鼠疫F1-V融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达及鉴定

目的通过构建pET-11c-F1-V融合表达质粒,从而获得具有免疫原性的融合蛋白。方法克隆鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)的F1基因和V基因,然后将F1基因和V基因分别连接到pGEM-T载体上,经测序正确后再将F1基因和V基因连接到pET-11c原核表达载体上,构建pET-11c-F1-V融合表达质粒,并转化到BL21(DE3)大肠杆菌中,进行PCR及双酶切鉴定,筛选阳性克隆,通过IPTG诱导F1-V表达,经SDS-PAGE检测表达产物,通过Western-Blot检测重组蛋白的免疫原性。结果测序结果显示F1基因的碱基序列与Gene-bank(X 61996)完全一致,V基因的碱基序列与Gene-bank(M 26405)相比在564 bp处有一同义突变;SDS-PAGE在Mr约58 000处出现一条蛋白条带,经薄层扫描分析目的蛋白条带约占全菌体蛋白的25％左右,主要以可溶性蛋白形式存在;Western-Blot显示重组蛋白具有免疫原性。结论成功地构建了pET-11c-F1-V融合表达质粒,并且在大肠杆菌中获得了高效表达,表达的蛋白具有免疫原性。     

硫氧还蛋白和氧化/还原因子的融合荧光蛋白载体的构建及在293T细胞中的分布

目的构建硫氧还蛋白和氧化/还原因子的融合荧光蛋白真核表达载体,并在293T细胞中得到表达和定位。方法以RT-PCR方法从PC12细胞中克隆氧化/还原因子(APE/ref-1)的cDNA,然后亚克隆构建APE/ref-1-GFP融合真核表达载体。以PCR方法将质粒pQE30-TRX上的硫氧还蛋白cDNA亚克隆到pDsred1-1质粒上,然后将硫氧还蛋白-DsRed融合基因序列亚克隆到pCMV5质粒上,构建硫氧还蛋白-DsRed融合真核表达载体.通过磷酸钙转染293T细胞,以荧光显微镜分析融合蛋白的表达及其亚细胞定位。结果成功构建了硫氧还蛋白-DsRed和APE/ref-1-GFP融合表达载体,并在293T细胞中得到表达,APE/ref-1-GFP融合蛋白定位在293T细胞核内;硫氧还蛋白-DsRed融合蛋白定位在293T细胞质和细胞核内。结论为进一步研究硫氧还蛋白和APE/ref-1之间的动态相互作用奠定基础。     

结核分枝杆菌Zmp1基因原核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建结核分枝杆菌锌离子依赖的金属蛋白酶1(Zmp1)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,采用PCR法扩增Zmp1基因;定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-Zmp1;转化入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot法鉴定。结果PCR法扩增出Zmp1基因;重组表达质粒经双酶切及基因测序鉴定构建正确;表达的重组Zmp1融合蛋白相对分子质量(Mr)约为94 000,大小与预期融合蛋白一致;重组Zmp1融合蛋白可与His标签单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了Zmp1基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组Zmp1融合蛋白表达。     

野生型和突变型人白介素13哺乳细胞表达质粒的构建

目的:构建野生型及突变型人IL-13(hIL-13)哺乳细胞表达质粒。方法:采用融合PCR扩增人生长激素(hGH)-hIL13融合蛋白编码序列。PCR产物和pcDNA3.1表达载体经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切处理后,将PCR产物定向插入pcDNA3.1真核表达载体中,构建质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g。将其转化到DH5α感受态细胞内进行扩增,阳性克隆鉴定,质粒抽提,进行测序验证。结果:重组质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g经测序验证,hGH-hIL13融合蛋白编码序列与实验设计一致,且已与pcDNA3.1(+)真核表达载体正确重组。结论:成功构建了哺乳细胞表达质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g,为后续野生型及突变型hIL-13哺乳细胞的重组表达奠定了基础。     

TLR4胞外段在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及鉴定

目的：构建谷胱甘肽转硫酶-TLR4融合蛋白表达载体，并研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达。方法：利用PCR从含TLR4全长cDNA序列的质粒中扩增其胞外段，约1800bp，然后将其克隆入pMD18-T载体中。测序确证后重组入谷胱甘肽转硫酶融合表达载体pGEX-4T-1中，并用IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。结果：PCR扩增的TLR4胞外区基因序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒经酶切鉴定及测序证实，TLR4基因已正确插入到pGEX-4T-1中。重组表达质粒转化感受态大肠杆菌HBl01后用IPTG诱导，获得Mr92 000的GST-TLR4融合蛋白；37℃，O.2mmol／L IPTG诱导4h，SDS-PAGE电泳后，经薄层凝胶扫描分析该融合蛋白占菌体蛋白总量34．25％，部分以包涵体存在，可溶性蛋白约占27．84％；亲和层析纯化后纯度大于90％。Western-blot证实GST-TLR4融合蛋白能与TLR4单抗特异性结合。结论：成功地构建融合蛋白表达载体pGEX-TLR4，并在大肠杆菌中获得有效表达，获得了纯度大于90％的可溶性GSI-TLR4融合蛋白，为进一步研究其功能及制备TLR4单克隆抗体奠定了基础。     

乙肝病毒HBsAg-EGFP融合蛋白真核表达载体构建及稳定转染Chang Liver细胞系的建立

目的 构建可表达乙型肝炎病毒(HBV)HBsAg-EGFP融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系.方法 利用PCR技术从HBV基因组中扩增出HBsAg基因片段,BamH I/EcoR l双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP-N1真核表达载体,转化TG1菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒pEGFPNl.HBsAg.将阳性克隆用脂质体法转染Chang Liver细胞,经持续G418压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系.结果 成功构建了真核表达载体pEGFPN1-HBsAg;建立了其重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系.结论 重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系可表达HBsAg-EGFP融合蛋白;该细胞系可以用于筛选HBsAg转染细胞后,差异表达的蛋白质研究,为深入研究HBsAg可能的致病机制提供依据.     

人源性神经营养素-6成熟肽基因融合表达载体的构建及表达产物的纯化

为了得到人源性神经营养素-6(N eurotroph in-6,NT-6)成熟肽片段,本研究以经测序鉴定的人源性NT-6 cDNA为模板,通过聚合酶链式反应(Po lym erase cha in reaction,PCR)扩增得到NT-6蛋白成熟肽编码区基因片段;将该基因克隆到融合表达载体pGEX 1-λT,构建重组原核融合表达质粒pGEX-NT-6;在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropy l-βD-th ioga lactos ide,IPTG)诱导的条件下,观察融合蛋白在大肠杆菌JM 109中的表达情况;利用蛋白回收试剂盒对表达产物进行纯化。结果表明经PCR扩增后,得到一分子量为460 bp左右的片段;含有该片段的重组质粒经电泳及双酶切鉴定表明,所得到的重组质粒即为含有目的片段的pGEX 1-NT-6;与带有pGEX 1-λT质粒的细菌相对照,pGEX 1-NT-6质粒转化的大肠杆菌JM 109,在IPTG诱导下表达了特异性的融合蛋白,该蛋白分子量为41 KD。获得的融合蛋白经凝血酶酶切后,得到了分子量大约为15 KD的NT-6成熟肽。本研究成功构建了人源性NT-6成熟肽编码区基因融合表达载体,并纯化了其表达产物,为研究人源性NT-6的生物学功能奠定了基础。     

HCC特异性结合的scFv-AP融合蛋白的构建与表达

目的：构建与肝癌细胞特异性结合的单链抗体-AP融合蛋白，并诱导表达。方法：提取从大型人源噬菌体抗体库中筛选的含有与HCC特异性结合的scFv-10基因的质粒，用SfiⅠ、NotⅠ分别酶切，连接至经同样双酶切后的原核分泌型表达载体pDAP2上，转化和筛选后，阳性细菌经IPTG诱导表达，细胞ELISA鉴定融合蛋白活性。结果：重组质粒经PCR扩增，Eco91Ⅰ单酶切及Eco91Ⅰ／NotⅠ双酶切鉴定，证明scFv-10基因已插入到原核分泌型表达载体pDAP2上。表达产物的定位分析表明融合蛋白主要分泌性表达到周质腔，细胞ELISA证明表达产物有与HCC结合的活性。结论：成功地构建并表达了与HCC特异性结合的单链抗体．AP融合蛋白，为其应用奠定了基础。     

MAGE-1与结核杆菌HSP70融合基因的构建及原核表达

目的 构建结核杆菌HSP70与肿瘤抗原MAGE-1的融合基因，在大肠杆菌中进行表达，并通过GST纯化系统进行分离纯化。方法 利用PCR方法扩增TBHSP70基因，经测序后连入原核表达载体pGEX-4T-1，再通过PCR方法扩增MAGE-1基因片段(289～927bp)，测序后插入TBHSP70基因的5’端，构建MAGE-1与TBHSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-MAGE-1-TBHSP70，含有该质粒的大肠杆菌DH5a进行诱导表达和分离纯化。结果 成功地扩增了TBHSP70基因与MAGE-1基因片段，测序结果表明与GenBank公布的序列一致；成功地构建了pGEX-MAGE-1-TBHSP70原核表达质粒，含有该质粒的大肠杆菌DH5α经IPTG诱导后表达一Mt约为125000的蛋白，经GST融合蛋白表达系统纯化，得到了MAGE-1与TBHSP70的融合蛋白。结论 成功地获得了MAGE-1与TBHSP70的融合蛋白，为研究MAGE-1-TBHSP70融合蛋白在肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础。     

抗重组GST单克隆抗体的制备及其在融合蛋白纯化中的应用

目的 制备抗重组GST的单克隆抗体（mAb),并用来纯化重组GST融合蛋白,方法 用含重组GST融合蛋白基因的pGEX4T-1质粒转化E.coliBL21,IPTG诱导GST融合蛋白表达,亲和层析和凝胶过滤法分离表达的重组GST融合蛋白,以此蛋白作为抗原,免疫Balb/c小鼠,按传统的杂交瘤技术制备mAb。将抗GSTmAb经ProteinA纯化后,与Sepharose4B偶联。结果 经3次亚克隆后,获得两株分泌抗GST载体特异性mAb的杂交瘤,采用该mAb对两种不同的GST融合蛋白进行亲和层析纯化后,经SDS-PAGE鉴定达到了商品化Glutathione-Resin的亲和层析纯化效果。结论 用抗GST蛋白特异性mAb亲和层析纯化融合蛋白是一种经济、实用的方法,且可用于Glutathione-Resin亲和层析纯化后的二次纯化。     

氯通道ClC-2融合蛋白的原核表达及体外磷酸化

目的：检测ClC-2是否能被促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化，为进一步研究其在细胞增殖、分化过程中的调控机制提供基础。方法：从含有家兔ClC-2cDNA的质粒pSPORT1中PCR扩增ClC-2胞浆内的羧基端DNA编码序列，构建重组载体pGEX-4T-1／ClC-2CT；重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21菌株；经异丙基β-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导后，通过Gluthathion Sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白；并行融合蛋白的体外磷酸化实验。结果：酶切、测序鉴定重组载体pGEX-4T-1／ClC-2CT构建正确，并纯化得到GST／ClC-2CT融合蛋白。而且该融合蛋白能被MAPK磷酸化，而GST不能被MAPK磷酸化。结论：氯通道ClC-2能被MAPK磷酸化。     

重组汉滩病毒核蛋白的纯化及鉴定

目的：纯化重组表达的汉滩病毒核蛋白。方法：重组菌经IPTG诱导后，表达的目的蛋白为带有谷胱甘肽转硫酶（GST）标签的融合蛋白，并以包涵体形式存在。将包涵体变性、复性后，采用Glutathione Sepharose 4B亲和色谱对核蛋白进行纯化，并用夹心ELISA和Western blot检测纯化蛋白。结果：表达产物第一次过柱亲和层析后可去除杂蛋白，获得纯化的核蛋白与谷胱甘肽转硫酶的融合蛋白，再经凝血酶酶切，第二次过柱亲和层析后获得的穿过峰为核蛋白，洗脱峰为GST。纯化的融合蛋白和纯化的核蛋白均为SDS－PAGE单点纯，并具有良好的抗原活性。结论：Glutathione Sepharose 4B亲和色谱纯化重组汉滩病毒核蛋白是一种较为有效的方法。     

F10蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：表达F10蛋白，并制备兔抗F10多克隆抗体。方法：利用PCR方法扩增F10基因片段，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后连接人pET-GST原核表达载体，构建的pET-GST／F10融合重组表达质粒转化大肠杆菌B121，经IPTG诱导表达蛋白，并以亲和层析的方法进行纯化。表达产物用SDS—PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定。以纯化的F10蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔抗F10的多克隆抗体，并以ELISA法检测抗体效价。结果：经酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的F10读码框。SDS—PAGE电泳分析显示pET—GST／F10诱导后表达一相对分子质量（Mr）约为61000的融合蛋白，与预期结果相符。目的蛋白纯化后的纯度达90％以上，Western blot证实该蛋白是GST／F10的融合蛋白。将纯化的GST／F10融合蛋白免疫家兔，得到的兔抗F10抗体效价达1：20000。结论：成功构建了人F10基因原核表达载体，并获得了高纯度的F10重组蛋白及兔抗F10抗体，为下一步研究F10基因功能奠定了实验基础。     

氯霉素乙酰基转移酶融合蛋白表达、纯化和鉴定

目的对氯霉素乙酰基转移酶(Chloramphenicol acetyltransferase,CAT)基因进行表达和纯化.方法通过PCR扩增编码CAT氨基酸序列的基因片断,并将之克隆入pGEX-2T载体.IPTG诱导蛋白融合表达,产物经琼脂糖亲和层析树脂纯化.免疫印迹鉴定纯化蛋白的抗原性.结果筛选得到的重组子诱导后表达相对分子质量约为52 600的CAT融合蛋白.树脂纯化及酶切后均得到高纯度的蛋白样品.纯化蛋白能与抗CAT抗体特异结合.结论本研究获得了CAT基因的融合表达蛋白,并对其完成纯化,为制备抗血清和抗体打下基础.     

重组日本血吸虫FKBP12基因的酶活性及其转录水平鉴定

目的对日本血吸虫（Schistosoma japonicum，sj）FK506结合蛋白12（FKBPl2）进行肽基脯氨酸顺反异构酶（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，PPIase）活性鉴定，并比较它与26000 Mr的谷胱甘肽转移酶（Sj26GST）基因在成虫、尾蚴和虫卵的转录水平。方法从成虫RNA中RT-PCR扩增sjFKBPl2基因，将其克隆入pGEX-4T-1载体中，诱导表达重组融合蛋白，经纯化后进行PPIase活性测定。利用RT-PCR半定量分析sjFKBPl2基因与Sj26GST基因的转录水平。结果将sjFKBPl2基因成功克隆入pGEX-4T-1载体中后，表达、纯化的重组融合蛋白有PPIase活性。sjFKBPl2在尾蚴与虫卵期的转录水平相仿，都高于Sj26GST基因，是成虫期转录水平的1．5倍左右。结论成功鉴定了重组sjFKBPl2酶活性，sjFKBPl2在尾蚴和虫卵期较高的转录水平，为将其进行疫苗等研究提供了依据。     

人神经系统特异表达RNA结合蛋白HuC cDNA的克隆、表达及纯化

目的克隆人神经系统表达RNA结合蛋白HuC的cDNA并原核表达纯化。方法提取人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞株总RNA,经RT-PCR扩增得到人HuC全长cDNA的克隆。将HuC cDNA克隆到原核表达载体pGEX4T-3载体中,并转化到大肠杆菌中,在获得高效表达后,利用GST纯化系统,对HuC重组蛋白进行纯化。结果经过表达及纯化条件的摸索,最终获得重组HuC蛋白。结论HuC蛋白是一种神经系统表达RNA结合蛋白,重组HuC蛋白的获得为HuC抗体的制备及进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

人SUMO-2基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:构建人SUMO-2基因的原核表达载体,纯化融合蛋白GST-SUMO2-SUMO2并以其为抗原免疫家兔,制备人SUMO-2多克隆抗体.方法:用PCR的方法得到人SUMO-2基因并克隆至pET41a( )原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS诱导融合蛋白GST-SUMO2-SUMO2表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫家兔制备抗血清,分别采用ELISA、Western blot检测抗体效价和特异性.结果:测序证实重组质粒pET41a( )-SU-MO2-SUMO2构建成功;SDS-PAGE结果证实获得Mr为52 000的GST-SUMO2-SUMO2融合蛋白且为可溶性蛋白;经过GST亲和层析有效纯化;以该融合蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经Western blot检测证实能与目的蛋白发生特异性结合,ELISA检测为阳性.结论:获得了人SUMO-2蛋白及特异性多克隆抗体,对进一步研究人SUMO-2及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具.     

人细胞因子受体样因子3在真核及原核细胞中的表达

目的:观察CRLF3蛋白在293T细胞中的表达及亚细胞定位,并在大肠杆菌中表达和纯化了重组CRLF3蛋白.方法:将真核表达载体pCMV-myc-CRLF3瞬时转染293T细胞,转染24 h和48 h后免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察蛋白表达及定位;构建原核表达质粒pGEX-4T-1-CRLF3,实现插入基因的融合表达,经GST亲合层析纯化蛋白.结果:CRLF3蛋白在293T细胞中高效表达,主要分布在细胞质和细胞膜;成功构建了表达CRLF3融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌内高效表达,纯化后得到Mr约为74 000的融合蛋白.结论:在真核细胞中过表达的CRLF3蛋白主要定位在细胞质和细胞膜;获得了重组GST-CRLF3融合蛋白,为进一步探讨CRLF3的功能奠定基础.     

人单核细胞趋化蛋白-1在大肠杆菌中的高效表达及其生物学活性

利用PCR和DNA重组技术,将人单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）cDNA克隆在表达载体pGEX－2T中,表达产物GST／MCP－1占菌体总蛋白的50％,且以无活性的包涵体形式存在。经变复性,GlutathioneSepharose4B亲合柱层析纯化,融合蛋白达到电泳纯,且具有MCP－1趋化活性。体内外抗肿瘤试验结果表明,GST／MCP－1激活单核细胞和淋巴细胞后可抑制肿瘤细胞生长,提示MCP－1可能成为肿瘤辅助治疗的一个候选药物。