递呈BAE5单抗相关表位的M13噬菌体克隆系及其鉴定

[目的]获得可递呈BAE5单克隆抗体抗原表位的M13噬菌体克隆系.[方法]应用生物淘洗(Biopanning)方法,从M13噬菌体随机12肽文库中筛选出能与BAE5单克隆抗体有阳性反应的噬菌体克隆系.通达ELISA竞争反应确定与BAE5单抗结合率较高的克隆,鉴定这些阳性克隆与正常鼠血清,鼠抗M13血清和健康人IgG,IgA抗体的反应差异.[结果]经过3轮淘洗,与BAE5单克隆抗体有阳性反应的克隆占83%(15/18).其中竞争结合率>50%克隆有1、2、7、9、13、14号6个克隆,它们与BAE5单抗的竞争结合率分别为56.3%、59.5%、58.0%、62.8%、56.4%、63.4%.其中只有1、9、14.号克隆的噬菌体与正常小鼠血清不显示交叉反应.[结论]来自1、9、14.号克隆的噬菌体递呈的抗原表位有别于其它克隆,适用于BAE5单抗相关表位的研究.     

递呈BAC5单抗识别位点的M13噬菌体克隆系的建立

目的：获得可递呈抗低分化和未分化癌细胞单克隆抗体（ＢＡＣ５单抗）抗原表位的Ｍ１３噬体克隆系。方法：以ＢＡＣ５单抗为靶抗体，对由Ｍ１３噬菌体构建的随机１２肽文库进行生物淘洗。用抗体竞争方法从阳性克隆中选出与ＢＡＣ５单抗结合率较高的克隆系。通过ＥＬＩＳＡ方法检测ＢＡＣ５单抗对上述克隆的选择性识别。结果：经过３轮淘洗，获得的阳性克隆率为７７％（３５／４５）。来自Ｃ２、Ｃ１７和Ｃ２９号克隆的噬菌体对外加Ｂ     

应用噬菌体随机肽库筛选2型登革病毒E蛋白的抗原表位

【目的】通过型特异性单抗与噬菌体随机 12肽库的生物淘洗 ,确定 2型登革病毒E蛋白分子的抗原表位。【方法】以DEN2型特异的E单克隆抗体作为筛选分子 ,生物淘洗噬菌体随机 12肽库 ,将筛选的噬菌体阳性克隆进行ELISA检测、DNA序列测定及展示肽的氨基酸序列推导 ,通过展示肽序列与DEN2E蛋白的氨基酸一级结构的对比 ,确定E蛋白的抗原优势表位并用相应的合成肽验证。【结果】常规生物淘洗获得富含芳香族氨基酸并有aHWbW核心结构的克隆 ,确定为非特异的塑料结合噬菌体。改进淘洗方法后 ,肽库筛选的噬菌体阳性克隆有共同的结构模体WFKKGS ,与DEN2E蛋白分子的 390～ 397有 3～ 5个氨基酸相同。其对应的合成 10肽能与淘洗单抗特异反应 ,并可抑制噬菌体阳性克隆与该单抗结合。【结论】本实验通过噬菌体随机肽库的生物淘洗确定DEN2E蛋白 390～ 397氨基酸残基 (WFKKGSSI)存在一线性的B细胞抗原表位。     

泰泽氏病原体抗原表位相关肽的初步筛选与鉴定

目的获得泰泽氏病原体抗原表位相关肽,用于实验动物血清中该病原体感染相关抗体的检测。方法选用泰泽氏病原体的四种单克隆抗体(M2、M3、M4、M5)作为配基,从噬菌体表面展示的随机7肽文库中筛选单抗识别的抗原表位,获得特异性噬菌体克隆;并采用ELISA、Western blot方法对其进行分析鉴定,获得阳性噬菌体克隆。结果获得阳性噬菌体克隆5个,其展示的融合蛋白能被泰泽氏病原体的免疫血清识别,ELISA检测A值的P/N为8.0～17.1;Western blot分析显示单一特异性条带,相对分子质量约为38×103。结论本研究获得的5个阳性克隆所表达的融合蛋白,为泰泽氏病原体抗原表位相关肽,可作为该病原体隐性感染血清学检测的候选抗原。     

噬菌体展示技术筛选表皮生长因子受体抗原模拟表位

目的 利用噬菌体12肽库进行生物淘洗,筛选表皮生长因子受体(EGFR)抗原模拟表位。方法 以抗EGFR的单克隆抗体药物西妥昔单抗及尼妥珠单抗为靶分子,在噬菌体12肽库中淘选表皮生长因子受体抗原模拟表位,经过3轮淘选后,选择可与西妥昔单抗及尼妥珠单抗有不同程度结合的噬菌体,对阳性产物进行克隆及测序。结果 发现17个和21个阳性噬菌体分别与西妥昔单抗及尼妥珠单抗不同程度地结合;阳性克隆测序结果分别获得了3种不同的氨基酸序列。结论 初步利用西妥昔单抗及尼妥珠单抗可从噬菌体展示的随机肽库中筛选到表皮生长因子受体相关抗原表位。     

噬菌体随机肽库筛选MUC1抗原模拟表位

目的噬菌体随机多肽文库筛选及鉴定MUC1抗原的模拟表位。方法利用纯化获得的BC2抗体筛选噬菌体随机7肽库,通过夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列并进行同源性及氨基酸分析,竞争性抑制实验鉴定噬菌体克隆。结果经3轮筛选,获得了30个阳性克隆,DNA序列分析并推导出氨基酸序列:TAPDLRP、SAPDLRP、AAPDSRP及LAPDFRP。鉴定结果表明:4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上。结论所得序列TAPDLRP、SAPDLRPAAPDSRP及LAPDFRP模拟MUC1抗原表位。     

应用噬菌体肽库筛选胃癌相关抗原模拟表位

目的 利用噬菌体递呈随机肽库筛选技术,进行胃癌相关抗原ＭＧ７Ａｇ模拟表位的研究,方法 应用离子交换层析法从小鼠腹水中纯化抗胃癌单克隆抗体ＭＧ７Ａｂ,细胞ＥＬＩＳＡ方法检测其活性,以ＭＧ７ｍＡｂ作为筛选分子,生物淘洗噬菌体递呈随机７肽库,经３次淘洗后将筛选所得的噬菌体克隆进行ＤＮＡ测序,递呈随机７肽氨基酸序列同源性分析,结果 对阳性噬菌体进行递呈肽氨基酸序理分析,获得一侯选模拟表位（ＫＰＨＸＨＸ     

HCV核心蛋白噬菌体随机展示肽库的构建

目的 :为了探讨噬菌体展示技术在筛选和鉴定病毒抗原表位研究中的应用前景。 方法 :利用随机引物 PCR法以HCV核心基因为模板合成随机 DNA片段 ,再经特定引物二次扩增后获得高丰度的 HCV核心蛋白随机 DNA片段 ,将该片段插入噬菌粒载体 p CANTAB5 X的 Xba 位点 ,转化大肠杆菌 TG1,辅助噬菌体拯救 ,建立噬菌体随机肽展示文库。结果 :所构建的随机文库含 1.2 3× 10 5个不同克隆 ,库容噬菌体滴度为 2× 10 1 2 TU/ m l(转导单位 / ml) ,PCR法检测插入阳性为 2 8.1% ,核酸杂交证实 40 %的克隆为 HCV核心基因阳性克隆。 结论 :所建的随机文库有足够大的库容和较好的多样性 ,可以满足HCV C抗原表位的筛选。     

基于抗原表位预测的MUC1模拟肽表位筛选

目的:预测粘蛋白1(Mucin1,MUC1)抗原的B细胞表位,从噬菌体随机多肽文库筛选及鉴定MUC1抗原的模拟表位.方法:对MUC1的二级结构及免疫原性进行分析,预测MUC1的抗原表位.利用纯化获得的Ma695抗体筛选噬菌体随机12肽库,夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列,竞争性抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆.结果:MUC1存在有17个潜在的抗原表位区域.经3轮筛选,获得了14个阳性克隆,DNA序列分析并推导出其氨基酸序列:KHYDPFHHRMPQ,QADTARS VALAG,VPSKPDLHVRSI及MTPIHYWNHNRV;4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上.结论:预测MUC1抗原B细胞表位,为进一步研究MUC1结构和功能奠定了基础.所得序列KHYDPFHHRMPQ,QADTARSVALAG,VPSKPDLHVRSI及MTPIH YWN HNRV能模拟MUC1抗原表位.     

噬菌体随机肽库筛选抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶单抗2A5的识别表位

目的利用噬菌体随机肽库技术筛选恶性疟原虫乳酸脱氢酶(pfLOH)抗体2A5的识别表位。方法以抗pfLDH的单抗2A5筛选噬菌体随机12肽库,挑取阳性克隆测定DNA序列,推导其氨基酸序列并进行同源性分析。通过ELISA、竞争抑制试验鉴定获得的噬菌体短肽与单抗2A5之间的结合特性。结果从噬菌体随机12肽库中筛选出21株可与2A5单抗特异结合的噬菌体克隆,其中多数克隆呈现核心序列SQK(R)L,该序列与pfLDH的一级序列具有一定同源性。竞争抑制实验显示,带有核心序列的噬菌体克隆可与pfLDH竞争结合单抗2A5。结论 SQK(R)L是pfLDH单抗2A5特异识别的表位。     

PRODUCTION OF PHAGE-DISPLAYED ANTI-IDIOTYPIC ANTIBODY SINGLE CHAIN VARIABLE FRAGMENTS TO MG7 MONOCLONAL ANTIBODY DIRECTED AGAINST GASTRIC CARCINOMA

Objective.To generate phage-displayed anti-idiotypic single chain variable fragments(anti-Id ScFv) to MG7 monoclonal antibody(McAb) directed against gastric carcinoma so as to lay a foundation for developing anti-Id ScFv vaccine of the cancer.Methods.Balb/c mice were immunized i.p.with MG7 McAb conjugated with keyhole limpet hemocyain (KLH),and mRNA was isolated from the spleens of the immunized mice.Heavy and light chain (VH and VL) genes of antibody were amplified separately and assembled into ScFv genes with a linker DNA by PCR.The ScFv genes were ligated into the phagemid vector pCANTAB5E and the ligated sample was transformed into competent E.coli TG1.The transformants were infected with M13K07 helper phage to yield recombinant phages displaying ScFv on the tips of M13 phage.After 4 founds of panning with MG7,the MG7-positive clones were selected by ELISA from the enriched phages.The types of the anti-Id ScFv displayed on the selected phage clones were preliminarily identified by competition ELISA.Results.The VH,VL and ScFv DNAs were about 340 bp,320bp and 750 bp respectively.Twenty-four MG7-positive clones were selected from 60 enriched phage clones,among which 5 displayed β or γ type anti-Id ScFv.Conclusion.The anti-Id ScFv to MG7 McAb can be successfully selected by recombinant phage antibody technique,which paves a way for the study of prevention and cure of gastric carcainoma by using anti-Id ScFv.     

亲环素A抗原表位氨基酸序列及三维结构研究

目的：研究人抗亲环素A（CyPA)McAb D4识别的抗原表位的氨基酸组成及其在蛋白分子上的三维定位。方法：以抗人亲环素A McAb D4作捕获抗体,对噬菌体展示肽库进行淘筛,并对筛选出的噬菌体中插入片段进行DNA序列测定和氨基到序列分析,再用RasMol蛋白质三维结构分析软件在亲环素A分子的三维结构中查找相应的抗原表位。结果：经过三轮淘筛和扩增,选择7个克隆进行序列,提示该抗原表位是构象性的。用RasMol蛋白质三维结构分析软件在亲环素A分子的三维结构中,找到由W121、S99、L98、Q111、S110、F112、L122构成的疏水代状结构,可能就是McAb D4的抗原表位。结论：人亲环素A分子上W121、S99、L98、Q111、S110、F112、L122构成一个构象型抗原表位。     

Screening and identification of mimotopes of LPS conservative epitope from random phage display peptide library

liPOpolysacchedde(ffe), or endototin, is a common component of the cell wall Of Grin negative bacterias, and is considered the initiative factor inducing endototic shock. The s~ture of LPS is so complicated thatthere is no ideal antagonist, anhbody or vaccine for thePunention and therapy of itS toxicity. Since LPS serotypesare abundant, the 'conservative anhgen epitopes includinglipid A and the inner core Oligosacchallde become the besttarget that may win a break~gh for developingnovel cr…     

弓形虫有效抗原表位的筛选及其对小鼠免疫保护性的研究

目的:利用噬菌体随机肽库技术筛选弓形虫抗原的有效表位，并探讨其免疫保护效果。方法：用纯化的弓形虫免疫兔血清IgC对噬菌体12肽库进行三轮筛选，对获得的日的噬菌体用间接ELISA和Dot—ELISA检测其特异性，并对其中的某些克隆进行Western—blot分析和序列测定；用混和噬菌体克隆及强阳性表位克隆免疫BABL／c小鼠．间接ELISA法测定其特异性抗体滴度，攻击感染后观察小鼠存活情况。结果：经三轮筛选，特异性噬菌体得到富集，随机挑取18个克隆经间接ELISA和Dot—ELISA鉴定，有16个克隆能与弓形虫免疫兔血清IgG呈特异性反应。Western—blot分析显示P2克隆能被免抗弓形虫血清所识别，具有类似于弓形虫抗原的免疫原性，其序列为5’-CTTCAGTTGGATCGGGCTCGGTTTTGGAAT CAGGGT-3’，与GenBank的弓形虫已知序列无一级结构的同源性；与原肽库对照组相比，P2实验组和P总实验组免疫小鼠均能诱导出较高滴度的IgG抗体，抗攻击感染后小鼠的存活率及存活时间也均高于对照组。结论：利用噬菌体随机肽库技术获得了弓形虫抗原的有效模拟睥位，这些表位能诱导对弓形虫的部分保护作用。     

能结合HCV E2蛋白的人CD81模拟肽的筛选与活性鉴定

目的用CD81单克隆抗体筛选噬菌体随机展示十二肽库,以期得到可模拟人CD81功能位点、能抑制HCVE2与其受体—人CD81分子结合的小肽。方法用CD81单抗从噬菌体随机展示十二肽库中筛选人CD81模拟肽,用ELISA鉴定阳性噬菌体克隆;以阳性噬菌体免疫BALB/c小鼠,分析小鼠免疫血清对阳性噬菌体与HCVE2结合的阻断作用;以HCVE2蛋白包被酶标板,检测阳性噬菌体对HCVE2与人CD81分子结合的抑制作用。结果对十二肽库进行3轮筛选后,经ELISA和DNA测序,鉴定出3个(C4,C13和C16)阳性克隆,与人CD81无同源序列。阳性噬菌体克隆C16免疫小鼠血清能阻断该克隆与HCVE2的结合。C16克隆能以剂量依赖的方式竞争性抑制HCVE2蛋白与人CD81的结合。结论用人CD81单抗从噬菌体随机展示肽库中筛选出的阳性噬菌体克隆所编码的小肽在功能上能模拟人CD81与HCVE2的结合活性,能竞争性抑制HCVE2与人CD81分子的结合,在抗HCV药物及疫苗研究中具有潜在应用价值。     

细胞间黏附因子1(Ⅰ区)模拟肽的筛选及初步鉴定

目的 筛选表达细胞间黏附因子1（ICAM－1）（Ⅰ区）模拟肽的特异噬菌体克隆,为研制抗脑型疟黏附肽类药物奠定基础。方法 以抗ICAM－1（Ⅰ区）的单抗15．2为靶,采用亲和筛选法对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选,通过ELISA及竞争抑制试验初步鉴定了获得的噬菌体短肽与单抗15．2之间的结合特性。结果 从第3轮洗脱液中挑选20个噬菌体克隆进行夹心法ELISA检测,其中18个克隆OD值超过阴性对照2．1倍以上,阳性率达90％。竞争性ELISA试验表明多数阳性噬菌体与ICAM－1能竞争性地与15．2单抗结合。结论 阳性噬菌体表达的短肽可能是15．2单抗所识别的模拟表位。Ⅰ     

从噬菌体随机肽库筛选庚型肝炎病毒E2抗原表位

目的：筛选能识别庚型肝炎病毒（ＨＧＶ） Ｅ２区的单克隆抗体和有竞争抑制活性的多肽。方法：利用抗ＨＧＶ Ｅ２区的３株单克隆抗体Ｍ６,Ｍ１３,Ｍ３０作为筛选配基,对构象限制性的随机环９肽库进行亲和筛选,并对阳性噬菌体克隆进行功能鉴定。结果：证实亲和筛选具有良好的富集效果后,随机挑出１６个噬菌体克隆进行交叉结合实验,有１４个克隆与Ｍ６抗体有较强的特异结合;其中１０个克隆在竞争抑制实验后中抑制率大于５０％     

从随机多肽库中筛选日本血吸虫抗原模拟表位诱导保护性免疫的研究

目的 从噬菌体随机肽库中筛选出能模拟日本血吸虫抗原表位的短肽分子，并测定其作为疫苗候选分子的潜能。方法 分别用正常及感染日本血吸虫的东方田鼠血清筛选在丝状噬菌体表面表达的随机十二肽库。经三轮亲和筛选后，随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其与日本血吸虫抗血清的反应。用混合噬菌体免疫小鼠并进行攻击感染。结果 随机挑取的12个克隆中，感染东方田鼠血清来源的噬菌体有10个克隆为阳性，正常血清来源的噬菌体有7个克隆为阳性。用感染东方田鼠血清筛到的噬菌体免疫小鼠诱导了部分保护作用（22．6％）及较高的肝卵减少率（68．9％）。然而，正常东方田鼠血清筛到的噬菌体没有保护效果。结论 感染及正常东方田鼠血清筛到的模拟表位具有免疫原性，提示随机肽库技术在日本血吸虫疫苗研制中有其潜在价值。     

胃癌相关抗原MG7-Ag模拟肽表位的筛选及测序分析

目的　从噬菌体呈现的随机肽库中筛选胃癌单克隆抗体MG7所识别的胃癌相关抗原的短肽模拟表位 ,为进一步研究胃癌相关抗原与单抗结合的结构基序奠定基础。方法　用胃癌单克隆抗体MG7对呈现于噬菌体衣壳蛋白pⅧ上的 2个九肽库分别进行亲和富集和免疫筛选 ;阳性克隆进一步用荧光标记和硝酸纤维素膜斑点印迹法证实其结合活性 ;经随机抽取部分阳性克隆进行DNA序列分析 ,推导出相应噬菌体呈现肽的氨基酸序列 ,通过序列比较分析相对保守的表位信息 ;运用HLA分子结合分析软件预测已测序短肽与HLA分子结合的可能性。结果　经反复多轮筛选和结合活性检测 ,从pⅧ和pⅧ cys 2个噬菌体肽库中分别得到了 12和 30个阳性克隆 ;通过对部分阳性克隆进行测序分析 ,推导相应的随机肽序列和序列比较分析 ,得到具有相对保守性的表位信息如PLX0 2 S、SAVR、XRMX、YARN等。经计算机预测分析 ,发现它们可与HLA多个分子结合。结论　PLX0 2 S、SAVR、XRMX、YARN等有可能为胃癌单克隆抗体MG7所识别的表位基序。