CD59真核表达载体的构建及其对Jurkat细胞增殖的影响

目的构建pIRES-CD59融合基因真核表达载体,探讨重组CD59在Jurkat细胞增殖中的作用。方法 RT-PCR法选择性扩增编码CD59的基因片段,克隆入pIRES真核表达质粒。脂质体法将重组载体转染Jurkat细胞,通过G418筛选获得稳定表达CD59的细胞克隆,利用RT-PCR和Western blot检测细胞中CD59的表达,通过MTT法检测Jurkat细胞的增殖。结果经酶切和测序鉴定表明携带CD59基因的重组质粒构建成功,RT-PCR和Western blot结果显示转染Jurkat细胞的CD59基因高表达,MTT实验显示转染CD59重组质粒的Jurkat细胞增殖速度明显快于对照组(P<0.05)。结论 pIRES-CD59真核表达载体在转染细胞Jurkat中可高表达CD59分子,并可影响Jurkat细胞的增殖,为研究CD59的生物学作用奠定了基础。     

SETD4对脂多糖诱导的AML12细胞IL-6转录的调控作用

目的　探讨SETD4（SET-domain containing protein 4）对脂多糖（LPS）诱导的AML12（小鼠肝脏细胞系）细胞IL-6的转录调控作用。 方法　构建SETD4表达质粒和IL-6 启动子荧光素酶报告基因质粒,共转染小鼠肝脏细胞系AML12,使用双荧光素酶报告基因技术检测LPS刺激后IL-6 启动子荧光素酶活性;单独转染SETD4表达质粒上调AML12细胞SETD4表达,检测LPS刺激后IL-6 mRNA水平变化。 结果　双酶切鉴定及核酸测序证实重组质粒pcDNA3.0/HA-SETD4、pGL3.0/IL-6 promoter的构建成功。pcDNA3.0/HA-SETD4与pGL3.0/IL-6 promoter共转染AML12细胞,LPS刺激后SETD4对IL-6 启动子荧光素酶活性没有影响;上调SETD4表达后,可以促进LPS诱导的IL-6 mRNA转录。 结论　成功构建SETD4真核表达质粒和IL-6启动子荧光素酶报告基因质粒;SETD4对LPS诱导的AML12细胞IL-6的转录发挥正调控作用。     

固有免疫分子TRIM5α对乙型肝炎病毒复制的影响

目的:构建固有免疫分子TRIM5α的真核表达质粒,研究TRIM5α 对HBV复制的影响.方法:通过巢氏RT-PCR技术从恒河猴肺组织中扩增出TRIM5α的编码基因,并将其克隆入pcDNA3.1真核表达载体.将TRIM5α真核表达质粒转染HepG2细胞,用Western blot的方法鉴定TRIM5α蛋白表达情况.将TRIM5α真核表达质粒与复制型HBV质粒通过磷酸钙沉淀法共转染HepG2细胞、通过尾静脉高压注射法共转染BALB/c小鼠.ELISA检测转染细胞上清及小鼠血清中的HBsAg和HBeAg;免疫组化检测小鼠肝组织HBcAg的表达;Southern blot检测转染细胞中HBV复制中间体.将TRIM5α真核表达质粒转染293T细胞3小时后,再将基于HIV-1结构的慢病毒载体三质粒系统转染293T细胞,通过检测转染细胞上清中的HIV-1 p24抗原含量来鉴定TRIM5α抗HIV-1功能.结果:成功构建TRIM5α真核表达质粒;过表达TRIM5α不能有效降低HBV抗原和复制中间体水平,但可抑制HIV-1 p24抗原的表达.结论:TRIM5α不能有效抑制HBV的复制.     

pEGFP-N3-TRIM22真核表达载体的构建及在HEK293T细胞中的表达

目的构建pEGFP-N3-TRIM22真核表达载体,观察其在293T细胞中的表达特点。方法用RT-PCR法扩增出TRIM22基因编码序列,克隆至真核表达载体pEGFP-N3,通过菌落PCR、双酶切及测序进行鉴定。将pEGFP-N3-TRIM22载体转染293T细胞,通过流式细胞仪、荧光显微镜观察TRIM22-EGFP的表达;通过激光共聚焦,经Lyso Tracker Deep Red及DAPI分别染色溶酶体及细胞核,观察TRIM22-EGFP在293T细胞的分布特点。结果经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,成功构建pEGFP-N3-TRIM22真核表达载体。流式细胞仪检测发现,转染细胞中TRIM22-EGFP+细胞约70%左右。荧光显微镜检测发现,TRIM22-EGFP在293T细胞中能以弥散、小斑点或大颗粒团块3种形式存在。激光共聚焦检测发现,在不同的293T细胞中TRIM22-EGFP可分别优势表达于细胞核、细胞浆,或者在胞核及胞浆均有大量表达。结论 TRIM22-EGFP能以弥散、小斑点或大颗粒团块形式分布于细胞核或细胞浆中。     

TRIM31 过表达改善脂多糖诱导下神经细胞的炎症损伤

目的:探讨E3泛素连接酶31(TRIM31)对LPS诱导PC12细胞炎症性损伤的保护作用和机制。方法:用不同浓度LPS处理PC12细胞24 h,MTT法检测细胞增殖活性,Western blot检测LPS最佳浓度处理后PC12细胞TRIM蛋白表达水平。将TRIM31过表达质粒(pcDNA3.1-TRIM31)及其阴性对照质粒(pcDNA3.1-NC)转染至PC12细胞,qRT-PCR和Western blot检测细胞TRIM31 mRNA和蛋白表达水平。PC12细胞分为对照组(Control)、LPS组、LPS+NC组和LPS+TRIM31组,分组干预后,ELISA检测细胞上清IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量,流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫荧光检测NLRP3蛋白表达,qRT-PCR检测NLRP3、caspase-1 mRNA表达,Western blot检测NLRP3、caspase-1、Cleaved-caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果:LPS剂量增加,PC12细胞增殖活性逐渐降低(P0.05),LPS处理可降低PC12细胞TRIM31蛋白表达水平(P0.01),TRIM31过表达,PC12细胞TRIM31 mRNA和蛋白表达水平显著提高(P0.05)。与Control组相比,LPS组细胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量、细胞凋亡率及细胞Cleaved-caspase-3和Bax蛋白水平显著提高(P0.05),Bcl-2和TRIM31蛋白水平显著降低(P0.05),NLRP3蛋白荧光强度及NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表达水平显著提高(P0.05);与LPS组相比,LPS+TRIM31组细胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量、细胞凋亡率及细胞Cleaved-caspase-3和Bax蛋白水平显著降低(P0.05),Bcl-2蛋白水平显著提高(P0.05),NLRP3荧光强度及NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P0.05)。结论:过表达TRIM31能通过抑制NLRP3炎症小体活化,改善LPS诱导的PC12细胞炎症损伤。     

人白细胞介素-3基因cDNA的克隆及其真核表达质粒的构建

目的:克隆人白细胞介素-3(hIL-3)基因cDNA,构建其真核表达质粒pcDNA3/hIL-3。方法:从人外周血单个核细胞中提取IL-3mRNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增IL-3基因cDNA,通过T/A克隆法,首先构建pUCm-T/hIL-3,然后构建其真核表达型载体pcDNA3/IL-3。结果:pUCm-T/hIL-3内插入片段序列与hIL-3基因序列一致;pcDNA3/IL-3经酶切鉴定与预期结果一致。结论:成功完成了hIL-3基因克隆和pcDNA3/IL-3真核表达质粒的构建。     

小鼠白细胞介素21 cDNA的克隆及真核表达质粒的构建

目的：克隆小鼠自细胞介素2l(IL-21)基因，构建真核表达质粒，用以进行肿瘤的基因治疗。方法：用RT-PCR法。从ConA活化的小鼠T细胞中扩增IL-21 cDNA。克隆人哺乳动物细胞高效表达质粒pcDNA3．1中，构建重组mIL-21真核表达质粒。重组体用载体上的通用引物和PCR下游引物为测序引物，鉴定克隆的正确性。将已鉴定的重组质粒用脂质体法转染Sp2／0细胞，用RT-PCR法鉴定转染细胞中IL-21基因的表达，用MTT比色法检测表达的mIL-21诱导的NK细胞杀伤活性的增强。结果：正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1／mIL-21，并在转染的细胞中检测出IL-2l的表达，表达的mIL-21可在体外增强NK细胞的杀伤活性：结论：成功地构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1／mIL-21，为进一步在肿瘤动物模型中进行IL-21基因治疗及疗效观察奠定了基础.     

鼠β-防御素2(mBD2)真核表达质粒的构建及稳定表达株的鉴定

目的：对小鼠β防御素-2（mBD2）基因进行克隆,构建其真核表达载体,筛选出稳定表达细胞株,并研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤机制。方法：通过向BALB/c小鼠腹腔注射内毒素（LPS）,建立小鼠急性时相反应,取其肺组织提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增小鼠mBD2基因,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pcDNA3.1（＋）真核表达载体,对其进行酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/mBD2转染SiHa细胞,采用G418进行稳定表达株的筛选,用免疫荧光染色和RT-PCR鉴定细胞内mBD2蛋白表达情况。结果：提取小鼠肺组织总RNA,采用RT-PCR方法扩增了250bp左右的产物,通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,构建了真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/mBD2。SiHa被该质粒转染后,在100mg/LG418浓度下筛选20d,得到了稳定表达mBD2的细胞株,用免疫荧光染色显示mBD2蛋白在胞质中有大量表达,RT-PCR反应扩增到了mBD2的mRNA。结论：成功地构建了pcDNA3.1（＋）/mBD2真核表达质粒,mBD2蛋白在SiHa细胞中能稳定表达,这些结果为进一步深入研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤的作用奠定了基础。     

小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对NIH3T3细胞增殖的影响

目的:研究新发现的小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响,探讨基因的生物学功能。方法:构建真核表达质粒pcDNA3.1( )-Biot2,由脂质体包裹稳定转染NIH3T3细胞,用Realtime RT-PCR、Western blot等方法筛选和鉴定Biot2表达阳性细胞克隆,研究其与细胞增殖相关的生物学特征的变化。结果:成功构建真核表达重组质粒pcDNA3.1( )-Biot2,并稳定转染于NIH3T3细胞。与对照组相比,转染了Biot2cDNA的NIH3T3细胞生长速率明显增快。结论:成功地建立稳定转染小鼠新基因Biot2的NIH3T3细胞克隆;Biot2基因能影响细胞增殖的调节,促进NIH3T3细胞的增殖,为进一步研究基因生物学功能奠定了基础。     

植烷酸氧化酶真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的构建小鼠植烷酸氧化酶（Phyh）真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到Phyh编码序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH3T3细胞;使用细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA-Phyh在NIH3T3细胞中的表达及蛋白定位进行分析。结果 PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-Phyh真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞质中。结论成功构建了带HA标签的小鼠Phyh真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究Phyh的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

人CD23基因的扩增及其在HEK 293T细胞的高效表达

目的建立一个有效表达CD23的系统。方法采用RT-PCR方法,从外周血淋巴细胞中扩增人的CD23cDNA基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3·1B上,构建成pcDNA3·1/CD23质粒表达载体;将pcDNA3·1/CD23质粒转染HEK293T细胞,通过流式细胞仪和Westernblot检测CD23在细胞中的表达情况。结果扩增的CD23cDNA序列与文献报道的一致;通过构建表达载体和转染细胞实现了CD23cDNA在293T细胞膜上的表达。转染效率达80%以上,并获得了较高水平的表达。结论扩增CD23cDNA基因,经过转染HEK293T细胞,实现了CD23在HEK293T细胞的高效表达。     

Preliminary study on mouse interleukin-21 application in tumor gene therapy

lnterleukin-21(IL-21)is a recently characterized T cell-derived cytokine with a significant homology to IL-2,IL-4 and IL-15.To determine whether IL-21 has broad immunoregulatory activity and can stimulate durableantitumour responses,we constructed mouse IL-21(mIL-21) recombinant plasmid and evaluated its antitumorefficacy.Mouse IL-21 cDNA was amplified from Con A-activated mouse T cells by RT-PCR.RecombinantpcDNA3.1/mIL-21 was constructed and transfected into Sp2/0 cells.Mouse IL-21 expression was analyzed byWestern blotting and its activities were detected by ~3H-TdR incorporation and MTT assay.The recombinantpcDNA3.1/mIL-21 was injected s.c.into tumor lump.Tumor size,weight,the activities of CTLs,NK cells andLAK cells and serum IFN-γ,level were measured for evaluating mIL-21 mediated antitumor responses.Theresults indicated that mIL-21 was correctly expressed in Sp2/0 cells and it can improve the proliferation of Tcells and B cells,and enhance NK cytotoxic activity in vitro.The activities of CTL and NK cells,and serumIFN-γlevel were significantly improved,furthermore the tumor growth was obviously suppressed inpcDNA3.1/mIL-21 treated mice.However,the LAK activity did not alter significantly.Taken together,thisstudy suggests that the injection with recombinant plasmid containing mIL-21 is a potential approach fortumor gene therapy.Cellular & Molecular Immunology.2004;1(6):461-466.     

大鼠IL-10基因真核表达质粒的构建及其在BRL细胞中的表达

目的:构建大鼠IL-10基因的真核表达载体,观察其在大鼠肝细胞系BRL中的表达,比较有无受体介导的脂质体的转染效率.方法:抽提外周血单个核细胞的总RNA,通过RT-巢式PCR方法获得大鼠IL-10的全长编码序列,定向克隆到真核表达载体pcDNA3.0,并进行限制性内切酶酶切及测序鉴定.将重组质粒分别通过脂质体TransfastTM与去唾液酸糖蛋白受体介导的脂质体PEIjet-gal转入大鼠肝细胞系BRL,通过RT-PCR方法检测IL-10 mRNA的表达,比较二者的转染效率,用ELISA法检测后者分泌型IL-10的表达.结果:经酶切及测序鉴定证实,重组质粒插入片段与大鼠IL-10的全长编码序列完全相符.发现受体介导的脂质体PEIjet-gal转染效率明显高于非受体介导的脂质体TransfastTM .通过受体介导的脂质体转染,BRL细胞获得高水平的IL-10表达.结论:成功地构建pcDNA3.0-IL-10重组质粒.受体介导的脂质体对肝细胞有较高的转染活性,可能成为IL-10基因治疗肝纤维化的有效转染载体.     

miRNA let-7a1真核表达载体的构建及对肺癌细胞增殖的影响

目的： 构建miRNA let-7a1真核表达载体,研究其在肺癌A549细胞株的表达及对A549细胞增殖的影响。方法：以人肺癌细胞A549的总RNA为模板,RT-PCR扩增miRNA pre-let-7a1基因序列, 将miRNA pre-let-7a1基因克隆到真核表达载体pSilencerTM4.1-CMV neo中,构建成pSilencerTM 4.1-let-7a1重组体。将pSilencerTM 4.1-let-7a1表达载体瞬时转染肺癌A549细胞,RT-PCR法检测miRNA let-7a1在转录水平的表达。根据miRBase Targets数据库,查hsa-let-7a1靶序列,构建 let-7a1靶序列-报道基因融合质粒pMIR-report-let-7a1T,与pSilencerTM 4.1-let-7a1表达载体共转染A549细胞,通过荧光素酶活性检测pSilencerTM 4.1-let-7a1质粒对其靶序列的作用。MTT法检测pSilencerTM 4.1-let-7a1转染A549细胞后,对细胞增殖的影响。结果：pSilencerTM 4.1-let-7a1真核表达栽体和let-7a1靶序列-报道基因融合质粒经酶切及测序鉴定正确。pSilencerTM 4.1-let-7a1转染 A549细胞后,经RT-PCR证明能有效表达miRNA let-7a1。 pSilencerTM 4.1-let-7a1 质粒和pMIR-report-let-7a1T质粒共转染A549细胞后,通过报告基因检测,相对荧光素酶活性明显降低,表明pSilencerTM 4.1-let-7a1转染A549细胞后,可表达let-7a1并具有生物学活性。MTT检测结果显示：pSilencerTM 4.1-let-7a1 转染后的A549活细胞数目明显减少。结论：成功构建了真核表达载体pSilencerTM 4.1-let-7a1,转染肺腺癌A549细胞后能有效表达,miRNA let-7a1基因过表达抑制A549细胞的增殖。     

CD80/IgG融合基因重组表达载体的构建及在CHO细胞中功能性表达的研究

目的 构建CD80/IgG真核表达载体,使其在中国地仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovurm,CHO）中功能性表达,寻找消除白血病细胞免疫逃逸的有效方法.方法 采用定向分子克隆技术将小鼠CD80胞外段和IgG1 Fc段的cDNA串联至真核表达载体pcDNA3.0中,运用脂质体将所得的重组子转染CHO细胞,经免疫印迹、斑点ELISA检测其表达,免疫亲和层析法纯化其表达产物,用流式细胞术、MTT比色法及ELISA在体外检测该产物的生物学活性.结果 两段目的基因按预期设想克隆入空载体中并得到了表达,亲和层析纯化获得了高纯度目的蛋白,该蛋白能够将白血病细胞表面CD80分子密度提高5倍,并可显著增强同种异体小鼠淋巴细胞的增殖、对白血病细胞的杀伤以及Ⅱ-2的分泌.结论 成功构建了融合基因真核表达载体,其表达产物在体外具有相应的生物学功能,有希望成为消除白血病细胞免疫逃逸的有力工具.     

IL-17体内外抗肿瘤作用及其机制研究

目的研究IL-17体内外抗肿瘤作用及其机制,为IL-17基因疫苗进入临床提供实验依据。方法建立稳定转染小鼠IL-17全长基因的小鼠乳腺癌细胞(4T1/IL-17)及相应的对照细胞(4T1/pcDNA3.1、4T1),MTS法检测3种细胞的体外增殖情况;流式法检测3种细胞表面MHCI、MHCⅡ、LFA-1分子表达的变化及3种细胞的凋亡情况。建立荷瘤动物模型,观察3种细胞移植瘤在小鼠体内成瘤性、生长情况及小鼠生存期的变化。接种肿瘤细胞6周后分别检测3组小鼠脾细胞CTL杀伤活性、脾细胞增殖情况。用ELISA法检测小鼠脾细胞经刺激后产生IFN-γ、IL-12的情况;流式细胞技术检测4T1/IL-17细胞接种于小鼠体内的细胞凋亡情况及肿瘤组织细胞表面MHCI、MHCⅡ、LFA-1等分子表达的变化。结果转染IL-17基因后在体外对4T1/IL-17、4T1/pcDNA3.1和4T1细胞的增殖;MHCI、MHCⅡ、LFA-1分子表达;细胞凋亡无影响。将4T1/IL-17细胞接种小鼠体内后,荷瘤小鼠的肿瘤生长速度、体积均明显小于4T1/pcDNA3.1细胞组及4T1细胞组,生存时间也明显延长(P<0.05);肿瘤细胞凋亡率明显增高(P<0.05);细胞表面MHCI、MHCⅡ、LFA-1分子表达水平显著性增高(P<0.01);CTL杀伤活性及对ConA刺激的细胞增殖反应性均明显升高(P<0.01);可产生高水平的IFN-γ、IL-12,有显著性差异(P<0.01)。结论 IL-17在体外未显示抗肿瘤作用,IL-17在小鼠体内具有明显的抗肿瘤作用,其抗肿瘤作用与促进肿瘤细胞细胞凋亡及增强机体免疫应答有关。     

杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达

目的：构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（alllastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin，并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法：提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA3．1（＋）中，构建真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin。以pcDNA3．1-amastin转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光染色法和RT-PCR分别鉴定pcDNA3．1-amastin的瞬时表达和稳定表达。结果：在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光，表明pcDNA3．1-amastin成功地转入NIH3T3细胞，并在细胞膜和细胞内获得短暂表达。稳定转染的NIH3T3细胞的总RNA经反转录后，用PCR扩增出无鞭毛体蛋白基因，表明获得了稳定表达。结论：成功地构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的真核表达重组质粒，并且该基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达。     

Regulation of interleukin 2 gene expression: discrepancy between enhancer activity and endogenous gene expression

A 630-bp fragment of the human interleukin 2 (IL 2) promoter (+51 to -584) permitted expression of a reporter gene transfected into a mouse T cell lymphoma line (EL4) upon induction with phorbol ester. In contrast, when a human T cell lymphoma (Jurkat) was transfected with the same plasmid and subsequently induced with phorbol ester together with phytohemagglutinin, a very low expression of the transfected gene was observed. The endogenous IL 2 gene was equally well expressed in both cell lines upon induction. Thus, the expression of the endogenous and the transfected gene did not correlate in Jurkat cells. An SV 40 enhancer element cloned 5' of the IL 2 promoter did not result in constitutive expression after transfection to either cell line, rather the IL 2 promoter retained the need for induction. The addition of an enhancer element increased the induced expression of the transfected gene in Jurkat cells into proximity of that observed in induced EL4 cells, indicating that additional sequence elements not contained in the 630-bp fragment are needed for proper expression of the IL 2 gene in Jurkat cells.