不同血清培养条件下骨髓间充质干细胞的增殖

背景：目前,分离培养骨髓间充质干细胞应用最为广泛的细胞生长添加剂是胎牛血清/小牛血清,应用脐血清进行骨髓间充质干细胞培养的相关研究较少。 目的：观察不同血清培养对骨髓间充质干细胞增殖的影响。 方法：用Ficoll密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,在含脐血清、胎牛血清以及无血清的L-DMEM培养基中培养,观察各组细胞形态、增殖情况;应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD105进行表型鉴定。 结果与结论：脐血清培养后细胞形态较小,似纺锤状,细胞呈网状生长;胎牛血清培养后细胞呈梭形成纤维细胞样,呈集落样生长;脐血清和胎牛血清均能促进细胞生长增殖,但骨髓间充质干细胞在脐血清中增殖更活跃,无血清培养基本无增殖。流式细胞鉴定显示CD34、CD45阴性,CD44、CD105阳性,脐血清扩增后骨髓间充质干细胞的表面标记无明显改变。     

补肾活血中药对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响*☆

背景：骨髓间充质干细胞因其获取容易、创伤微小、具有无限扩增和多分化潜能、自体移植不存在免疫排斥反应而受到医学研究者的青睐。 目的：体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞，观察不同浓度补肾活血中药含药血清对其增殖的影响。 设计：完全随机对照的动物实验。 单位：广州中医药大学第一附属医院髋中心。 材料：选用健康雄性SD大鼠40只，SPF级，体质量170~180 g，由广州中医药大学实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。将实验动物按随机数字表分为4组，正常对照组和高、中、低剂量给药组，每组10只。 方法：实验于2005-01/03在广州中医药大学实验动物中心完成。采用Percoll密度梯度离心法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞，体外培养，建立大鼠骨髓间充质干细胞培养体系。高、中、低剂量给药组大鼠分别灌胃补肾活血中药4.4，2.2和1.1 g/kg，分别相当临床成人用量的20，10和5倍。正常对照组灌胃纯净水。连续给药1周。末次给药1 h后，无菌条件下，腹主动脉取血6 mL/只，2 000 r/min离心15 min，收集血清。高、中、低剂量给药组用10%大鼠含药血清代替10%的牛血清，正常对照组的培养基加入10%的血清。每天观察并记录细胞生长情况，绘制生长曲线。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的生长状况。②HE染色和吉姆萨染色观察骨髓间充质干细胞形态。③免疫细胞化学法检测骨髓间充质干细胞的抗原表达。④不同浓度含药血清对骨髓间充质干细胞生长情况的影响。 结果：①骨髓间充质干细胞的生长状况：原代培养的骨髓细胞24 h后开始贴壁，7 d后可达80%融合。②骨髓间充质干细胞的一般形态：骨髓间充质干细胞的细胞多成长梭形或多角形，细胞体积小，胞核位于胞中或稍偏，核浆比略大。③髓间充质干细胞的抗原表达：单个核细胞的胞浆中有CD44表达，着蓝色，部分骨髓间充质干细胞表达c-Kit，在表型表达和细胞形态上具备骨髓间充质干细胞特征。④补肾活血中药对骨髓间充质干细胞生长曲线的影响：高、中、低剂量给药组在加入补肾活血中药血清3 d后，骨髓间充质干细胞数量比空白对照组明显增多，并与剂量呈正比。 结论：补肾活血中药含药血清能促进骨髓间充质干细胞的体外增殖。     

脑脊液体外培养骨髓间充质干细胞★

背景：细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段，但目前尚缺乏脑脊液对细胞影响的实验依据。 目的：动态观察体外脑脊液培养骨髓间充质干细胞的变化。 方法：采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞，并传代扩增。选择生长良好的第3，4代细胞接种于脑脊液中，通过细胞免疫化学染色法鉴定脑脊液对细胞表型的影响。取生长良好的第5代细胞，分别用含小牛血清的L-DMEM和脑脊液培养。 结果与结论：运用密度梯度离心结合贴壁培养法能成功有效地分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞，表型鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性，CD45阴性。脑脊液培养后细胞仍为骨髓间充质干细胞形态，并可见少量小圆细胞，表现为神经样细胞，表形鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性，CD45阴性，神经元特异性烯醇化酶呈弱阳性(<1%)。细胞具有相似的S形生长曲线，生长曲线基本相似。提示骨髓间充质干细胞在脑脊液培养基中可继续生长和增殖，无诱导分化作用，且细胞对生长环境有高度的适应性。     

微载体cytodex3培养技术在大量扩增成人骨髓间充质干细胞中的应用

背景：间充质干细胞可以在体内或体外分化成肝样细胞,但是间充质干细胞数量少,在1×104~1×105个骨髓有核细胞中仅有一个,肝细胞移植和生物人工肝的治疗都需要1×1010级的细胞数,利用常规的单层培养方法难以实现。 目的：建立一种体外分离、大量扩增培养成人骨髓间充质干细胞的方法。 设计、时间及地点：随机对照实验。实验于2005-09/2006-04在上海市消化外科研究所（上海市教委重点实验室）及上海交通大学医学院附属瑞金医院普外科和器官移植中心完成。 材料：骨髓标本收集于上海交通大学医学院附属瑞金医院血液科骨髓检查正常者,供者均为知情同意志愿者。 方法：采用Percoll 梯度离心结合贴壁法分离人骨髓间充质干细胞。应用微载体cytodex3 培养人骨髓间充质干细胞,以普通单层聚苯乙烯（TCPS）培养作对照,用流式细胞仪（FCM）和MTT 法对其细胞表型和增殖活性进行检测。 主要观察指标：①hMSCs的分离及培养。②hMSCs的形态学观察。③hMSCs在cytodex 3表面生长时的增殖活性测定。④hMSCs在cytodex 3表面生长时FCM细胞周期测定。 结果：①流式细胞仪检测表明,微载体cytodex3 表面生长的人骨髓间充质干细胞表面标记与普通单层聚苯乙烯培养时一致,表达CD29、CD44 和CD105,而不表达CD14、CD34、CD45、VLA-1 和HLA-DR。②MTT检测显示,人骨髓间充质干细胞第1~3 天处于适应期,3 d后进入对数生长期,人骨髓间充质干细胞此期间在TCPS 和cytodex3 表面的增殖活性无差异(P > 0.05),而在普通单层聚苯乙烯表面培养时,人骨髓间充质干细胞6 d后进入衰退期,而cytodex3 表面生长第9天时仍然处于对数生长,差异显著(P < 0.05)。③流式细胞仪分析表明,人骨髓间充质干细胞在TCPS和cytodex3 表面培养细胞周期分布相同,差异不显著(P > 0.05)。 结论：微载体cytodex3 培养技术可以很好地大量扩增人骨髓间充质干细胞,并能保持其良好的增殖活性。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景：目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法。 目的：联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。 设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2007-10/2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成。 材料：2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养，1.073 kg/L的Percoll分离液。 方法：实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞, 在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后，经贴壁培养及反复换液纯化骨髓间充质干细胞。分别取第3，5，7，9代骨髓间充质干细胞，行细胞计数，绘制细胞生长曲线。 主要观察指标：倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况。采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。CD44染色呈阳性，CD34染色呈阴性，说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞。 结果：增殖传代的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。随传代次数的增加，细胞增殖能力逐渐下降，第3~5代细胞增殖能力强。所分离培养的细胞均表达CD44,不表达CD34。 结论：在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞。     

独参汤促进骨髓间充质干细胞体外增殖：最佳干预剂量的筛选

背景：骨髓间充质干细胞移植后极低的生存率限制了它的治疗作用，现正在寻找合适的药物促进其增殖。 目的：观察独参汤是否能促进骨髓间充质干细胞的增殖，并筛选出最佳干预浓度。 方法：分离培养Wistar大鼠骨髓间充质干细胞。培养、传代至第5代，利用流式细胞仪检测表面分子标记物。以每孔1×104数量种于96孔板。将独参汤颗粒剂分别以10，5，2.5，1.25，…0.019 5 g/L的质量浓度干预骨髓间充质干细胞，于第1，7天MTT法检测其增殖情况。 结果与结论：①原代细胞接种2 d后多数细胞贴壁，传代后细胞贴壁速度和增殖更快，第5代基本纯化为骨髓间充质干细胞，细胞呈放射状或漩涡状排列。②第5代骨髓间充质干细胞CD44阳性细胞占94.7%，CD90阳性细胞占86.8%，CD34阴性细胞占98.7%，CD45阴性细胞占97.1%。③独参汤浓度在0.625，0.312 5，0.156，0.078，0.039，0.019 5 g/L质量浓度时均可以促进骨髓间充质干细胞在体外的增殖。其中在质量浓度为0.078 g/L时作用最强。     

应用密度梯度离心和贴壁筛选法分离兔骨髓间充质干细胞

背景：特定条件下,骨髓间充质干细胞可向成骨细胞、成软骨细胞等细胞分化。但骨髓中间充质干细胞含量极低,体外如何获取、纯化并使其高效快速增殖是组织工程技术应用和推广的前提。 目的：优化获取兔骨髓间充质干细胞并对其进行纯化、鉴定,同时对其生物学性状进行观察。 设计、时间和地点：观察性实验,于2005-09/2006-07在同济医学院实验动物中心完成。 材料：兔龄2个月雌性新西兰纯种大耳白兔1只,用于间充质干细胞取材及原代培养。 方法：采用密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代对抽取的骨髓液进行纯化。首先将培养瓶中的培养液吸出,加PBS后再加入2.5 g/L胰酶约3.0 mL,置于37 ℃培养箱中,两三分钟后在倒置显微镜下观察细胞形态,当细胞胞质回缩,细胞变瘦长,细胞间隙增大,同时有少量脱壁的圆形细胞时可终止消化,加入含血清的L-DMEM完全培养基即可。按1.0×108 L-1的密度接种到一次性塑料培养瓶中进行培养。 主要观察指标：间充质干细胞的形态、超微结构和表面标志物的表达;第1,3,5,8,10代细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线。 结果：①经密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代方法所得的间充质干细胞很纯,第3代和第5代细胞形态单一,细胞排列具有典型的漩涡状结构。②透射电镜观察显示间充质干细胞核大,以圆形或类圆形为主,胞核比例大,细胞器少,为低分化细胞。③传代培养的间充质干细胞生长曲线呈S型,第1,3,5代细胞增殖能力强,细胞生长旺盛,而第8,10代细胞增殖明显减弱。④所分离培养的细胞表达CD44、CD90,不表达CD34,电镜观察为低分化细胞。 结论：分离培养的细胞为间充质干细胞且成分单一,具有干细胞特性,第3代和第5代细胞很纯且其增殖能力强。     

体外全骨髓法培养人骨髓间充质干细胞的生物学性状

目的：现阶段多以动物为材料培养观察骨髓间充质干细胞的生长特性，对人骨髓间充质干细胞培养和生长特性的研究相对较少。为此实验培养人骨髓间充质干细胞，拟建立稳定的培养方法。 方法：实验于2007-03/09在泸州医学院中心实验室省级重点实验室完成。①实验材料：6个月以上流产胎儿由泸州地区妇产医院提供，产妇及家属对实验知情同意，并经医院伦理委员会批准。②实验方法：应用全骨髓培养法培养人骨髓间充质干细胞，采用差速贴壁对细胞进行纯化。③实验评估：倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生物学特点，应用MTT法间接测定骨髓间充质干细胞活性。 结果：①培养4 h,见骨髓间充质干细胞已开始贴壁，胞体由圆形变为不规则形或三角型，培养第2~4 天，见间充质干细胞胞体向两端伸出二三个粗短突起，此时细胞形态渐变为梭型，呈成纤维细胞样生长，并聚集成集落；随着细胞的生长，贴壁细胞逐渐表现为脊梁状、旋涡状生长，细胞突起增长、增粗，并可发出更细的分支，突起间可相互交织成网。培养7 d时，见细胞铺满瓶壁面积的70%~80%，细胞排列紧密，此时骨髓间充质干细胞铺成单层。苏木精－伊红染色见细胞多为长梭型，有突起及分支，胞体较大，核一个，较大，呈椭圆，着色浅，可见多个的核仁，胞质浅红色。②骨髓间充质干细胞表面标志CD44免疫组织化学检测，可见胞膜出现棕黄色阳性反应。③MTT法分别检测结果显示，2~6代细胞于酶标仪490 nm波长处 吸光度值无明显差异，但均高于七八代细胞。 结论：利用全骨髓培养法成功地培养出人胎儿骨髓间充质干干细胞，且第3~6代细胞纯度高、活性好。     

脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的比较

背景：为避免骨髓间充质干细胞培养过程中应用异种血清的排斥以及提高骨髓间充质干细胞培养效率,制备脐带血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞是目前的研究热点。 目的：比较脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性。 设计、时间及地点：开放性实验,于2006-10/2008-06在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成。 材料：16份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供。 方法：采用Ficoll Paque细胞分离液从16例新鲜成人骨髓穿刺液中分离骨髓间充质干细胞,分别用含体积分数为10%脐带血清、成人自体血清的DMEM/F12培养基培养,取第4代细胞进行实验。流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系分别诱导各组骨髓间充质干细胞定向分化,通过细胞形态观察、免疫表型及免疫化学染色进行鉴定。 主要观察指标：①细胞形态。②骨髓间充质干细胞计数和细胞周期。③表面标志物的鉴定。④免疫组织化学染色观察骨髓间充质干细胞诱导成骨、成脂情况。 结果：①脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞在增殖数量和速度上优于成人自体血清组(P < 0.05)。两种血清培养条件下,只有少数细胞处于活跃的增殖期,脐带血清组S期细胞多于成人自体血清组(P < 0.05)。②脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞表达CD29、CD73、CD105的阳性率均在90%以上,高于成人自体血清组(P < 0.05);而CD31、CD34、CD45的阳性率均在2%以下,CD31阳性率低于成人自体血清组(P < 0.05)。③脐带血清培养的骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞阳性率和脂肪细胞阳性率均高于自体血清组(P < 0.05)。 结论：脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞的纯度和体外诱导分化能力比成人自体血清组高,更适合临床应用。     

来源于骨髓、外周血与脐带血的间充质干细胞生物学特性比较

背景：间充质干细胞存在于人体多种组织,目前研究报道所用细胞来源单一,培养方法差异大,得出的结果不一致,不能证明分离、培养出的细胞是相同的细胞,难以比较。 目的：课题提出在体外培养条件下可对同一个体来源的骨髓、外周血来源间充质干细胞及不同个体脐带血来源间充质干细胞的生物学特性进行比较的理论假设。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2007-06/2008-12在解放军海军总医院血液科完成。 材料：解放军海军总医院血液科造血干细胞移植供者10例,取同一供者的骨髓、外周血细胞,细胞体积分别为20 mL与2 mL。解放军海军总医院产科10例健康初产妇脐带血细胞,细胞体积为30 mL。 方法：采用Percoll密度梯度+贴壁法分离骨髓、外周血、脐带血来源的间充质干细胞,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。当细胞生长汇合至80%~90%时胰蛋白酶-EDTA消化,制成5×108 L-1细胞悬液,计为P0。重复上述操作,即为P1,依此类推P2~P5。 主要观察指标：细胞生长形态观察,细胞瑞氏-吉姆萨染色结果,细胞化学染色结果,细胞增殖数量,流式细胞仪检测细胞表面标记。 结果：①骨髓间充质干细胞贴壁时间、汇合至50%时间、汇合至80%时间均早于外周血、脐带血间充质干细胞;骨髓间充质干细胞培养5~7 d时呈漩涡状生长,而外周血、脐带血间充质干细胞无此生长特性。②初始培养和传代培养后,骨髓间充质干细胞多为成纤维样细胞,仅有少量内皮样细胞;而传至第5代的外周血、脐带血间充质干细胞除有成纤维样细胞外,还有较多的内皮样细胞和单核-巨噬样细胞。③P1~P5骨髓、外周血及脐带血来源间充质干细胞PAS染色、碱性磷酸酶染色、苏丹黑B染色均呈阴性。④与P0细胞比较,传代培养至P5后骨髓间充质干细胞增殖数量明显多于外周血、脐带血间充质干细胞(P < 0.05)。⑤CD29,CD44,CD90,CD71,CD105,CD166和HLA-ABC阳性率,骨髓间充质干细胞接种后≤6%, P0~P5为55.9%~92.8%;外周血间充质干细胞接种后≤10%,P0~P5为19.7%~33.4%;脐带血间充质干细胞接种后≤20%,P0~P5为35.4%~93.2%。CD34,CD45和HLA-DR阳性率,3种来源的间充质干细胞均极低。CD14,CD31阳性率,骨髓间充质干细胞极低,外周血间充质干细胞为12.1%~28.3%,脐带血间充质干细胞为8.1%~21.3%。 结论：结果显示在体外培养条件下,骨髓、外周血和脐带血均能较好地形成间充质干细胞,以骨髓来源的间充质干细胞含量最高,成分单一,而脐带血和外周血含量次之,细胞成分多。