SARS冠状病毒多聚酶基因临床检测方法的建立

目的分析SARS冠状病毒广东株多聚酶基因片段的异质性,建立RT-PCR检测SARS冠状病毒的方法,为SARS的快速诊断提供依据。方法合成针对SARS冠状病毒多聚酶基因区段的特异性引物,从广东省SARS病人及疑似病人标本中提取RNA,经反转录和巢氏PCR扩增出相应大小的DNA片段。对这些片段克隆后进行DNA序列分析,并将序列与SARS冠状病毒和其他已知冠状病毒进行同源性分析。结果从多例SARS病人痰、咽拭子或血液标本中得到RT-PCR阳性片段,随机选取其中8例经克隆和DNA序列分析证实均为SARS冠状病毒序列(同源性100%),而所有阴性参照标本RT-PCR均为阴性。克隆片段BNI109与已知冠状病毒在核苷酸和氨基酸水平进行分析显示,该片段与牛冠病毒(bovinecoronavirus,BCV)和鼠肝炎病毒(murinehepatitisvirus,MHV)同源性最高,在氨基酸水平上同源性高达75%。结论SARS冠状病毒多聚酶基因片段BNI109的保守性极强,适合建立RT-PCR法检测SARS冠状病毒。     

SARS冠状病毒多聚酶基因临床检测方法的建立

目的 分析SARS冠状病毒广东株多聚酶基因片段的异质性。建立RT-PCR检测SARS冠状病毒的方法，为SARS的快速诊断提供依据。方法 合成针对SARS冠状病毒多聚酶基因区段的特异性引物，从广东省SARS病人及疑似病人标本中提取RNA，经反转录和巢氏PCR扩增出相应大小的DNA片段。对这些片段克隆后进行DNA序列分析，并将序列与SARS冠状病毒和其他已知冠状病毒进行同源性分析。结果 从多例SARS病人痰、咽拭子或血液标本中得到RT-PCR阳性片段，随机选取其中8例经克隆和DNA序列分析证实均为SARS冠状病毒序列(同源性100％)，而所有阴性参照标本RT-PCR均为阴性。克隆片段BNll09与已知冠状病毒在核苷酸和氨基酸水平进行分析显示，该片段与牛冠病毒(bovinecoronavirus，BCV)和鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus，MHV)同源性最高，在氨基酸水平上同源性高达75％。结论 SARS冠状病毒多聚酶基因片段BNll09的保守性极强，适合建立RT-PCR法检测SARS冠状病毒。     

SARS冠状病毒M基因的克隆及序列分析

目的克隆SARS冠状病毒(SARS-CoV)GD322株M基因,并进行序列分析。方法根据GenBank中公布的SARS冠状病毒Tor2株M基因序列,设计一对引物,用RT-PCR法从SARS-CoVGD322株基因组中扩增M基因片段。克隆至pET-32(a)载体,转化大肠杆菌BL-21后测序,利用DNAstar和ClustalX分析所测序列翻译的氨基酸与81株SARS-CoVM基因翻译的氨基酸序列的差异。结果该M基因与Tor2株M基因核苷酸同源性为99.86%;与已收集的81株SARS-CoVM基因所译氨基酸相比,和41株(占50.62%)M蛋白完全同源,37株(占45.68%)仅有一个氨基酸改变,同源性为99.55%,仅与3株(占3.70%)有2个氨基酸差异,同源性为99.10%。结论已获得具有代表性的SARS-CoVM基因重组质粒。     

SARS冠状病毒PUMC_2株全基因组cDNA分段克隆

目的分段克隆SARS冠状病毒PUMC2株的全基因组cDNA。方法以SARS冠状病毒PUMC2株基因组RNA为模板,用RT-PCR扩增cDNA片段,PCR产物经纯化后,连接入pGEM-T载体中,进行序列测定。结果获得了SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA的分段克隆。结论SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA分段克隆的获得,为SARS冠状病毒基因功能的研究和全长有感染性cDNA的克隆奠定了基础。     

SARS冠状病毒PUMC2株全基因组cDNA分段克隆

目的 分段克隆SARS冠状病毒PUMC2株的全基因组cDNA。方法 以SARS冠状病毒PUMC2株基因组RNA为模板,用RT-PCR扩增cDNA片段,PCR产物经纯化后,连接人pGEM-T载体中,进行序列测定。结果 获得了SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA的分段克隆。结论 SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA分段克隆的获得,为SARS冠状病毒基因功能的研究和全长有感染性cDNA的克隆奠定了基础。     

SARS冠状病毒基因组及其编码蛋白生物信息学分析

目的：理论分析严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒基因组及其编码蛋白的分子生物学特征，为进一步研究SARS冠状病毒蛋白质功能提供信息资料。方法：利用生物信息学序列对比分析软件、蛋白氨基酸序列分析软件及蛋白质结构预测软件对GenBank公布的SARS冠状病毒基因序列及其编码的蛋白氨基酸序列进行分析。结果：SARS冠状病毒在基因结构上具有冠状病毒属的特征，而又与其他已知的冠状病毒编码序列存在明显的不同，与其他冠状病毒相比没有明显的基因重组、大片段插入或缺失的现象。来源于不同SARS冠状病毒株的基因序列变异速度较快。出现基因序列在不同区段同源性差异的现象。S蛋白氨基酸序列不存在与其他物种相同的连续性抗原决定簇序列。结论：SARS冠状病毒与其他冠状病毒的变异程度基本相同。SARS冠状病毒可能是自然界已经存在或变异产生的新的病毒株。近期世界范围流行的SARS是同一来源的病原体引起的，认为S蛋白氨基酸序列是SARS冠状病毒的主要抗原。     

反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒

目的探索SARS冠状病毒早期诊断的有效手段。方法对临床病例样品采用反转录巢式PCR方法鉴定SARS冠状病毒。提取样品RNA,用巢式PCR外侧下游引物进行反转录,以反转录产物为模板,进行巢式第一次、第二次PCR。PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行测序鉴定。结果被检样品扩增出特异片段,经测序验证确实来自SARS相关冠状病毒。Blast比较结果与SARS冠状病毒多伦多株相应片段只有一个碱基的差异。结论反转录巢式PCR方法验证在非典型肺炎患者标本中存在SARS相关冠状病毒的序列,证实该法不失为一种检测SARS冠状病毒的快速、简便、易行的方法。     

SARS冠状病毒Orf3和Orf4的克隆和分析

目的:克隆SARS冠状病毒的Orf3和Orf4两个开放性读框,并对其进行DNA序列和蛋白质结构分析.方法:通过RT-PCR,从SARS冠状病毒基因组中扩增得到特异性片段,利用TA克隆将PCR产物克隆入PUCm-T载体并进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析.结果:RT-PCR扩增出的特异产物与预期长度相符,序列分析表明,其核苷酸序列与已发表的SARS病毒的Orf3和Orf4同源性在99%以上.结论:成功克隆SARS冠状病毒Orf3和Orf4两个开放性读框,为表达及功能研究奠定了基础.     

反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒

目的探索SARS冠状病毒早期诊断的有效手段.方法对临床病例样品采用反转录巢式PCR方法鉴定SARS冠状病毒.提取样品RNA,用巢式PCR外侧下游引物进行反转录,以反转录产物为模板,进行巢式第1次、第2次PCR.PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行测序鉴定.结果被检样品扩增出特异片段,经测序验证确实来自SARS相关冠状病毒.Blast比较结果与SARS冠状病毒多伦多株相应片段只有一个碱基的差异.结论反转录巢式PCR方法验证在非典型肺炎患者标本中存在SARS相关冠状病毒的序列,证实该法不失为一种检测SARS冠状病毒的快速、简便、易行的方法.     

反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒

目的 探索SARS冠状病毒早期诊断的有效手段。方法 对临床病例样品采用反转录巢式PCR方法鉴定SARS冠状病毒。提取样品RNA，用巢式PCR外侧下游引物进行反转录，以反转录产物为模板，进行巢式第一次、第二次PCR。PCR产物克隆到pMDl8-T载体后进行测序鉴定。结果 被检样品扩增出特异片段，经测序验证确实来自SARS相关冠状病毒。Blast比较结果与SARS冠状病毒多伦多株相应片段只有一个碱基的差异。结论 反转录巢式PCR方法验证在非典型肺炎患者标本中存在SARS相关冠状病毒的序列，证实该法不失为一种检测SARS冠状病毒的快速、简便、易行的方法。     

Bat SARS coronavirus HKU3-1病毒株基因组及蛋白质的生物信息学分析

目的比较中国菊头蝠SARS冠状病毒(Bat SARS coronavirus)与人类及果子狸体内分离出来的SARS-Cov,分析它们是否存在一定的相似性。方法本文分析了Bat SARS coronavirus与已知冠状病毒Human SARS-CoV和civet SARS-CoV的系统进化关系,绘制了Bat SARS coronavirusHKU3-1的全基因序列图,同时预测了S蛋白和N蛋白的三维模型。结果对Bat SARS coronavirus HKU3-1的序列分析表明中国菊头蝠SARS-CoV与人和果子狸SARS-CoV非常相近。系统进化分析法显示Bat-SARS-CoV与SARS-CoV形成一个不同的群,称为group 2b CoV,与已知的group 2 CoV存在一定的距离。结论Bat SARS coronavirus HKU3-1不太可能是从人SARS-CoV传播过来的。另外,Bat SARS coronavirus与civet SARS-CoV可能具有共同的祖先,使得中国菊头蝠SARS病毒株同样具有感染人体的危险。     

SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因克隆和变异分析

目的:获得SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因的克隆.方法:将SARS病毒RNA基因组逆转录合成cDNA,PCR得到阳性条带,将其亚克隆到pUCm-T载体中进行酶切及测序分析,并与Genbank中核苷酸序列进行同源性分析.结果:阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为1905 bp,与Genbank中另外45株的SARS病毒株的S蛋白S1片段基因比较,共有13个位点发生突变,其中有8处为同义突变,5处为错义突变.结论:成功克隆SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因,为该基因的表达及功能研究奠定了基础.     

非人灵长类结核病的诊断方法及进展

目前非人灵长类结核病的诊断方法单一,给饲养和管理带来影响。通过总结和讨论人的结核病诊断技术,结合非人灵长类的实际情况,指出在结核病检疫中,虽然结核菌素是经典的早期诊断的方法,但血清抗体的检测是结核菌素试验的有效辅助手段,尤其对无反应猴群的结核病检测具有独特的优势。然而,IFNγ的检测有望替代结核菌素试验,实现体外检测结核病。传统的结核菌培养技术时间长,假阴性多,污染率高,给猴的结核病的确诊带来困难。原位PCR技术,能加快诊断速度,提高检出率,特别有利于对小病灶区的病源诊断。虽然目前该技术还不能替代细菌学诊断技术,但两种方法的有效结合将有利于提高非人灵长类的结核病的病源诊断。     

应用RT-PCR技术检测啮齿类动物冠状病毒

为了检测啮齿类动物冠状病毒，设计了特异性引物，建立RT—PCR检测方法，并用于检测。在基因文库中查找了啮齿类动物冠状病毒和SARS病毒的基因序列，从N基因片段中，利用计算机软件设计了一对特异性引物，通过确定反应混合物的浓度和反应条件，并建立了一整套从病毒。RNA抽提、反转录到PCR反应的快速检测啮齿类动物冠状病毒的方法，扩增出了148bp的目的片段。并已用于啮齿类动物中检测各组织和拭子中的冠状病毒。该方法对啮齿类动物冠状病毒的早期诊断和与SARS病毒区别有重要意义。     

SARS冠状病毒PUMC2株N蛋白cDNA的克隆、表达和纯化

目的 原核表达并纯化SARS冠状病毒N蛋白。方法 用RT-PCR技术克隆SARS冠状病毒PUMC2株N蛋白全长cDNA,cDNA经序列分析鉴定后,克隆到pET32a表达载体,转化E．coli BL21进行原核表达并纯化出SARS冠状病毒N蛋白。结果 实现了SARS冠状病毒N蛋白的表达及纯化。结论 用基因重组方法表达的SARS冠状病毒N蛋白可为其进一步功能研究提供条件。     

Establishment of a fluorescent polymerase chain reaction method for the detection of the SARS-associated coronavirus and its clinical application

Objective To establish a fluorescent polymerase chain reaction (F-PCR) method for detecting the coronavirus related to severe acute respiratory syndrome (SARS) and to evaluate its value for clinical application.Methods The primers and the fluorescence-labeled probe were designed and synthesized according to the published sequence of the SARS-associated coronavirus genes.A F-PCR diagnosis kit for detecting the coronavirus was developed, and 115 clinical nasopharyngeal gargling liquid samples were tested.Results The sequence of PCR amplified products completely matched the related sequence of the SARS-associated coronavirus genome. Forty-nine out of 67 samples from identified SARS patients and 8 of 18 samples from persons having close contact with SARS patients showed positive results.All 30 samples from healthy controls were negative.Conclusion The F-PCR method established may be a rapid, accurate and efficient way for screening and for the early diagnosis of SARS patients.     

Evaluation of a real-time polymerase-chain reaction for severe acute respiratory syndrome (SARS) associated coronavirus in patients with hospitalised exacerbation of COPD

One year after the first outbreak infections with SARS associated coronavirus were again reported and the clinical picture varied. Because health care facilities will have to initiate immediate preventive action in cases of probable SARS we tested the potential of PCR to exclude SARS associated coronavirus in patients hospitalized with respiratory symptoms. Based on primers published recently a real time Taqman PCR was established and evaluated. Lower respiratory tract specimens of patients with acute exacerbation of COPD were investigated. 141 patients with mild to moderate COPD were included. The assay was specific, sensitive, precise and reproducible and allowed absolute quantification without cross-reactivity to other respiratory viruses. None of the samples were positive for SARS associated coronavirus. Our RT-PCR for SARS associated coronavirus is a valid and practicable method to further exclude SARS in X-ray negative patients with respiratory symptoms, even in the presence of other respiratory RNA viruses.