人胎黑质神经元发育的初步观察

应用尼氏染色方法,观察第3～10月人胎黑质神经元的分布、数量和形态学发育变化。结果如下:①在人胎第3～10月,黑质神经元位于中脑腹侧大脑脚底与红核之间,并可区分为腹侧细胞稀疏的网状部和背则细胞密集的致密部。致密部在第3～4月为连续的细胞带,第5月以后渐变间断而形成明显的细胞群。②随着胎龄增加,每张中脑横切片上黑质神经元的数目略有减少,神经元的密度逐渐降低,尤以第8～10月最明显。③从胎龄第3～10月,黑质神经元胞体逐渐增大,胞质逐渐增多,神经元的形态从胎龄早期无明显突起的小圆形细胞为主,逐渐发育为胎龄晚期的锥形和梭形细胞为主,并带有一个或多个胞质突起。结果提示:人胎黑质神经元的细胞形态学发育在胎龄3～4月时尚不成熟,而第9～10月时已接近成人。     

人海马的胚胎发育研究

用尼氏染色法，观察了第４－１０个月人胎海马的发育，结果表明：随着胎龄增长，锥体层细胞的密度减低，细胞体积增大，但变化不呈等速，至胎龄第９个月出现锥体形细胞，胎龄第１０个月，细胞发育趋向成熟，另可见海马各区的发育速度不一致，结果提示用５个月以前海马细胞作供体用于移植研究，可望获得较理想结果。     

大鼠黑质多巴胺能神经元的形态学发育

目的探讨大鼠黑质多巴胺(DA)能神经元的形态学发育和分布特征。方法行大鼠出生前后不同时期的脑黑质区段连续冠状石蜡切片，以酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色方法显示DA能神经元，焦油紫染色确定黑质区域，进行光镜观察以及细胞形态学指标的测量。结果胚胎(embryonicclay，E)第13天龄(E13)时，开始于中脑腹侧出现TH阳性(TH^ )细胞。至E16时，中脑腹侧这些细胞的数量和密度达到最大值，此后又逐渐下降，且于出生后早期这些TH^ 细胞的减少最为显著。至生后第14天龄(P14)时，中脑腹侧黑质区域TH^ 细胞的分布和密度不再明显改变，与成年期状态接近。胚胎期，TH^ 细胞多为圆形或椭圆形，随着胚胎发育，其突起逐渐伸长，分支也逐渐增多。出生后，TH^ 细胞逐渐表现为成熟神经元的形态特征。结论大鼠脑黑质DA能神经元的发育发生在个体出生前后，呈现先大量形成后又逐渐减少的过程，与此同时，其形态趋向成熟。至P14时，DA能神经元的分布和形态学发育基本成熟。     

人海马的胚胎发育研究

用尼氏染色法，观察了第４～１０个月人胎海马的发育。结果表明：随着胎龄增长，锥体层细胞的密度减低，细胞体积增大，但变化不呈等速。至胎龄第９个月出现锥体形细胞，胎龄第１０个月，细胞发育趋向成熟。另可见海马各区的发育速度不一致。结果提示用５个月以前的海马细胞作供体用于移植研究，可望获得较理想结果。     

胎儿角膜上皮及内皮细胞发育的超微结构观察

①目的探讨胎儿角膜在角膜移植术中的应用价值。②方法选用２６例不同发育阶段的胎儿角膜，观察其上皮和内皮细胞的超微结构。③结果７月龄胎儿角膜上皮细胞层次少，随着胎龄增长，细胞层次增多，结构趋于成熟。７月龄胎儿角膜内皮细胞器等成分尚不稳定，以溶酶体居多，８月龄以后，随着胎龄增长，细胞器等结构趋于完善。④结论７月龄胎儿角膜上皮及内皮细胞处于分化发育阶段，８～９月龄胎儿角膜上皮及内皮细胞结构基本完善，足月龄胎儿角膜上皮及内皮细胞的结构接近于成人，用于角膜移植效果更好。     

人胎黑质细胞的冷冻保存

采用台盼蓝染色法，观察了第３～６月人胎黑质细胞冷冻保存的细胞存活率，结果：①胎龄３～６月人胎黑质细胞冷冻保存后均可存活，但以胎龄３和４月细胞存活率较高。②液氮保存的细胞存活率不受保存时间的影响，而４℃保存的细胞存活率随保存时间的延长而逐渐降低。结果提示，液氮保存人胎黑质细胞的保存条件以胎龄３和４月为宜。     

人胎黑质细胞的冷冻保存

采用台盼蓝染色法，观察了第３￣６月人胎黑质细胞冷冻保存的细胞存活率，结果：①胎龄３￣６月人胎黑质细胞冷冻保存后均可存活，但以胎龄３和４月细胞存活率较高。②液氮保存的细胞存活率不受保存时间的影响，而４℃保存的细胞存活率随保存时间的延长而逐渐降低。结果提示，液氮保存人胎黑质细胞的保存条件以胎龄３和４月为宜。     

4～7月胎儿皮肤超微结构的动态观察

观察了２０例胎龄为４～７个月胎儿皮肤的超微结构，发现表皮细胞的超微结构变化与细胞的分化程度与胎龄有密切的关系：其中微丝束和糖原伴随细胞的分化由基底层向表层逐渐增多，游离核蛋白体及线粒体则逐渐减少；随着胎龄的增加，微丝束、透明角质颗粒、核蛋白体增加，糖原逐渐减少。还观察了周皮、表皮细胞之间的连接、基膜及真皮成纤维细胞的超微结构变化，为进一步研究国人的皮肤补充了资料。     

4—7月胎儿皮肤超微结构的动态观察

观察了２０例胎龄为４－７个月胎儿皮肤的超微结构，发现表皮细胞的超微结构变化与细胞的分化程度与胎龄有密切的关系，其中微丝束和糖原伴随细胞的分化由基底层向表层逐渐增多游离核蛋白体及线粒体则逐渐减少；随着胎龄的增加，微丝束、透明角质颗粒、核蛋白体增加，糖原逐渐减少，不字周皮、表皮细胞 连接、在膜及真皮成纤维细胞的超微结构变化，为坦步研究国人的皮肤资料。     

正常胎儿心肌细胞的电镜观察

目的；研究胎儿心肌细胞超微结构特征及与成年人心肌细胞超微结构的区别。方法：选择水囊引产的正常胎儿，取心室肌组织经固定包埋后制成超薄切片，电镜下进行观察。结果：胎儿心肌细胞超微结构与成年人相比较有区别，并随胎龄不同结构上也有一定差别。结论；随胎龄的不断增长，其心肌细胞逐渐发育完善，接近成年人的心肌细胞。     

可视法膜片钳术观察大鼠黑质-纹状体脑片中黑质细胞电生理特性

目的 建立大鼠黑质-纹状体脑片,探讨中脑黑质细胞的电生理特性.方法 应用红外微分干涉相差(IR-DIC)技术在直视下对黑质-纹状体脑片中100个黑质细胞动作电位及超极化激活的内向电流(Ih)进行观察和分析.结果 可视法脑片膜片钳术可对脑片中黑质细胞进行准确定位和功能状态的筛选.记录的100个细胞中94个可见自发动作电位,其中频率<10 Hz的85个(A类细胞),平均为(5.0±2.7)Hz;>10 Hz的9个(B类细胞),平均为(14.0±2.6)Hz.后者电位变化过程与前者相比缺少明显的超极化.92.9%(79/85)的A类细胞诱发出明显的,Ih电流(-120 mV,47.5pA±5.8 pA),提示为多巴胺能细胞;B类细胞则没有或只有很小的,Ih电流(-120 mV,4.9 pA±1.5pA),提示为γ-氨基丁酸能细胞.两者比较P<0.001.结论 通过在可视条件下对黑质-纹状体脑片黑质细胞进行基本电学特征观察,可有效地识别黑质细胞的类型,为深入研究黑质-纹状体通路电信号的发生和传递提供了基础.     

人类蓝斑TH样神经元的发育(免疫细胞化学研究)

本实验用抗酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学ABC法系统地观察了人胎蓝斑内TH样神经元的分布及形态。结果证实:①蓝斑TH样神经元在人类胚胎第四个月时已经出现。②TH样神经元的数目随胎龄的增长而逐渐增多,以胎龄四至五个月增加显著,TH样神经元的密度,胚胎早期升高,晚期随胎龄的增长而逐渐下降。③蓝斑TH样神经元主要分布在蓝斑的背侧部,少量较大的细胞位于蓝斑的腹侧部。④蓝斑TH样神经元开始出现时为圆形或卵圆形,五至六个月以锥形、梭形细胞为主,七至八个月则以棱形、多角形为主。胞浆随胎龄的增长逐渐增多,胞核与胞浆之比随胎龄增长逐渐变小,胞突由宽短,表面粗糙变为细长而平滑。结果提示:人胎蓝斑移植,以胎龄4个月作供体较适宜。     

大鼠黑质、被盖腹侧区胆囊收缩素样阳性神经元的分布及向尾壳核的投射双标记研究

本文采用免疫细胞化学卵白素—生物素—过氧化物酶复合体法结合HRP 逆行追踪双标记技术,研究了中脑黑质和被盖腹侧区胆囊收缩素样阳性神元经分布及其向尾壳核的肽能纤维投射。结果显示:胆囊收缩素样阳性神经元分布于黑质致密部和外侧部以及被盖腹侧区,黑质网状部末见到胆收缩素样阳性神经元和纤维;黑质致密部和被盖腹侧区胆囊收缩素阳性神经元向同侧尾壳核发出纤维投射。     

Experimental study on dynamic regulation of acetylcholine in striatum of rat parkinson disease model and behavior observation

In order to explore the role of acetylcholine in the pathogenesis of Parkinson’s disease (PD),the changes in the concentration of acetylcholine (Ach) in the striatum,the apoptosis of substantia nigra cells,the ultrastructure and the changes of Nissl cells in rats during the morbidity of PD,and the corresponding behaviors in rats with PD were observed.Rat PD model was established by using the modified Thomas method.Eighty-one rats were randomly divided into normal control,sham operation and PD groups and their behavior features were observed at post-operative day (POD) 7,14 and 21 as three subgroups (n=9 each).The concentration of Ach in the striatum was determined by using high-performance liquid chromatography.The apoptosis of substantia nigra cells was assayed by using TUNEL method.The ultrastructural changes in the substantia nigra were observed under the electron microscopy,and the survival of neurons in the substantia nigra area was examined by using Nissl staining.In PD group at POD 7 to 21,the damage in the substantia nigra area was gradually aggravated,the concentration of Ach,apoptosis rate and turns of rotation were gradually increased,and the number of Nissl cells was gradually reduced over the time as compared with the normal control and sham operation groups (all P<0.05).It was concluded that there exist dynamic changes in Ach concentration,ethology and apoptosis of the substantia nigra cells during the morbidity of PD,suggesting the contribution of apoptosis to the morbidity of PD,and critical role of Ach in the pathogenesis of PD.     

Gabazine对大鼠黑质网状带GABA能神经元放电的影响

目的探讨γ-氨基丁酸A型（GABA—A）受体阻断剂Gabazine对大鼠黑质网状带GABA能神经元放电的影响。方法采用多管微电极细胞外电生理学记录的方法,观察Gabazine对大鼠黑质网状带GABA能神经元放电的影响。结果正常大鼠黑质网状带微量注射Gabazine可使神经元放电频率由（19．7±2．1）Hz升高到（32．0±5．4）Hz,平均升高（40．0±5．0）％,与生理盐水组相比较差异有显著意义（t=3．25,P〈0．01）。结论内源性GABA—A受体可调节黑质网状带GABA能神经元自发放电活动,这为进一步探究GABA—A受体在帕金森病发病中的作用提供了一定的理论依据。     

新生大鼠中脑黑质神经细胞的原代培养

对新生1天大鼠中脑黑质神经细胞进行原代培养，以建立稳定的神经细胞培养模型。通过光镜对培养各阶段的神经细胞系统地观察，描写了它们的生长发育过程和形态特征，同时用特异性诱发荧光技术和酪氨酸羟化酶（TH）免疫细胞化学方法，进一步确定培养的黑质神经细胞的化学性质。本方法与通常从胚胎鼠取材比较，具有难度小，取材范围大的优点。     

神经细胞及转基因细胞脑内移植的基础与临床研究

目的：探讨移植的胚胎小脑组织在成年小鼠脑内,黑质细胞和TH转基因细胞移植在猴脑内,人胚脑细胞植入人脑内能否存活及观察植入的神经元能否纠正和改善中枢神经系统的功能缺陷和症状。方法：（1）将胎龄13d的C57BL／6小鼠胚胎小脑组织悬液植入3个月龄的BALB／c成年小鼠小脑内。（2）将构建的TH基因修饰脑黑质细胞植入猴帕金森病模型脑尾状核内。术后进行组织学观察,在此基础上,将胎龄为9－12周的人胚胎小脑细胞悬液植入到6例重度小脑萎缩病人的小脑内,并观察疗效,选用自动流产人黑质细胞及肾上腺髓质细胞悬液移植到5例晚期帕金森病病人脑尾状核内。结果：小鼠及猴的动物实验组织学证实神经细胞移植后可在受体脑内存活和再生,并有浦氏细胞分化成熟和迁徙到颗粒细胞层,TH基因修饰细胞以猴的尾状核内,可以纠正帕金森病猴的症状和体征,移植6个月后组织切片表明猴帕金林病模型脑微包囊内转基因细胞存活而且TH基因表达呈强阳性,6例重度小脑萎缩病人及5例晚期帕金森病病人移植后近期疗效良好,多数病例远期疗效退步,仅有2例病人疗效稳定,结论：未成熟的神经细菌或转基因细胞在受体脑内可以存活,并具有神经细胞再生和改善神经功能的潜力。     

脑源性神经营养因子在脑室注射脂多糖大鼠黑质多巴胺能神经元变性中的作用

目的观察脑室内注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对大鼠黑质多巴胺能神经元的长时程毒性作用,探讨脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在黑质多巴胺能神经元慢性变性过程中的作用。方法健康雄性SD大鼠48只,采用抽签法将大鼠随机分为LPS实验组和0.9%氯化钠注射液(NS)对照组,经大鼠右侧脑室一次性注射LPS20μL(1.25g/L)或0.9%氯化钠注射液20μL。给药后2周、4周、12周、24周用酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫组织化学染色观察黑质多巴胺能神经元的变化,免疫组化及酶联免疫吸附实验(enzyme immunoassay system,ELISA)检测黑质纹状体系统BDNF表达的变化。结果①TH免疫组织化学染色结果显示,大鼠黑质多巴胺能神经元数目在LPS给药后期减少,24周时LPS实验组大鼠黑质TH阳性神经元数量为NS对照组的75.4%(P<0.01);②BDNF免疫组化结果显示,LPS实验组大鼠4周时黑质部位BDNF阳性细胞的表达较NS对照组高,而到12周和24周时其表达比NS对照组明显下降。ELISA检测结果显示,LPS实验组大鼠4周时黑质纹状体内BDNF表达是NS对照组的186.3%(P<0.01),而12周和24周时分别是NS对照组的42.3%(P<0.01)和61.0%(P<0.05)。结论脑室内注射LPS可导致大鼠黑质多巴胺能神经元变性,这一病变过程呈慢性迟发性。该模型大鼠黑质TH阳性神经元变性丢失前即出现黑质纹状体系统BDNF表达减少,提示BDNF表达减少可能是黑质多巴胺能神经元变性丢失的原因之一。     

α-Synuclein与帕金森病临床前期动物模型研究

用 1 甲基 4 苯基 1 ,2 ,3 ,6 四氢吡啶 (MPTP)小剂量慢性给药建立帕金森病临床前期动物模型 ,观察小鼠脑组织形态学、生物化学及行为学方面的变化 ,同时对实验组小鼠黑质内α 突触核蛋白 (α synuclein ,NACP)阳性细胞数与纹状体内的突触数量进行动态变化的研究 ,探讨NACP与突触损伤之间的关系。C5 7BL/ 6j小鼠 60只 ,根据给药时间长短分为 5、1 0、1 5、2 0d 4组 ,腹腔注射MPTP〔4mg/ (kg·d)〕 ,正常对照组注射生理盐水。最后一次给药后 7d进行脑组织取材 ,分别进行NACP免疫组化染色、黑质纹状体形态学观察及纹状体内多巴胺含量的检测。发现 :1 )黑质内NACP免疫组化阳性细胞数在 5d组为最高峰 ,随后各组逐渐减少。 2 )电镜下黑质内除见固缩的神经细胞外 ,其他的神经元也有超微病理改变如线粒体肿胀、粗面内质网减少等。 3 )各给药组小鼠纹状体内的多巴胺含量与正常对照组相比均有明显下降 (P <0 .0 1 ) ,各给药组之间无明显差异 (P >0 .0 5 )。实验结果证实 :1 )低剂量MPTP慢性给药小鼠虽不能诱导出帕金森病的症状 ,但免疫组化、多巴胺含量测定及超微病理出现的改变可以作为帕金森病临床前期动物模型的参考指标。 2 )在MPTP慢性给药小鼠的早期阶段 ,黑质内神经细胞损伤时NACP表达水平增高可能是神?