PCR方法在水蛭素基因克隆方面的新应用

目的应用PCR方法获得水蛭素基因。方法在传统PCR方法的基础上进行了改进 ,根据已知天然水蛭素基因序列 ,设计了一对 12 3nt且 3′端具有 15nt互补序列的单链DNA ,通过低温复性使其互补结合后 ,进行延伸反应 ,得到微量双链水蛭素基因。再以该基因作为模板设计一对引物 ,进行常规PCR扩增反应。结果获得水蛭素基因。结论此法对于获得象水蛭素基因这类序列已知、片段不太长 ,且不易得到的基因提供了一种可行方法     

肾上腺脑白质营养不良的分子诊断（附2例报告）

目的 探讨肾上腺脑白质营养不良(ALD)的分子诊断方法。方法 在临床诊断的基础上，从2名患者外周血提取白细胞总RNA，进行反转录后，用PCR方法分四段扩增ALD基因编码区。纯化PCR产物，并对其进行序列测定。查出突变位点后，对患者家系成员的基因组DNA进行PCR-限制性酶切分析。结果 患者A的ALD基因第280位密码子发生CGC→CTC改变，使原来编码的精氨酸被亮氨酸取代(R280L突变)；患者B的ALD基因第508位密码子发生了CCC→CTC改变，使正常的脯氨酸被亮氨酸替换(P508L突变)。两个突变通过酶切分析和家系调查得到进一步确证。结论 建立了ALD的分子诊断技术，并在中国人ALD患者发现了两个新的ALD基因突变。     

人体β-防御素-3突变基因的构建及在大肠埃希菌中的融合表达

目的从人正常皮肤组织中提取β-防御索-3基因进行定点突变后在E．coli中融合表达。方法从人正常皮肤组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到编码β-防御素-3成熟肽的cDNA序列，测序正确后，寻找合适的突变位点，设计含突变位点的引物，用PCR重叠延伸法对β-防御素-3成熟肽cDNA序列进行定点突变，将突变产物克隆至pUC18进行序列测定及在E．coli中融合表达。结果测序结果表明，经RT—PCR所得的β-防御素-3成熟肽序列与GeneBank中报道的编码人β-防御索-3成熟肽的cDNA序列完全-致。经过突变β-防御素-3成熟肽第29位谷氨酰胺密码子由CAG突变为精氨酸密码子CGA，其余核苷酸序列均未发生变化。将突变β-防御素-3基因在E．coli中诱导表达3～5h后可见突变β-防御素-3蛋白表达。结论成功构建并表达了β-防御素-3突变体基因，为进-步对突变体进行真核表达、生物活性研究奠定了基础。     

PCR定点诱变改造低效价抗胶质瘤单克隆抗体的初步报告

目的：抗胶质瘤单克隆抗体建株初期效价为1：10^5,经长期传代培养后效价下降至低于1：10^4,为探索其分子机制并将其改造为有活性的单链抗体,为构建靶向基因转移载体奠定基础。方法：通过RT－PCR克隆该单抗可变区基因,发现轻链可变区CDR1区出现一终止密码子,为此利用PCR定点诱变技术将其突变为该亚组相应的氨基酸,进一步构建单链抗体表达载体,并在大肠杆菌表达。结果：改造后的单链抗体能高效表达,Western blot和免疫荧光证实能与相应的膜抗原特异结合。结论：成功地改造并构建单链抗体,可用于胶质瘤靶向基因治疗。     

RecA蛋白-互补单链DNA探针提高压电基因传感器灵敏度的实验研究

目的研究利用RecA蛋白-互补单链DNA探针与固定的肽核酸(bis-PNA)探针相结合提高压电基因传感器的灵敏度的可行性。方法基因传感器阵列固定上针对乙肝病毒的bis-PNA探针,加入靶DNA与之反应,然后加入预先处理过的的RecA蛋白-互补单链DNA探针。结果直接加入靶DNA所引起的频率改变为15.83±7.31Hz,反应时间为45.16±12.87min,加入RecA蛋白-互补单链DNA探针(浓度为3.0mg/ml),所引起的频率改变最为明显,为112.16±12.7Hz。结论在反应体系中加入RecA蛋白-互补单链DNA探针,能有效地提高压电基因传感器的灵敏度,明显缩短反应体系时间。     

链霉菌质粒启动基因在大肠杆菌中的表达

启动基因-探针质粒的实验表明,大肠杆菌DNA含有许多在变青链霉菌(S.lividans)中作为启动基因的序列.提高大肠杆菌转录的大肠杆菌amp C启动基因的突变在变青链霉菌中有类似的序列,提示变青链霉菌的RNA聚合酶能识别与大肠杆菌RNA聚合酶的细菌启动基因的相同特征.链霉菌中相当少的序列在大肠杆菌中可作为启动基因,而大多数链霉菌启动基因在大肠杆菌中无作用.Jaurin等证明来源于变青链霉菌的"SEP"序列("链霉菌-大肠杆菌型"启动基因)是在大肠杆菌     

环磷酰胺及塞替派诱导的人支气管上皮恶性转化细胞的p16INK4a及p15INK4b基因突变

目的了解环磷酰胺(CP)和塞替哌(TEPA)诱导永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)的恶性转化株内BEAS-CP和BEAS-TE细胞p16和p15基因的突变情况.方法采用聚合酶链反应(PCR)、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)及DNA序列分析技术.结果 BEAS-CP细胞p15基因的外显子1和外显子2都出现了异常带型.BEAS-TE细胞p16基因的外显子1及外显子2a出现了异常带型和迁移率滞后现象;p15基因外显子1的2条单链带之间出现异常条带.DNA序列分析发现BEAS-CP细胞的p15基因外显子1的182位有C的插入,206位有G的插入;外显子2的第308位密码子有C→T(TCC→TTC)转换(Ser→Phe),第327位密码子有T→A(AAT→AAA)颠换(Asn→Lys).BEAS-TE细胞的p16基因外显子2a的第125位密码子有G→A(CGC→CAC)转换(Arg→His).结论 p15基因在CP诱导BEAS-2B发生恶性转化的过程中发挥了重要作用.在TEPA诱导BEAS-2B细胞发生恶性转化的过程中可能涉及了p16基因的失活.     

金钱白花蛇及其伪品的DNA分子诊断鉴别

为建立金钱白花蛇品种的DNA分子标记鉴定方法,本文通过提取金钱白花蛇及其伪品药材和原动物样品的模板DNA,用通用引物扩增样品的Cyt b基因片断。PCR扩增所得产物纯化后直接测序,所得序列经对位排列和比较金钱白花蛇及其伪品的DNA序列,发现Cyt b基因片段的种间差异显著大于种内个体间变异,因此该基因片段是蛇类药材鉴定中一个很好的分子标记。基于所得DNA序列数据,设计了一对高度特异性的鉴别引物用于金钱白花蛇的PCR鉴定。用该对引物对金钱白花蛇进行PCR鉴定。在60℃－65℃的复性温度条件下,样品的误检和漏检率为0,能100％地正确区分出正品与伪品药材,此外该方法还能检测出混合粉末中是否含有正品金钱白花蛇成分。研究结果表明用本鉴定引物对金钱白花蛇的PCR鉴定方法简便、有效,实用性强,该方法还有可能成为中成药复方组分鉴别的一种新手段。     

人骨肉瘤组织细胞色素b基因序列分析

目的 了解人骨肉瘤组织细胞色素b(cytochromeb1Cytb)基因变异，探讨线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA）突变与肿瘤发生的关系。方法 提取骨肉瘤组织总DNA，PCR扩增细胞色素b基因，产物经DNA自动测序进行分析。结果 20例骨肉瘤组织共有10例发生了细胞色素b基因突变，阳性率为50％。共检测到13个新的突变，并有3个突变热点：nt 14783T→C突变，nt 15043G→A突变和nt 15301G→A突变。各亚型之间的碱基变异率相比较差异不存在显著性意义。结论 在骨肉瘤组织中存在细胞色素b基因的高频率变异，这种变异可能在骨肉瘤发生、发展中发挥重要的作用。进一步研究这些变异对细胞功能的影响可能有助于阐明线粒体在肿瘤发生中的作用。骨肉瘤各亚型在形态学上的差异可能是由线粒体DNA其它区域或核基因组的改变引起的。     

单克隆抗体的基因工程

本文介绍了抗体基因工程的最新进展,其中包括用聚合酶链反应(PCR)从杂交瘤或非免疫细胞基因库快速克隆抗体可变区(V区)基因、互补决定区(CDR)移植V区基因的设计和构建、Fv和单链Fv片段的构建等方法以及载体扩增在哺乳动物细胞或大肠杆菌中高效表达抗体及其片段的技术等。