pU-VEGF-siRNA对裸鼠恶性黑素瘤生长影响的研究

目的 研究pU-VEGF-siRNA对恶性黑素瘤成瘤和凋亡的影响及其机制.方法 构建针对血管内皮生长因子(VEGF)的发卡样siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA,通过电穿孔法将构建重组体导入人恶性黑素瘤细胞系A375,并建立pU-VEGF-siRNA转染细胞荷瘤裸鼠模型,应用免疫组织化学方法检测荷瘤裸鼠肿瘤组织VEGF和血管内皮细胞特异性Ⅷ因子相关抗原(FⅧRAg)的表达,依据FⅧRAg的表达评价肿瘤微血管密度,末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)定量检测荷瘤裸鼠模型的肿瘤组织凋亡.结果 体内实验表明,实验组成瘤率明显低于对照组,且其肿瘤生长速度也明显减慢(P<0.01).实验组VEGF表达和肿瘤微血管密度明显低于对照组(P<0.01).实验组可见大量凋亡细胞,对照组仅见少许凋亡细胞,实验组凋亡指数与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论 通过RNA干扰技术阻断VEGF的表达,在裸鼠体内可显著抑制恶性黑素瘤生长.     

siRNA抑制生存素基因对恶性黑素瘤细胞A375凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制恶性黑素瘤细胞株A375生存素基因表达后,对A375细胞凋亡的影响。方法 构建针对凋亡抑制基因生存素的siRNA真核表达载体pU-生存素-siRNA,用电穿孔法转染A375细胞,采用蛋白质印迹技术检测生存素的表达,并用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果 转染pU-生存素-siRNA后,生存素在A375细胞中的表达(0.24±0.02)较对照组(0.98±0.21)明显下降,试验组细胞的凋亡率(83%)较对照组(28%)明显增加。结论 通过RNA干扰技术可抑制生存素的表达,诱导A375细胞的凋亡增加。     

CD147 siRNA对恶性黑素瘤细胞株A375增殖及CD147表达的影响

目的 研究CD147siRNA转染对恶性黑素瘤细胞株A375中CD147表达及细胞增殖的影响。方法 将前期构建的重组质粒pSUPER/CD147 siRNA稳定转染至恶性黑素瘤细胞株A375中,采用半定量RT-PCR法检测转染细胞中CD147 mRNA的表达。采用MTT法检测转染pSUPER/CD147 siRNA对肿瘤细胞增殖的影响。结果 转染了pSUPER/CD147 siRNA的恶性黑素瘤细胞株A375中CD147 mRNA表达水平显著下调,其在转染后24h、48h和72h的增殖水平均显著下降。结论 siRNA转染能有效抑制恶性黑素瘤细胞株A375中CD147的表达,且能抑制肿瘤细胞的增殖能力。     

pU-VEGF-siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定针对VEGF的发卡样siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA。方法人工合成一对互补并编码相应短发夹状VEGF-siRNA的寡核苷酸链,将其插入到pS ilencerTM2.1-U6neo载体中,经测序鉴定所构建的重组载体是否正确;采用电转染方法将构建的重组载体导入人恶性黑素瘤细胞系A375和人结(直)肠癌细胞系LOVO细胞中,用G418筛选得到稳定表达VEGF-siRNA的细胞;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、ELISA法分别检测转染细胞VEGFmRNA和蛋白的表达变化。结果经测序证明pU-VEGF-siRNA序列正确;G418筛选得到稳定表达VEGF-siRNA的细胞;转染pU-VEGF-siRNA载体后,A375和LOVO细胞VEGF mRNA和蛋白表达均较对照组明显下降(P<0.01)。结论测序结果表明发卡样的VEGF-siRNA真核表达载体构建成功,转染A375和LOVO细胞后获得稳定表达,并可特异性封闭VEGF的表达,为进一步研究pU-VEGF-siRNA载体在恶性黑素瘤治疗中的作用提供了实验基础。     

RNA干扰技术抑制人恶性黑素瘤细胞A375中淋巴样增强因子mRNA及蛋白表达

目的 利用RNA干扰技术,以淋巴样增强因子(LEF-1)为靶基因,设计、构建重组体,研究其对人恶性黑素瘤细胞A375中LFF-1表达的抑制作用。方法 设计、合成针对LEF-1 mRNA序列的有小发夹结构的正义和反义寡核苷酸,退火后与表达载体Psilencer3.1-H1 neo相连接,经鉴定正确后转染人恶性黑素瘤细胞A375,以G418筛选,获得稳定转染细胞株,分别以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)和免疫细胞化学方法检测转染细胞中LEF-1 mRNA及蛋白表达水平的改变。结果 成功构建了靶向人LEF-1基因的siRNA表达载体,获得稳定转染细胞株,转染细胞LEF-1 mRNA及蛋白水平明显下调。结论 靶向LEF-1的RNA干扰重组体可抑制人恶性黑素瘤细胞A375中LEF-1表达。     

苦参碱抑制人恶性黑素瘤A375细胞株的侵袭

目的 探讨苦参碱对恶性黑素瘤细胞A375转移能力的影响及其作用机制。方法 采用MTT法和膜联蛋白-V-FITC/PI双染色法分别检测不同浓度苦参碱对A375细胞增殖和凋亡的影响,半定量RT-PCR分析经苦参碱干预后A375细胞乙酰肝素酶mRNA的表达变化,细胞黏附实验检测细胞黏附能力的改变,基质胶侵袭实验观察细胞侵袭能力的变化。结果 苦参碱浓度≥0.5mg/mL时可抑制A375细胞增殖并诱导细胞凋亡,其作用呈剂量依赖性;苦参碱浓度在0.125～0.5mg/mL时,能明显下调A375细胞乙酰肝素酶mRNA的表达,并能抑制细胞的黏附、侵袭能力(P<0.01),其抑制效应呈剂量依赖性,在不同浓度组间比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 苦参碱在体外能抑制A375细胞的黏附、侵袭能力。苦参碱抗肿瘤侵袭可能与抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡以及下调乙酰肝素酶的表达有关。     

反义寡核苷酸抑制人恶性黑素瘤A375细胞乙酰肝素酶mRNA及其蛋白的表达

目的 研究乙酰肝素酶反义寡核苷酸(ASODN)对人恶性黑素瘤A375细胞乙酰肝素酶mRNA及其蛋白表达的影响.方法 分空白组、无关序列(N-ODN)组和反义(ASODN)组,以脂质体包埋后分别转染人恶性黑素瘤细胞株A375,采用原位杂交、免疫组化法检测乙酰肝素酶mRNA及其蛋白表达的变化.结果 转染24 h后,ASODN组A375细胞乙酰肝素酶mRNA表达较对照组、N-ODN组均显著下调(P均<0.01);转染48 h后,与对照组、N-ODN组相比,ASODN组A375细胞的乙酰肝素酶蛋白水平均显著下降(P均<0.01).结论 乙酰肝素酶ASODN可下调A375细胞乙酰肝素酶mRNA及其蛋白的表达.     

血管内皮生长因子过度表达促进恶性黑素瘤细胞增殖机制研究

目的:研究血管内皮生长因子(VEGF)过度表达促进恶性黑素瘤(MM)细胞增殖的机制。方法:通过电穿孔法将VEGF165cDNA转染至MM细胞系A375中,细胞计数法、MTT法和酶联免疫吸附实验(ELISA)法分别检测A375细胞体外增殖效应和其分泌的VEGF蛋白水平,化学比色法和蛋白印迹法(Western Blot)分别检测转染前后的A375细胞合成的诱导型、内皮型、神经型一氧化氮合酶(iNOS、eNOS、nNOS)的活性和蛋白表达。结果:转染VEGF165cDNA后,A375细胞明显增殖,其分泌的VEGF在转染后72 h、96 h明显增加(P<0.01),其合成的iNOS的活性和蛋白表达在转染后48 h、72 h、96 h明显升高(P≤0.05),但在转染前后未检测到eNOS和nNOS的活性及蛋白表达,一氧化氮合酶抑制剂L-NAME呈剂量依赖性地抑制转染72 h后的A375细胞增殖活性。结论:iNOS可能在VEGF过度表达促进MM细胞增殖中发挥重要作用。     

阿维A治疗前后对银屑病患者血管内皮生长因子表达的影响

目的 研究阿维A对血管内皮生长因子(VEGF)促银屑病血管生成的调节作用,探讨阿维A治疗银屑病的机制。方法 免疫组化法检测32例银屑病患者经阿维A治疗前后皮损的微血管密度和VEGF蛋白的表达情况。应用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测32例银屑病患者经阿维A治疗前后外周血清中VEGF水平。结果 ①银屑病患者经阿维A治疗前皮损VEGF蛋白的表达及微血管密度值显著高于治疗后(P<0.05)和正常人对照组(P<0.001)。②银屑病患者阿维A治疗前的血清VEGF水平高于治疗后(P<0.001)及正常人对照组(P<0.001)。结论 VEGF在银屑病新生血管生成中起重要作用。阿维A可能通过抗新生血管生成的作用来治疗银屑病。     

血管内皮细胞生长因子真核表达载体在HaCaT细胞中的表达

目的 探讨外源性人vEGF₁₆₅基因在HacaT细胞中表达的可行性及其对体外培养的猪毛囊的影响。方法 通过脂质体将与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因共表达的血管内皮细胞生长因子(vEGF)真核表达载体PIRES₂-GFP-vEGF₁₆₅。瞬时转染HaCaT细胞,应用激光共聚焦显微镜观察EGFF在HaCaT细胞内的表达,同时利用ELISA法检测vEGF在培养细胞被转染的上清液中的表达。进一步将该上清液加至体外培养的猪毛囊中,显微镜下测量毛囊的平均生长长度,并观察毛囊的形态学变化。结果 成功地将vEGF真核表达载体PIRES厂EGFP一vEGF₁₆₅瞬时转染了HacaT细胞,以激光共聚焦显微镜观察可见细胞内EGFP的表达,同时用ELIsA法证实了上清液中vEGF呈高水平表达,并且该上清液可以明显促进体外培养的猪毛囊生长,延缓其进人退行期。结论 应用脂质体能够成功地将外源性人vEGF₁₆₅基因转染HaCaT细胞,并进行有效表达,其表达的vEGF在体外具有促进猪毛囊生长的生物学活性。     

MIA基因-RNAi对人黑素瘤A375细胞增殖的影响

目的探讨RNA干扰技术抑制恶性黑素瘤细胞株A375MIA基因表达后,对A375细胞增殖的影响。方法构建针对人黑素瘤A375细胞(MIA)基因3个不同靶序列的RNAi真核表达载体pLTE-hMIA-RNAi,用磷酸钙细胞转染法把构建的载体分别转染HEK293细胞,采用Western技术和RT-PCR技术分别检测MIA基因蛋白的表达和mRNA水平。选择对MIA基因表达抑制作用最强的RNAi载体转染A375细胞后,用细胞计数检测细胞增殖的变化。结果构建的3个RNAi质粒和对照组相比,pLTE-hMIA-RNAi352质粒对MIA的表达减少量>80%,hMIA的mRNA水平下降约83%,与对照组比较差异有显著性意义。而pLTE-hMIA-RNAi203、pLTE-hMIA-RNAi343质粒对MIA的表达及mRNA水平的影响,与对照组比较差异无显著性意义。转染pLTE-hMIA-RNAi352质粒的A375细胞增殖能力较对照组显著下降。结论构建的针对人MIA基因352位靶序列的RNAi质粒pLTE-hMIA-RNAi352可显著抑制MIA的表达及A375细胞增殖。     

Endogenous production of nitric oxide contributes to proliferation effect of vascular endothelial growth factor-induced malignant melanoma cell

The objectives of this study were to observe the effect of overexpression of vascular endothelial growth factor (VEGF) on the proliferation of the malignant melanoma (MM) cell line A375, and to study the role of nitric oxide (NO) in this process and the mechanism of VEGF induced-A375 cell proliferation. The VEGF(165) cDNA was transfected into A375 cells by electroporation. VEGF mRNA and protein in A375 cells were detected by RT-PCR and ELISA. The proliferation of A375 cells was assessed by cell counting and MTT assay. Protein expression of iNOS, eNOS and nNOS was detected by Western blotting. NO production in A375 cell supernatant was measured by the nitrate reductase method. VEGF mRNA in A375 cells was significantly increased 72 h and 96 h after transfection of VEGF(165) cDNA, as were VEGF protein, NO and iNOS levels. However, protein expression of eNOS and nNOS was not detected in either transfected or untransfected cells. Proliferation of A375 cells transfected with VEGF(165) cDNA was enhanced. The nitric oxide synthase inhibitor l-NAME could dose-dependently inhibit the proliferation of A375 cells evoked by VEGF. These results indicate that VEGF enhances the expression of iNOS in A375 cells and results in an increase in NO formation, which may be important in the process of VEGF-induced proliferation of A375 cells.     

皮肤黑素瘤细胞与血管内皮细胞间VEGF-IL-6-STAT3信号交互作用机制

【摘要】 目的 研究皮肤黑素瘤细胞与血管内皮细胞间VEGF-IL-6-STAT3信号交互作用机制。 方法 将血管内皮细胞EC-304分成3组：对照组,常规培养;血管内皮生长因子（VEGF）组,在含VEGF165（50 μg/L）的内皮细胞培养基中培养;A375共培养组,与黑素瘤细胞A375共培养。24 h、48 h、72 h后收集培养液,酶联免疫吸附实验检测白细胞介素6（IL-6）的分泌量。将A375细胞分为4组：对照组,常规培养;A375 + EC-304组,与EC-304共培养;A375 + EC-304 + IL-6组：与EC-304细胞在含STAT3通路激动剂IL-6（50 μg/L）的DMEM中共培养;A375 + EC-304 + JSI-124组：与EC-304在含STAT3通路抑制剂JSI-124（1 μmol/L）的DMEM中共培养。分别在24 h、48 h、72 h后收集细胞,用Western印迹、CCK-8、Transwell侵袭实验分别检测STAT3、p-STAT3蛋白表达、细胞增殖活性及侵袭活性。采用双因素方差分析及t检验统计分析数据。结果 与对照组比较,VEGF组、A375共培养组EC-304培养基中IL-6分泌量均升高（FVEGF = 29.63,P < 0.001;FA375 = 11.09,P = 0.020）。与对照组比较,A375 + EC-304组A375细胞p-STAT3蛋白表达升高（P < 0.001）,细胞活性增强（P < 0.001）,侵袭细胞数从（86.13 ± 7.24）个增加到（152.66 ± 16.04）个（t = 4.43,P < 0.001）;与A375 + EC-304组比较,A375 + EC-304 + IL-6组细胞p-STAT3蛋白表达升高（P < 0.001）,细胞活性增强（P < 0.001）,侵袭细胞数量增加至（187.34 ± 14.38）个（t = 2.17,P < 0.001）;与A375 + EC-304组比较,A375 + EC-304 + JSI-124组细胞的p-STAT3蛋白表达降低（P < 0.001）,细胞活性减弱（P < 0.001）,侵袭细胞数减少至（124.92 ± 8.72）个（t = -1.86,P < 0.001）。结论 皮肤黑素瘤A375细胞与血管内皮细胞之间存在VEGF-IL-6-STAT3信号交互作用机制,这种机制可促进A375细胞的增殖和侵袭。     

乙酰肝素酶-siRNA表达载体的构建及其抑制黑素瘤细胞株体外侵袭能力的观察

目的 构建针对人乙酰肝素酶（HPSE）基因的小干扰RNA（siRNA）及其表达载体，观察其对A375细胞HPSE基因的干扰作用及其对肿瘤细胞体外侵袭的抑制作用。方法 设计并构建了重组质粒pRNATU6.1/HPSE-siRNA，转染A375细胞，用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法分别测定HPSE基因RNA和蛋白水平的表达变化，Matrigel侵袭实验观察A375细胞体外侵袭能力的改变。结果 将针对HPSE基因的siRNA的双链寡核苷酸片段正确克隆到pRNATU6.1载体；转染A375细胞，与对照组比较，HPSE-siRNA组HPSE基因和蛋白的表达均明显降低。转染后肿瘤细胞的体外侵袭能力与对照组相比受到明显抑制。结论 成功构建了针对HPSE基因的siRNA载体，HPSE-siRNA转染A375细胞可以显著降低细胞HPSE基因和蛋白的表达。     

一氧化氮在血管内皮生长因子诱导恶性黑素瘤细胞增殖机制中的研究

目的　观察血管内皮生长因子 (VEGF)过度表达对恶性黑素瘤细胞株A3 75增殖的影响 ,研究一氧化氮在其中所起的作用 ,以明确VEGF的作用机制。方法　VEGF165cDNA经电穿孔转染A3 75细胞 ,经逆转录聚合酶链反应(RT PCR)、免疫酶联吸附实验 (ELISA)检测转染前后A3 75细胞VEGF的mRNA和蛋白表达 ,应用细胞计数和MTT法比较转染组和对照组A3 75细胞增殖能力和活性 ,用硝酸还原酶法检测A3 75细胞转染前后培养上清中一氧化氮含量 ,并应用一氧化氮合酶抑制剂N 硝基 L 精氨酸甲酯 (L NAME)观察A3 75细胞转染VEGF165cDNA后的增殖情况。结果　转染VEGF165cDNA后 48h、72h和 96hA3 75细胞VEGFmRNA分别为 0 .48± 0 .0 5 ,1.2 7± 0 .0 7,1.2 4± 0 .0 1,较转染前的 0 .2 4± 0 .0 5明显增加 (P <0 .0 5 ) ;VEGF蛋白表达和一氧化氮水平也呈相同的变化趋势 (P <0 .0 5 ) ;转染VEGF165cDNA后A3 75细胞增殖能力较未转染组明显增强 (P <0 .0 5 ) ;L NAME可剂量依赖性地抑制转染后的A3 75细胞增殖活性 (P <0 .0 1)。结论　内源性的一氧化氮在VEGF促进A3 75细胞增殖中起重要作用。