显著降低 (P<0 .0 1)。结论　体外反应中 ,转染外源mFasLcDNA并高表达的早期HC可清除针对自身MHC抗原的ARTC。     

骨髓增生异常综合征患者骨髓CD34+细胞 Fas,FasL及Bcl-2的表达和凋亡

为了观察骨髓增生异常综合征 (MDS)患者骨髓CD34+ 细胞Fas ,FasL和Bcl 2的表达和凋亡情况并探讨这些抗原的表达和细胞凋亡的关系。采用流式细胞术测定了 2 6例MDS和 10例急性髓系白血病 (AML)患者及 6例非血液病患者 (对照 )骨髓CD34+ 细胞的Fas,FasL和Bcl 2表达率和细胞凋亡率。结果显示 ,各型MDS患者CD34+ 细胞Fas和FasL表达率较对照组明显增加 (P <0 .0 1) ,Bcl 2的表达率除难治性贫血 /环形铁粒幼细胞性难治性贫血 (RA/RAS)与对照组无显著差异 (P >0 .0 5 )外 ,难治性贫血伴有原始细胞增多 (RAEB)和转变中的难治性贫血伴原始细胞增多 (RAEB t)患者均明显高于对照组 (P <0 .0 1) ;各型MDS间CD34+ 细胞Fas的表达率相近 ,而Bcl 2的表达率却存在非常显著性差异 ,即RA/RAS 相似文献   

CD4+T细胞细胞因子测定及在SLE治疗中的意义

目的　研究外周血CD4+ T细胞细胞因子测定对SLE患者治疗及疗效监测的意义。方法　 37例SLE患者和15例对照组应用流式细胞仪测定外周血IFN γ、IL 2和IL 4在CD4+ T细胞内的分泌。结果　活动期SLE患者IFN γ和IL 2在CD4+ T细胞的表达率较正常对照组显著降低 (P <0 .0 1) ,IL 4在CD4+ T细胞的表达率与对照组比较无明显差异 (P >0 .0 5 )。静止期SLE患者IFN γ、IL 2和IL 4在CD4+ T细胞的表达率与对照组比较无明显改变 (P >0 .0 5 )。IFN γ和IL 2降低的SLE患者发病年龄小 ,病情较重。结论　CD4+ T细胞细胞因子的测定可用于指导SLE患者的治疗及疗效监测。     

脐血造血干/祖细胞表面CD95/Fas抗原和Bcl-2的表达和功能研究

对人脐血干 /祖细胞表面CD95 /Fas抗原及Bcl 2的表达和功能特征进行了研究。新鲜分离的脐血CD34+细胞表达低水平CD95 ,体外培养中联合应用细胞因子如SCF和FL可上调CD95表达 ,负调控因子例如肿瘤坏死因子 α(TNF α)和干扰素 γ(IFN γ)可进一步增加其表达量。将CD34+ 细胞与抗 CD95单克隆抗体共同孵育 ,通过活细胞记数、流式细胞术、集落形成细胞 (CFU C)及长期培养启动细胞 (LTC IC)的分析 ,研究了CD95介导的功能特性。抗 CD95单抗与TNF α或IFN γ组合条件下 ,活细胞记数和CFU C计数分别为 31.9± 11.2和 4 3± 2 .0 ,LTC IC生成受到抑制 ,细胞凋亡率为 4 2 .9± 12 .4。而抗 CD95单抗在无细胞因子存在条件下或抗 CD95单抗与早期效应细胞因子SCF和FL组合条件下诱导的凋亡率很低。细胞浆内增加的Bcl 2水平和脐血CD34+ 细胞表面CD95的关系表明Bcl 2可能对CD95介导的CD34+ 细胞的凋亡起保护作用。     

小鼠急性粒-单核白血病WEHI-3细胞表面免疫应答分子的表达与Fas配体功能研究

为了研究小鼠急性粒-单核白血病细胞株WEHI-3细胞表面免疫应答分子Fas、Fas配体(FasL)、CD80分子表达以及FasL的功能,应用流式细胞术检测WEHI-3细胞表面Fas、FasL和CD80分子表达情况,同时采用氚胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法检测FasL功能。结果表明:WEHI-3细胞表面CD80和Fas表达率分别为(5.06±0.41)%、(6.75±2.31)%(n=5),但FasL表达率高达(63.73±5.23)%(n=5),当WEHI-3(效应细胞,E)和Fas+YAC-1细胞(靶细胞,T)以3∶1、10∶1和30∶1混合培养时,YAC-1细胞的凋亡率分别为(26±4.5)%,(35±3.2)%和(43±2.7)%(n=5)。结论:WEHI-3细胞高表达FasL,低表达Fas和CD80,并能诱导Fas+YAC-1细胞凋亡。     

慢性阻塞性肺疾病患者T淋巴细胞亚群凋亡与Fas、FasL、Bcl-2表达的关系

目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+T细胞凋亡状态及其细胞表面Fas、FasL、Bcl-2抗原的表达,以探讨T淋巴细胞亚群凋亡不足/过度与这些抗原表达的关系。方法选取急性加重期(AE-COPD)及稳定期COPD患者30例,另设正常对照组20例,采用流式细胞仪测定外周血T淋巴细胞亚群细胞凋亡率及其表面Fas、FasL、Bcl-2抗原表达水平。结果 (1)与正常对照组相比,COPD急性加重期及稳定期患者CD4+T凋亡率均增加,CD8+T凋亡率均降低,P<0.05;与COPD稳定期相比,COPD急性加重期患者CD4+凋亡率增加,CD8+凋亡率降低,P<0.05;(2)与正常对照组相比,COPD急性加重期及稳定期患者CD4+Fas、CD4+FasL的表达均增加,CD4+Bcl-2表达降低,P<0.01;与COPD稳定期相比,COPD急性加重期患者CD4+Fas、CD4+FasL的表达均增加,CD4+Bcl-2表达降低,P<0.05;且COPD稳定期、急性加重期CD4+凋亡率均与CD4+Fas、CD4+FasL正呈相关,与CD4+Bcl-2负相关;(3)与正常对照组相比,COPD急性加重期及稳定期患者CD8+Fas、CD8+FasL的表达均增加(P<0.05);与COPD稳定期相比,COPD急性加重期患者CD8+Fas、CD8+FasL的表达增加(P<0.05),三组之间CD8+Bcl-2表达无统计学意义(P>0.05);CD8+凋亡率与CD8+Fas、CD8+FasL、CD8+Bcl-2表达无相关性。结论 (1)COPD患者CD4+T凋亡增加,凋亡途径Fas/FasL及Bcl-2可能起重要作用;(2)COPD患者CD8+凋亡与其表达Fas、FasL、Bcl-2无相关性,凋亡途径Fas/FasL及Bcl-2可能不起主要作用,其具体机制有待进一步研究。     

人外周血NKT细胞体外扩增及其分泌细胞因子的研究

目的　建立人外周血自然杀伤T细胞 (NKT)体外扩增及检测NKT细胞所分泌的细胞因子的方法。方法　分别采用单加α 半乳糖神经酰胺 (α Galcer组 ) ,单加树突状细胞 (DC组 )以及同时加α Galcer、DC(α Galcer、DC组 )的方法从人外周血单个核细胞 (PBMC)和纯化T淋巴细胞中扩增TCRVα2 4+ /TCRVβ1 1 + NKT细胞。采用细胞内细胞因子流式细胞术检测手段测定NKT细胞中IL 4 ,IFN γ、TNF α阳性细胞比例。结果　PBMC中的α Galcer组 ,DC、α Galcer组和纯化T淋巴细胞中的DC、α Galcer组 ,NKT细胞扩增 1 9d后分别占淋巴细胞的 (2 5 .5± 7.2 ) %、(1 8.2± 8.2 ) %和 (2 4 .8± 5 .5 ) % ,NKT细胞分别扩增了 (1 5 .1± 9.1 )× 1 0 3 倍、(2 1 .8± 1 7.3)× 1 0 3 倍和 (2 3.0± 1 6 .7)× 1 0 3 倍 ,与其它各组差异有显著性意义 (P <0 .0 1 )。扩增过程TCRVβ1 1+ NKT细胞中分泌IL 4 ,IFN γ和TNF α的细胞比例均高于TCRVβ1 1 T淋巴细胞 (P <0 .0 5 )。结论　α Galcer具有体外大量扩增NKT细胞的能力 ,同时α Galcer的激活能力受CD1d分子的限制。由于PBMC中的单核系细胞也表达CD1d分子 ,因此直接从PBMC扩增NKT也能获得良好的效果     

FAS,FASL及Bcl-2在化疗药物诱导RMA细胞凋亡过程中的表达

本研究通过测定RMA细胞Fas,FasL和Bcl-2表达的变化，探讨其在细胞凋亡过程中的作用。在培养的小鼠T淋巴瘤RMA细胞系中加化疗药物地塞米松（DEX）、足叶乙甙（VP－16）、三氧化二砷（As2O3)及维甲酸（ATRA）以及培养细胞中先分别与细胞国子IL－2，IL－6或GM－CSF共同培养后再加入上述药物，观察对细胞凋亡的影响及细胞凋亡过程中Fas,FasL mRNA,Fas及Bcl-2抗原的表达。DEX和VP－16能上调Fas和FasL表达，促进细胞凋亡，Bcl-2表达无变化。ATRA可下调Bcl-2表达，但不影响Fas和FasL系统，也未观察到有细胞凋亡。As2O3可以诱导细胞凋亡,但Fas,FasL及Bcl-2表达均无变化。提示不同药物对一种细胞可能通过不同的信号途径诱导调亡，而Fas系统诱导的细胞凋亡需要Fas和FasL共同参与。单独用IL－2，IL－6或GM－CSF虽然使Fas蛋白增加，但不引起细胞凋亡；如同时并用IL－2和IL－6则Fas和FasL表达均上升，并诱导细胞凋亡。上述细胞因子与化疗药物并用时可减低药物量，促进药物的凋亡诱导作用。在无FasL表达情况下，抗Fas单克隆抗体能诱导RMA细胞凋亡。实验结果表明，细胞因子与化疗药物可协同作用诱导细胞凋亡，Fas-FasL系统参与DEX和VP－16诱导的RMA细胞凋亡过程，不同的药物可以通过不同的信号途径诱导细胞凋亡。     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者外周血淋巴细胞增殖、杀瘤活性及其对正常表型骨髓造血细胞的影响

阵发性睡眠性血红蛋白尿症 (PNH)克隆可能由于缺乏GPI锚连蛋白而逃脱免疫攻击 ,形成生长优势。本研究测定PNH患者淋巴细胞增殖反应及对K5 6 2细胞的杀伤作用 ,并与正常对照比较 ,观察其淋巴细胞功能。采用体外液体培养体系 ,应用免疫磁珠技术分选PNH患者骨髓CD34+ 及CD34- 细胞 ,分别向 2组细胞及对照细胞加入自身CD5 9+ 或CD5 9- 淋巴细胞及其培养上清液、外源性IFN γ及IL 2。培养 10天后 ,测定骨髓细胞中PNH细胞 (CD5 9- )百分数 ,观察淋巴细胞对骨髓中CD34+ 及CD34- 细胞中PNH细胞含量的影响。研究结果表明 ,对PHA的增殖反应 ,PNH患者未分选的淋巴细胞与健康对照比较、PNH患者自身CD5 9+ 与CD5 9- 淋巴细胞之间比较均无统计学差异 ,但对K5 6 2细胞的杀伤作用PNH患者未分选的淋巴细胞明显低于健康对照组 ,分别为 (5 0 .0 0± 2 8.6 7) %及 (76 .13± 10 .15 ) % (P <0 .0 5 ) ,而PNH患者CD5 9- 淋巴细胞与CD5 9+ 淋巴细胞之间无显著性差异。PNH患者骨髓细胞中加入自身CD5 9- 淋巴细胞或其培养上清液、CD5 9+ 淋巴细胞或其培养上清液、外源性IFN γ和IL 2培养后 ,CD5 9+ 细胞均有不同程度下降 ,除CD5 9+ 淋巴细胞组外 ,其他各组CD5 9+ 细胞下降与培养前比较有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,IFN γ及IL 2组     

IFN-γ and Fas/FasL are required for the antitumor and antiangiogenic effects of IL-12/pulse IL-2 therapy

Systemic administration of IL-12 and intermittent doses of IL-2 induce complete regression of metastatic murine renal carcinoma. Here, we show that overt tumor regression induced by IL-12/pulse IL-2 is preceded by recruitment of CD8(+) T cells, vascular injury, disrupted tumor neovascularization, and apoptosis of both endothelial and tumor cells. The IL-12/IL-2 combination synergistically enhances cell surface FasL expression on CD8(+) T lymphocytes in vitro and induces Fas and FasL expression within tumors via an IFN-gamma-dependent mechanism in vivo. This therapy also inhibits tumor neovascularization and induces tumor regression by mechanisms that depend critically on endogenous IFN-gamma production and an intact Fas/FasL pathway. The ability of IL-12/pulse IL-2 to induce rapid destruction of tumor-associated endothelial cells and regression of established metastatic tumors is ablated in mice with a dysregulated Fas/FasL pathway. The common, critical role for endogenous IFN-gamma and the Fas/FasL pathway in early antiangiogenic effects and in antitumor responses suggests that early, cytokine-driven innate immune mechanisms and CD8(+) T cell-mediated responses are interdependent. Definition of critical early molecular events engaged by IL-12/IL-2 may provide new perspective into optimal therapeutic engagement of a productive host-antitumor immune response.     

Fas engagement induces the maturation of dendritic cells (DCs), the release of interleukin (IL)-1beta, and the production of interferon gamma in the absence of IL-12 during DC-T cell cognate interaction: a new role for Fas ligand in inflammatory responses

Ligation of the Fas (CD95) receptor leads to an apoptotic death signal in T cells, B cells, and macrophages. However, human CD34(+)-derived dendritic cells (DCs) and mouse DCs, regardless of their maturation state, are not susceptible to Fas-induced cell death. This resistance correlates with the constitutive expression of the Fas-associated death domain-like IL-1beta-converting enzyme (FLICE)-inhibitory protein (FLIP) ligand. We demonstrate a new role of Fas in DC physiology. Engagement of Fas on immature DCs by Fas ligand (FasL) or by anti-Fas antibodies induces the phenotypical and functional maturation of primary DCs. Fas-activated DCs upregulate the expression of the major histocompatibility complex class II, B7, and DC-lysosome-associated membrane protein (DC-LAMP) molecules and secrete proinflammatory cytokines, in particular interleukin (IL)-1beta and tumor necrosis factor alpha. Mature DCs, if exposed to FasL, produce even higher amounts of IL-1beta. Importantly, it is possible to reduce the production of IL-1beta and interferon (IFN)-gamma during DC-T cell interaction by blocking the coupling of Fas-FasL with a Fas competitor. Finally, during cognate DC-T cell recognition, IL-12 (p70) could not be detected at early or late time points, indicating that Fas-induced, IFN-gamma secretion is independent of IL-12.     

Bone marrow NK1.1(-) and NK1.1(+) T cells reciprocally regulate acute graft versus host disease

Sorted CD4(+) and CD8(+) T cells from the peripheral blood or bone marrow of donor C57BL/6 (H-2(b)) mice were tested for their capacity to induce graft-versus-host disease (GVHD) by injecting the cells, along with stringently T cell-depleted donor marrow cells, into lethally irradiated BALB/c (H-2(d)) host mice. The peripheral blood T cells were at least 30 times more potent than the marrow T cells in inducing lethal GVHD. As NK1.1(+) T cells represented <1% of all T cells in the blood and approximately 30% of T cells in the marrow, the capacity of sorted marrow NK1.1(-) CD4(+) and CD8(+) T cells to induce GVHD was tested. The latter cells had markedly increased potency, and adding back marrow NK1.1(+) T cells suppressed GVHD. The marrow NK1.1(+) T cells secreted high levels of both interferon gamma (IFN-gamma) and interleukin 4 (IL-4), and the NK1.1(-) T cells secreted high levels of IFN-gamma with little IL-4. Marrow NK1.1(+) T cells obtained from IL-4(-/-) rather than wild-type C57BL/6 donors not only failed to prevent GVHD but actually increased its severity. Together, these results demonstrate that GVHD is reciprocally regulated by the NK1.1(-) and NK1.1(+) T cell subsets via their differential production of cytokines.     

脐血体外同时诱导扩增T,NK和CD34+细胞

体外研究表明,人脐血含有比骨髓细胞更原始更早期的造血干细胞群。移植后所引起的GVHD发生率及程度都比骨髓及外周血要低,但其相应的GVL效应也较低,容易复发。单份脐血所含有的造血细胞量仅可以满足一定体重以下的儿童患者需求,对需移植的大部分成人患者则要进行体外扩增。脐血体外扩增后进行干细胞移植是一种新的设想和尝试,移植物中免疫细胞的组成和功能是决定干细胞移植能否成功重建造血与免疫、以及平衡GVHD和GVL的重要因素。为了研究脐血体外同时诱导扩增T、NK和CD34 细胞的可能性,本实验无菌采集健康正常足月产新生儿脐血,并分离出单个核细胞,在不同的细胞因子组合作用下用IMDM培养液培养14天。在培养0、3、7、14天时收集细胞,用FCM分析扩增前后脐血干/祖细胞及T、NK免疫细胞含量。结果表明,与无细胞因子的对照组相比,所有细胞因子SCF,IL3,IL6,IL7,IL2组合组别均能显著扩增脐血中的单个核细胞。所有细胞因子组合组别均能显著增加脐血中的CD34 细胞比例,使其含量从新鲜脐血中的1.6%升高到最高D组的11.9%。第7天时CD34 细胞平均增加10至50倍不等。新鲜脐血中CD3 T细胞平均为(18.7±4.3)%,在无细胞因子的对照组中CD3 T细胞下降明显,而在含细胞因子的组别中CD3 T有不同程度的增加,扩增最高的组别中CD3 T细胞是新鲜脐血的2倍。在新鲜脐血中含(3.6±1.9)?56 细胞。CD56 细胞数量仅在含细胞因子IL2的组别中有显著增加,其它组则无明显变化。结论:脐血中T细胞、NK细胞在一定细胞因子组合下,可与干/祖细胞同时在体外被扩增和诱导分化。     

Preincubation with endothelial cell monolayers increases gene transfer efficiency into human bone marrow CD34(+)CD38(-) progenitor cells

Retroviral gene transfer studies targeting bone marrow CD34(+)CD38(-) stem cells have been disappointing because of the rarity of these cells, their G(0) cell cycle status, and their low or absent expression of surface retroviral receptors. In this study, we examined whether preincubation of bone marrow CD34(+)CD38(-) stem cells with a hematopoietically supportive porcine microvascular endothelial cell line (PMVECs) could impact the cell cycle status and expression of retroviral receptors in pluripotent CD34+CD38- cells and the efficiency of gene transfer into these primitive target cells. PMVEC coculture supplemented with GM-CSF + IL-3 + IL-6 + SCF + Flt-3 ligand induced >93% of the CD34(+)CD38(-) population to enter the G(1) or G(2)/S/M phase while increasing this population from 1.4% on day 0 to 6.5% of the total population by day 5. Liquid cultures supplemented with the identical cytokines induced 73% of the CD34(+)CD38(-) population into cell cycle but did not maintain cells with the CD34(+)CD38(-) phenotype over time. We found no significant increase in the levels of AmphoR or GaLVR mRNA in PMVEC-expanded CD34(+)CD38(-) cells after coculture. Despite this, the efficiency of gene transfer using either amphotropic vector (PA317) or GaLV vector (PG13) was significantly greater in PMVEC-expanded CD34(+)CD38(-) cells (11.4 +/- 5.6 and 10.9 +/- 5.2%, respectively) than in either steady state bone marrow CD34(+)CD38(-) cells (0.6 +/- 1.7 and 0.2 +/- 0.6%, respectively; p < 0.01 and p < 0.01) or liquid culture-expanded CD34(+)CD38(-) cells (1.4 +/- 3.5 and 0.0%, respectively; p < 0.01 and p < 0.01). Since PMVEC coculture induces a high level of cell cycling in human bone marrow CD34(+)CD38(-) cells and expands hematopoietic cells capable of in vivo repopulation, this system offers potential advantages for application in clinical gene therapy protocols.