乳鼠窦房结细胞的原代培养与鉴定

目的 :建立一套可靠的窦房结细胞培养与鉴定技术。方法 :取Wistar乳鼠的窦房结组织 ,用差速贴壁技术及BrdU处理法进行原代细胞培养 ;对培养细胞进行形态学观察 ,用电生理技术记录细胞的动作电位。结果 :在培养的窦房结细胞中观察到有 3种不同形态的细胞 ,即梭形细胞、三角形细胞与不规则形细胞 ,其中梭形细胞最多 ,且形态结构与电生理特征符合窦房结起搏细胞的特点。三角形细胞与心房肌三角形细胞特征相似。结论 :①用差速贴壁技术及BrdU处理法进行乳鼠的窦房结细胞培养 ,是一种可靠的窦房结细胞培养技术。②培养乳鼠窦房结细胞中的梭形细胞即为窦房结的起搏细胞     

足细胞与足细胞病

足细胞是肾小球毛细血管壁选择性滤过的关键细胞,各种原发性或继发性肾小球疾病均能造成足细胞损伤。因此,足细胞修复和再生成为目前治疗的主要目标。近年来,随着分子生物学和细胞生物学的发展,人们对足细胞的研究和认识越来越深入。现就足细胞和足细胞病的相关进展作一综述。     

乳鼠窦房结细胞的原代培养和形态学特征

目的比较差速贴壁技术和常规培养方法在体外获取窦房结自律细胞的密度,并观察其形态学特征。旨在建立可靠的窦房结自律细胞体外取材分离、纯化培养及形态学鉴定。方法取24 h内新生Wistar乳鼠1 20只,随机分为实验组(差速贴壁技术培养方法)和对照组(常规培养方法),每组60只。每次随机各取5只乳鼠行窦房结取材,分别用2种方法进行原代细胞纯化培养。通过光、电镜观察比较2种方法体外窦房结自律细胞的密度比及形态学特征。结果体外培养窦房结细胞有3种不同形态,梭形细胞、三角形细胞和不规则形细胞,其中梭形细胞最多,搏动频率最快;三角形细胞与心房肌三角形细胞特征相似;实验组窦房结梭形细胞比例明显高于对照组[(65±4)%vs(45±3)%,P<0.01]。结论采用差速贴壁技术纯化培养方法较常规培养可更明显提高窦房结梭形细胞的比例,是一种可靠的窦房结自律细胞培养、纯化技术。在培养的乳鼠窦房结细胞中,细胞体积小、搏动频率快的梭形细胞即是窦房结的起搏细胞。     

小鼠甲状腺细胞原代培养及鉴定

目的分离培养小鼠甲状腺细胞，为探讨甲状腺功能调节和疾病发生提供一种体外模型。方法取6～8周龄Balb／c小鼠甲状腺，用胶原酶-中性蛋白酶双酶法分离甲状腺滤泡上皮细胞。用含10％胎牛血清（FCS）的F-12培养基培养，细胞贴壁后FCS降至5％，另外添加促甲状腺激素（TSH）、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素和L．谷氨酰胺。光镜下对不同培养时间的细胞进行形态学观察，并结合免疫细胞化学染色法、RT—PCR法和电化学发光免疫法对培养小鼠甲状腺细胞从形态、甲状腺球蛋白（取）、取特异抗原蛋白表达、甲状腺过氧化物酶（TPO）、钠碘转运子（NIS）、促甲状腺激素受体（TSH—R）等特异基因mRNA表达和甲状腺激素T3、T4分泌功能等方面进行鉴定。结果小鼠甲状腺细胞在体外呈贴壁式生长，具有上皮样细胞特点；取染色呈胞浆阳性，并具有特异TPO、Tg、NIS、TSH—RmRNA表达和分泌T3、T4的功能，但其表达与分泌量有随培养时间的延长呈递减趋势。结论成功建立小鼠甲状腺细胞原代培养模型，可用于甲状腺功能与疾病研究。     

中医药对肾脏足细胞损伤干预作用的研究进展

足细胞是肾小球主要的固有细胞之一,足细胞的减少和丢失已成为反映肾小球疾病进展的主要观测指标。随着对足细胞结构和功能的深入研究,药物对于足细胞作用的研究也取得诸多进展。本文就近五年来国内有关中医药对足细胞损伤的干预研究作一综述。     

改良成人胃粘膜上皮细胞原代培养

建立成人胃粘膜上皮细胞原代培养方法。方法：采用胰酶和胶原酶冷消化法消化分离手术切除的成人胃粘膜,细胞培养于含２０％小牛血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液中。结果：细胞于种植２４ｈ后开始生长,３天长成片状,相差显微镜下可见９０％以上的细胞具有上皮细胞特征。免疫组化显示９０％以上的细胞上皮角蛋白染色、上皮膜抗原阳性。ＭＴＴ比色法显示活细胞数于第４天达到高峰。＾３Ｈ－胸腺嘧啶核苷（ＴｄＲ）掺入法显示细胞具有合     

湖北钉螺细胞原代培养的初步研究

目的研究湖北钉螺组织细胞的原代培养。方法无菌处理并解剖钉螺成螺及螺胚,分别获得软体、肝脏、外套膜及胚胎组织。将软体、肝脏及胚胎组织剪碎,用0.25％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)混合液4℃下消化数小时,所得细胞按三宅的湿润系统固定法接种于钉螺的外套膜组织。培养液为1/2浓度的RPMI1640含20％小牛血清附加常量抗生素(青霉素100IU/ml,链霉素100μg/ml),温度为27℃～28℃,pH7.2～7.4。结果钉螺的胚胎组织冷消化后,获大量游离细胞。接种培养5d,见有贴壁细胞,扁平状,多边或不规则形,大小约为(15～20×12～15)μm。培养细胞以悬浮状为主,直径为8～12μm,少数为30～35μm。生长良好,可传代培养。结论钉螺胚胎细胞可进行原代培养及传代。     

大鼠肝贮脂细胞Kupffer细胞的分离,培养和鉴定

贮脂细胞是目前肝纤维化研究的热点，本文参考Ｆｒｉｅｄｍａｎ等的不连续密度梯度心法并作改良，建立了一种经济，简便，可靠的分离大鼠肝贮脂细胞，Ｋｕｆｆｅｒ细胞的方法，贮脂细胞得率的１０＾７／大鼠，纯度在９０％以上，Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞纯度约６０％，其培养上清基本适合进一步研究用。本方法的建立，为进一步研究肝贮脂细胞与肝纤维化的关系，尤其是细胞水平及分子生物学水平的研究奠定了基础。     

足细胞和糖尿病及其肾病

肾小球足细胞损伤和丢失是肾小球硬化形成和发展的关键因素。糖尿病时足细胞可出现密度和数量减少、足突增宽、足细胞脱落等改变,且可从尿中丢失,继而导致糖尿病肾病的发生。高血糖、高血压、氧化应激及一氧化氮等可直接损伤足细胞,并抑制α3β1整合素、nephrin的表达,促进血管内皮生长因子、Ⅳ型胶原、糖基化终末产物受体、转化生长因子β等的表达而加重足细胞损伤。因而,探索足细胞损伤在糖尿病肾病发生、发展中的病理发展过程对糖尿病肾病的防治具有重要意义。     

小鼠原代肝细胞的分离与培养

目的探求一种简易、经济的小鼠原代肝细胞的分离与培养方法。方法采用非灌注法分离小鼠肝脏,利用0．2％Ⅳ型胶原酶对肝脏消化以获取肝细胞,以DMEM培养基对肝细胞进行单层培养。结果光镜下可见培养的肝细胞呈三角形、圆形、类圆形或扁平不规则多角形,排列整齐,细胞界限清晰,胞浆丰富透亮,细胞中有核,有单核、双核是圆形或椭圆形,核仁清晰。结论此方法较适合一般实验室开展小鼠原代肝细胞的分离与培养,为进一步的实验研究提供了基础。     

新生大鼠心肌细胞的原代培养

目的：探讨新生大鼠心肌细胞的分离和培养方法。方法：应用0．0625％的胰蛋白酶重复消化出生第2d乳鼠的心肌组织多次,收集的细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基中和,用差速贴壁分离法分离．在以溴脱氧尿嘧啶（Brdu）纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育7d。结果：分离1只乳鼠获得的心肌细胞产量约为140万个,且有活力心肌细胞占90％以上;培养4～6h的乳鼠心肌细胞开始贴壁生长,12～24h明显增殖,3～4d后细胞融合成片;心肌细胞由圆形变为梭形、星形、多角形。并出现自发性节律性搏动。结论：本研究应用的心肌细胞原代培养方法可获得高产量、高活力的心肌细胞,是一种可靠的心肌细胞培养方法。     

组织贴块法人的支气管上皮细胞的原代培养

目的 通过组织贴块法建立人的支气管上皮细胞原代培养的方法.方法 采用无血清支气管上皮培养基,对经手术切除获得的支气管进行组织贴块法培养获得的细胞进行原代培养和传代,通过倒置显微镜以及细胞免疫化学观察和鉴定细胞.结果 此方法获得的细胞成活率高、纯度高,细胞呈扁平、多边形,象铺路的鹅卵石样分布.细胞角蛋白表达阳性.结论 组织贴块法是一种简便、有效的培养人的支气管上皮细胞的方法,无血清培养基可提供满意的生长条件,提高上皮细胞的纯度,为进一步研究不同的呼吸系统疾病提供了良好的模型.     

人肝细胞的微载体培养及其意义

目的：探讨大量培养高活性人肝细胞的理想方法，为肝脏病研究提供良好的细胞材料。方法：在限制贴壁、定时振荡条件下，采用载体ｃｙｔｏｄｅｘ３为材料进行人肝细胞的微载体培养。结果：预先将体外两步灌流分离的人肝细胞振荡３０分钟后，肝细胞易与微载体相粘附．在被覆聚羟乙基异丁烯酸的培养瓶中继续间歇性振荡２４小时，约７０％的肝细胞附着于微载体之上。在使用激素限定条件培养液培养的１５天内，肝细胞保持蛋白分泌功能和多细胞粘附聚集球形体形态特征。结论：本法培养人肝细胞具有细胞数量多、密度大和活性好的特点，适宜于体外生物人工肝支持系统、肝细胞移植以及培养肝细胞因子的提取。     

Notch胞内域1对高糖诱导小鼠肾小球足细胞凋亡的影响

目的通过体外高糖培养小鼠肾小球足细胞,检测Notch胞内域1（NICDl）的表达与肾小球足细胞凋亡的关系并了解其他信号通路是否介导高糖对Notch通路的激活,以探讨治疗糖尿病肾病的潜在方向。方法高糖培养小鼠足细胞,于刺激0、12、24、48、72h后收集细胞,检测NICDl蛋白表达情况。将细胞分为7组：正糖组、高糖组、高糖＋1分泌酶抑制剂（GSI,抑制NICDl活化）组、高糖＋p38细胞分裂素活化蛋白激酶抑制剂组、高糖＋Janus激酶2抑制剂组、高糖＋转化生长因子B,I型受体抑制剂组和高糖＋磷酸肌醇3激酉每／蛋白激酶B抑制剂组。分别采用免疫细胞化学和Westernblotting法检测NICDl的表达,流式细胞术和原位缺口末端标记法（TUNEL）观察足细胞凋亡情况。两组间数据比较采用t检验,多组间数据比较采用单因素方差分析。结果高糖培养足细胞NICDl蛋白较正糖组（0．079±0．010）增加,12h开始增加（0．443±0．075）,48h达峰（0．746±0．034）,72h略下降（0．658±0．056,F=6．235,P〈0．01）。流式细胞术及TUNEL显示48h时足细胞凋亡率升高,给予GSI后抑制NICDl的活化及足细胞凋亡（P〈0．01）;给予Janus激酶2（0．193±0．096）和转化生长因子B,I型受体抑制剂（0．225±0．067）可抑制高糖对NICDl蛋白的活化（t=6．781、4．287,均P〈0．叭）。结论高糖通过Notch通路诱导足细胞凋亡,高糖对Notch通路的激活可能通过Janus激酶／转录激活因子和转化生长因子β1／Smad通路。     

大鼠脑微血管周细胞的分离和鉴定

目的探讨大鼠脑微血管周细胞的分离、培养和鉴定方法。方法10只3周龄Wstar 大鼠,无菌分离脑组织,采用2次酶消化和1次密度梯度离心法分离脑微血管片段,接种于35 mm培养皿进行原代培养。采用相差显微镜观察细胞形态,免疫荧光法鉴定α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、神经元-胶质...     

人外周血树突状细胞体外稳定培养方法的建立及与磁珠法的比较

目的 建立一种稳定的人外周血树突状细胞(DCs)体外培养的方法,并与磁珠分选法进行比较.方法 通过密度梯度离心法分离出志愿者的外周血单个核细胞(PBMC),再分别应用磁珠分选法、贴壁法对PBMC进行培养,应用重组人集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素-4(rhIL-4)诱导获得DCs.倒置显微镜观察细胞形态变化,并分别在第3、5、6天用台盼蓝染色法进行细胞活力检测;经过1、2、5 h的贴壁培养后,应用流式细胞仪检测单核细胞表面CD14、CD1a、HLA-DR的表达以确定最佳贴壁时间;经人重组细胞因子诱导培养后,对所获得的细胞检测CD14、CD1a、CD86、CD83、HLA-DR的表达.采用同种混合淋巴细胞反应,评价DCs刺激T淋巴细胞增殖的能力.结果 经贴壁2 h后诱导培养的DCs形态较典型.磁珠分选法获得的DCs第5、6天细胞活力[(53.333±5.774)%、(38.333±7.638)%]明显低于第3天[(68.667±3.215)%,P均＜0.05];贴壁培养法获得的DCs第3、5、6天的细胞活力[(92.667±3.055)%、(94.000±1.000)%和(94.667±1.528)%]比较,差异无统计学意义(F=0.737,P＞0.05);贴壁培养法获得的DCs第3、5、6天细胞活力均高于磁珠分选法(t值分别为9.374、12.021、12.527,P均＜0.05).PBMC经磁珠分选前后CD14的阳性表达率分别为(32.457±12.351)%、(41.914±14.858)%,二者比较差异无统计学意义(t=1.295,P＞0.05).单核细胞表面CD14的阳性表达率在培养2 h时[(35.267±4.658)%]高于培养1、5 h时[(15.033±6.189)%、(21.233±4.895)%,P均＜0.05].培养第6天,DCs表面CD14的阳性表达率[(2.200±1.356)%]较第1天[(32.328±14.517)%]明显下降(t=5.467,P＜0.05),CD1a的阳性表达率[(43.371±16.250)%]较第1天[(12.300±6.223)%]显著升高(t=2.545,P＜0.05);而CD86、CD83、HLA-DR的阳性表达率[(16.857±5.686)%、(9.343±5.230)%、(72.800±17.881)%]与第1天[(12.550±16.758)%、(6.250±1.323)%、(64.671±15.588)%]比较,差异无统计学意义(t值分别为0.652、1.137、0.907,P均＞0.05).同种混合淋巴细胞反应,随着淋巴细胞的增多,增殖能力下降.磁珠分选法中,DCs与淋巴细胞的比例为1:50、1:100时,细胞增殖能力(1.502±0.055、1.507±0.029)较1:10时(1.859±0.049)降低(P均＜0.05);贴壁培养法中,DCs与淋巴细胞的比例为1:100时,细胞增殖能力(1.545±0.066)较1:10时(2.015±0.301)降低(P＜0.05).在DCs与淋巴细胞的比例相同时,两种方法得到的DCs在刺激T淋巴细胞方面的能力相近(P＞0.05).结论 与磁珠分选法比较,贴壁培养2 h后的人外周血PBMC再行诱导可获得形态与功能较优的DCs,且此法稳定、简便、经济,是一种适于基础、临床研究的DCs体外培养方法.     

人前脂肪细胞的培养及分化研究

目的建立人前脂肪细胞培养及其在药物诱导下向脂肪细胞分化的细胞模型。方法取中国人腹部皮下脂肪组织,经胶原酶消化后在含胎牛血清的DMEM-F12培养基中培养出梭形细胞,以胰岛素、地塞米松及吡咯列酮诱导该梭形细胞向脂肪细胞分化。结果经油红O脂肪染色可见梭形细胞内脂滴的积累。人前脂肪细胞经诱导并继续培养后在旋涡状生长汇合的细胞中心形成一个高密度的细胞岛,该细胞岛由部分可以贴壁的细胞和悬浮的已分化的脂肪细胞组成。结论成熟脂肪组织中存在着具有能分化为脂肪细胞的前脂肪细胞,经适当诱导可定向分化为脂肪细胞。     

人心房肌细胞的培养与鉴定

目的　探索人心房肌细胞的原代及传代培养方法。方法　取心外科手术患者 (1 5～6 0岁 ,平均 2 5岁 )常规切除的右心耳 ,利用组织贴块法原代培养心房肌细胞并进行传代培养 ,对培养细胞 (取第 3代 )进行光镜、透射电镜形态学观察和免疫细胞化学鉴定 ,并绘制生长曲线。结果原代培养 1 0d左右时细胞数目可达 1 0 6～ 1 0 7/ml;此后每 4～ 5d可传代一次 ,大多可传至第 8代。透射电镜观察到典型心肌细胞的超微结构 ,免疫细胞化学分析显示 90 %以上的细胞呈α 肌动蛋白及心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ抗体染色阳性。细胞生长曲线显示第 3代细胞在密度为 1× 1 0 6～ 8× 1 0 6/ml呈对数生长 ,倍增时间约 2 4h。结论　利用组织贴块法成功培养出人心房肌细胞 ,所得心房肌细胞纯度高并能传代培养 ,为深入研究人心房肌细胞的病理生理及分子生物学奠定了基础。     

构建永生化人源肝细胞的研究

近年来,人源肝细胞的需求日益增多.新药的开发与应用、病毒性肝炎的实验研究、肝细胞移植及生物人工肝的研究应用等等均需要大量的人源肝细胞.但人肝细胞来源困难,细胞分离、培养及储存的技术尚不完善,体外培养存活时间短,其供给无法满足日益增多的需求.近几年永生化的人肝细胞技术进展较快,尤其是构建成功的可逆性永生化人肝细胞,有望从根本上解决人肝细胞来源困难的难题.