异硫氰酸苄酯诱导人急性白血病细胞凋亡的分子机制研究

目的 探讨异硫氰酸苄酯(benzyl isothiocyanate,BITC)诱导急性白血病细胞凋亡的效应及其分子机制. 方法 以流式细胞仪检测细胞凋亡,经Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达.结果一定剂量BITC可诱导U937、Jurkat和HL60细胞凋亡,并旱现良好的量效和时效关系.细胞凋亡酶Caspase-3表达明显增加,其作用底物PARP蛋白表达明显下降,抗凋亡蛋白Mel-1表达明显下降,而其他相关蛋白没有改变.结论 BITC可诱导多种白血病细胞凋亡,其分子机制可能与抗凋亡蛋白Mcl-1表达降低有关.     

大麻素受体激动剂WIN55,212-2联合金诺芬对人肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响

目的 探讨大麻素受体激动剂WIN55,212-2(WIN)联合金诺芬(AF)对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响,并对其机制进行初步研究.方法 分别用5 μmol/L WIN、0.25 μmol/L AF、5μmol/L WIN联合0.25μmol/L AF处理HepG2细胞24h和48 h后,MTS法检测细胞活力;采用AnnexinV-FITC和PI双染色法并通过流式细胞仪分析细胞凋亡;Western blot检测凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bip、ATF4、PARP、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)表达的变化.分别用5μmol/L WIN联合0.25 μmol/L AF、Z-VAD-FMK以及Z-VAD-FMK预处理1h后再用5 μmol/L WIN联合0.25 μmol/L AF处理HepG2细胞24 h,Western blot检测蛋白PARP、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的变化.结果 与两药单独使用相比,WIN联合AF明显抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,可以引起Bcl-2蛋白表达水平下调,内质网应激反应相关蛋白Bip、ATF4蛋白表达水平上调,以及活化Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9,引起PARP蛋白的切割.加入Caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK处理细胞后,能部分逆转联合用药的细胞凋亡比例.结论 大麻素受体激动剂WIN联合AF能有效诱导肝癌细胞凋亡,其机制可能与Bcl-2表达下调、内质网应激反应和Caspase系统活化相关.     

伯舒替尼诱导急性髓系白血病细胞分化和细胞凋亡

目的 探讨伯舒替尼对人急性髓系白血病(AML)细胞株HL-60、THP-1和U937细胞分化和凋亡的影响及其作用机制.方法 伯舒替尼0～20 μmol/L处理HL-60、THP-l和U937细胞48 h,MTT法检测细胞增殖;伯舒替尼0～5 μmol/L处理HL-60、THP-1和U937细胞72 h,流式细胞仪检测细胞CDllb表达;伯舒替尼O～10 μmol/L处理HL-60、THP-1和U937细胞72 h,胱天蛋白酶(caspase)广谱抑制剂benzyloxy-carbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl-ketone (Z-VAD-FMK)预处理lh后加入伯舒替尼处理U937细胞48 h,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;不同浓度伯舒替尼(0～5 μmol/L)分别处理HL-60和U937细胞24 h后,Western印迹法检测细胞分化相关转录因子C/EBPβ、P21和c-Myc以及凋亡相关分子Mcl-1、Bax和Caspase 3蛋白表达的改变.结果 伯舒替尼剂量依赖性抑制AML细胞增殖.与空白对照组相比,不同浓度伯舒替尼处理AML细胞72 h后,细胞CDllb表达和细胞凋亡率均明显增加(P＜0.05或P＜0.01).伯舒替尼处理HL-60细胞有效上调C/EBPβ和P21的蛋白表达水平,引起U937细胞Mcl-1表达降低和Bax表达增强,并激活caspase 3,而Z-VAD-FMK预处理U937细胞显著抑制伯舒替尼诱导的细胞凋亡.结论 伯舒替尼可有效抑制AML细胞增殖,诱导细胞分化和促进其凋亡,可作为有效治疗AML的潜在药物.     

Aurora激酶抑制剂ENMD-2076对人急性髓系白血病细胞的杀伤作用

目的:观察Aurora激酶抑制剂ENMD-2076对人急性髓系白血病(AML)细胞株的杀伤作用.方法:将不同浓度的ENMD-2076分别作用于对数生长期的AML细胞24 h、48 h,采用MTT比色法检测药物对细胞的生长抑制作用;应用Hoechst荧光染色法检测细胞凋亡率,Western blot法检测药物处理后Caspase途径和凋亡相关蛋白的改变.结果:ENMD-2076能显著抑制AML细胞株THP-1和Kasumi-1的生长(P ＜0.001),24 h时对THP-1和Kasumi-1的半数抑制浓度分别是9.32μmol/L和7.23 μmol/L.Hoechst荧光染色证实ENMD-2076能使THP-1细胞发生染色质浓缩等凋亡改变.Western blot检测证实,ENMD-2076能激活Caspase-3、Caspase-9、Caspase-8和PARP,上调促凋亡蛋白Bak、Bax、Bad和Bim,下调抗凋亡蛋白Mcl-1的表达.结论:Aurora激酶抑制剂ENMD-2076能显著抑制人AML细胞株THP-1和Kasumi-1的增殖并促进其凋亡,对凋亡相关蛋白的调控是其作用机制之一.     

丹参酮ⅡA对白血病 K562 细胞的体外诱导凋亡作用研究

目的研究丹参酮ⅡA对人急性白血病 K562 细胞的诱导凋亡作用及其作用机制。方法以不同浓度的丹参酮ⅡA (10～50 μmol/L) 作用于体外培养的 K562 细胞 24、48、72 h,应用 MTT 法检测细胞生长抑制率,流式细胞术 (FCM) 检测细胞凋亡率,并对 50 μmol/L 的药物作用不同时间后亚 G1 期细胞进行检测。应用免疫印迹法 (Western blotting) 检测 Caspase-3 及其裂解底物多聚 ADP-核糖聚合酶 (PARP) 的表达水平,并对凋亡调节蛋白 Fas、Bax、Bcl-2、Bak、Bid 的表达水平进行检测。结果20 μmol/L 以上的丹参酮ⅡA可显著抑制 K562 细胞的生长、诱导细胞发生凋亡,并呈现出明显的量-效与时-效关系;FCM 检测结果表明 50 μmol/L 丹参酮ⅡA 作用不同时间后,亚 G1 期细胞 (凋亡细胞) 逐渐增多。20 μmol/L 以上的丹参酮ⅡA 作用 48 h 后 Caspase-3 逐渐被活化出现 17 000 的亚单位,Caspase-3 的作用底物 PARP 被活化裂解出现 89 000 的亚单位片段,而且 Caspase-3 的激活以及 PARP 的裂解可被 Caspase-3 的特异性抑制剂 z-DEVD-FMK 所阻断,促凋亡蛋白 Fas 以及 Bax 的表达水平明显升高,而凋亡抑制蛋白 Bcl-2 及其他促凋亡蛋白 Bak 和 Bid 的表达水平则无明显变化。结论丹参酮ⅡA可以通过诱导白血病 K562 细胞凋亡而发挥体外抗白血病作用,上调促凋亡蛋白 Fas 和 Bax 的表达水平及激活 Caspase-3 可能是丹参酮ⅡA诱导白血病 K562 细胞发生凋亡的重要作用机制之一。     

木犀草素对胃癌细胞MGC803增殖的抑制作用及其机制

目的 研究木犀草素对胃癌细胞MGC803的增殖抑制作用及其机制.方法 通过MTT法、克隆形成抑制实验观察木犀草素对胃癌细胞MGC803的增殖抑制作用,碘化丙啶(PI)单染色法检测细胞周期,AnnexinⅤ-PI双染法测定细胞凋亡,蛋白质印迹法检测Bcl-2家族蛋白、Caspase蛋白、周期及自噬相关蛋白的表达情况.结果 MTT法检测发现,木犀草素作用于MGC803细胞24、48和72 h后,IC50分别为127.37、76.12、16.84 μmol/L;木犀草素能抑制胃癌细胞MGC803的克隆形成.PI单染色法发现随着木犀草素浓度的增大,发生G2期阻滞的细胞比例增加.蛋白质印迹法的检测结果表明,随着木犀草素浓度的增加,CDK4、CDK6、CyclinE2表达减少,CyclinD1、CyclinD3和p-Wee1表达基本不变,CyclinA、CyclinB、Myt1、p-cdc2(Tyr15)表达增高.AnnexinⅤ-PI双染法发现随木犀草素浓度增加,细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均增加.蛋白质印迹法的检测结果表明,Mcl-1、Bcl-xL、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达随木犀草素浓度增加而减少,Bcl-2蛋白表达量变化不大,Bax蛋白表达量增加,因而引起Bcl-2/Bax、Mcl-1/Bax和Bcl-xL/Bax的比例下降;同时可见到Caspase-3和PARP出现了切割的条带;P62表达下降,Beclin-1、LC3Ⅱ表达增加.结论 木犀草素使胃癌细胞MGC803发生G2期阻滞,诱导细胞自噬的发生并抑制细胞的生长,还通过线粒体途径诱导胃癌细胞MGC803凋亡.     

地西他滨诱导人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡机制的研究

目的研究地西他滨诱导人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡的机制。方法常规体外培养人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞株,取对数生长期的细胞传代24 h后加入不同浓度(0.5、1.0、5.0及10.0μmol/L)地西他滨处理,分别继续培养24、48、72 h后,用CCK-8法测定细胞增殖活性;倒置显微镜下观察细胞形态;Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测地西他滨作用后人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞株的凋亡率;应用透射电镜观察人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞发生凋亡的形态学特征;实时荧光定量Real time-PCR法检测凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2在mRNA水平表达变化的情况。结果地西他滨可以抑制Jurkat细胞增殖,并且呈浓度和时间依赖性(P0.05)。倒置显微镜观察到地西他滨作用后细胞形态发生了显著改变;流式细胞术检测细胞凋亡的结果表明地西他滨能够诱导人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡并且呈浓度依赖性(P0.05);透射电镜观察结果证明地西他滨可以诱导人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞出现凋亡性细胞死亡,5.0μmol/L地西他滨作用Jurkat细胞72 h后出现大量凋亡小体。另外,Real time-PCR实验研究结果发现地西他滨能够上调促凋亡基因Caspase-3的表达,下调凋亡抑制基因Bcl-2的表达。结论地西他滨能通过上调促凋亡基因Caspase-3的表达和下调凋亡抑制基因Bcl-2的表达诱导细胞凋亡。     

二甲双胍抑制急性髓系白血病细胞增殖

目的 探讨降糖药物二甲双胍对人急性髓系白血病细胞系U937细胞增殖的作用。方法 将浓度梯度的二甲双胍(0、5、10、20、40、60 mmol·L^-1)分别作用于U937细胞24、48 h,采用CCK-8试剂盒检测U937细胞活力,Annexin-V/PI assay试剂盒检测U937细胞凋亡率,JC-1检测U937细胞线粒体膜电位下降水平。同时基于细胞活力试验检测结果,将上述浓度梯度的二甲双胍分别作用于U937细胞48 h,采用Western blot检测Bcl-2蛋白表达水平。结果 二甲双胍作用24 h对U937细胞增殖抑制作用较弱、无明显杀伤作用;作用48 h对U937细胞有抑制细胞生长、促进凋亡、降低线粒体膜电位作用,同时显著降低U937细胞Bcl-2蛋白水平。结论 二甲双胍可杀伤人急性髓系白血病细胞系U937细胞。二甲双胍抗白血病作用可能与其下调线粒体膜电位、抑制Bcl-2蛋白表达有关。     

PHI对前列腺癌PC3细胞组蛋白甲基化及乙酰化的调控

目的 探讨异硫氰酸苯己酯(PHI)诱导前列腺癌PC3细胞凋亡的分子机制.方法 采用MTT方法观察PHI对PC3细胞的生长抑制情况;TUNEL方法检测PHI对PC3细胞凋亡的影响;用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3、Mcl-1、Cyt-C、XIAP及组蛋白乙酰化H3、H4,组蛋白甲基化H3K9、H3K4水平的变化.结果 ①PHI能抑制PC3细胞增殖,IC50为20 μmol/L;②PHI通过下调PC3细胞Bcl-2,Caspase-9、Caspase-3、Mcl-1、Cyt-C、XIAP表达,诱导PC3细胞凋亡;③PHI使PC3细胞组蛋白乙酰化H3、H4表达增加,组蛋白甲基化H3K4水平增高,H3K9水平降低.结论 PHI可使组蛋白H3、H4高乙酰化,并调控组蛋白H3K4、H3K9甲基化水平,从而抑制PC3细胞的增殖,诱导其凋亡.PHI是一种潜在抗前列腺癌的新药.     

Effect of Mcl-1 on osteosarcoma cells under doxorubicin-induced apoptosis

目的 研究阿霉素诱导骨肉瘤细胞凋亡过程中Mcl-1含量的变化以及Mcl-1对骨肉瘤细胞凋亡的调控作用.方法 采用半定量PCR法检测Mcl-1、Bcl-2、β-actin的mRNA水平变化;Western blot法检测Mcl-1、Bcl-2、β-actin蛋白变化;转染pcDNA3-Mcl-1质粒使细胞高表达Mcl-1、Bcl-2;采用Caspase3/7活性试剂盒检测Caspase3/7活性.结果 骨肉瘤细胞在阿霉素作用下,Mcl-1和Bcl-2的mRNA水平无变化,而蛋白水平下调;过表达Mcl-1可以明显抑制凋亡标志物PARP的剪切,而Bcl-2不具有抑制效应;同样,过表达Mcl-1可以抑制阿霉素作用下Caspase3/7的活化.结论 阿霉素作用下,Mcl-1蛋白水平下降是骨肉瘤细胞发生凋亡的重要原因,并且该凋亡过程与Caspase的活化有关.