骨形态发生蛋白12诱导骨髓间充质干细胞构建组织工程肌腱★

背景：以往肌腱损伤的修复方法有端端吻合、自体肌腱移植、同种异体肌腱或人工肌腱移植等，但均有其各自缺点。目的：探讨以家兔骨髓间充质干细胞为种子细胞，骨形态发生蛋白12诱导，聚羟基乙酸复合材料作为支架材料，预构组织工程化肌腱重建家兔跟腱缺损的可能性。方法：家兔抽取股骨近端骨髓，分离所得细胞传代至第2代，加入10μg/L 骨形态发生蛋白12诱导分化，并与Ⅰ型胶原溶液按一定比例移植于预张的聚羟基乙酸缝线上预制组织工程化肌腱备用。将家兔制备成跟腱缺损模型，分别采用不同方法修复跟腱缺损：组织工程化肌腱修复，Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸缝线修复，丝线行端端修复。修复12周对各组肌腱行形态学、力学及组织病理学观察。结果与结论：修复12周家兔肌腱组织病理切片：组织工程化肌腱组可见大量梭形纤维母细胞顺应力学方向排列均匀分布于胶原中，纤维细胞明显增多，胶原致密；Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸缝线组可见部分纤维组织增生伴少许肉芽组织形成，胶原纤维呈松散网丝状，细胞排列紊乱分布不均；丝线组可见纤维组织旁见大量肉芽组织形成。修复12周家兔肌腱生物力学强度：骨形态发生蛋白12+聚羟基乙酸重建肌腱的力学强度明显优于Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸组，与丝线缝合组差异无显著性意义；但骨形态发生蛋白12+聚羟基乙酸重建肌腱的力学强度低于正常肌腱。提示以自体骨髓间充质干细胞作为种子细胞，骨形态发生蛋白12诱导，以聚羟基乙酸为支架，可望构建组织工程化肌腱。构建的组织工程肌腱具有一定的生物力学特性，能用于修复跟腱缺损。     

胶原-聚羟基乙酸支架与骨髓间质干细胞构建的组织工程肌腱

背景：肌腱组织工程中应用的支架材料大致分为合成高分子材料和天然细胞外基质材料两类。 目的：探讨用胶原一聚羟基乙酸复合材料作为支架材料，以家兔骨髓间质干细胞为种子细胞预构组织工程化肌腱重建兔跟腱的可能性。 设计、时间及地点：单一样本观察，于2004—06／2005-06在中南大学湘雅医学院动物学部及湘雅医院中心实验室完成。 材料：健康家兔6只，体质量1．0～1．5kg，雌雄不限；体质量250g左右大白鼠1只用于Ⅰ型胶原溶液的制备。 方法：以鼠尾胶原-聚羟基乙酸为支架，将分离、培养的自体骨髓间质干细胞作为种子细胞，在体外混合培养后回植至兔跟腱缺损处，设为实验组。对照组以不含种子细胞的胶原聚羟基乙酸支架修复肌腱缺损。 主要观察指标：①骨髓问充质干细胞原代接种后5d半量换液时在倒置显微下观察，并以CD44原位杂交检测该细胞。②组织工程化肌腱的体外构建结果。③于术后12周取移植处新生组织进行大体、组织细胞学观察，并做Ⅰ型和Ⅲ型胶原免疫组织化学染色。 结果：原代细胞以CD44原位杂交显色，胞浆呈棕黄色，胞核经苏木精复染呈蓝色。提示为骨髓间充质干细胞。术后12周实验组新生组织与受体肌腱组织完好连接，呈条索状，与周围其他组织无粘连；组织学切片结果类似于正常肌腱组织；免疫组织化学染色示Ⅰ型胶原阳性，Ⅲ型胶原阴性。而对照组新生组织较细小、与周围组织有粘连；组织学切片示胶原纤维呈松散网丝状，细胞排列紊乱；免疫组织化学染色示Ⅰ型、Ⅲ型胶原阳性。 结论：以胶原聚羟基乙酸为支架，以自体骨髓间质干细胞作为种子细胞可望构建组织工程化肌腱。     

应用组织工程化肌腱修复兔跟腱缺损

目的:由于肌腱来源受限及人工代用品力学性能差等缺点限制了临床肌腱损伤的修复,为此探索组织工程化肌腱修复兔跟腱缺损的可行性,以期为肌腱修复提供实验依据。方法:实验于2000-08/2001-12在第一军医大学中心实验室完成。30只新西兰白兔分为2组:人发角蛋白(HHK)组:用HHK材料修复兔跟腱缺损;组织工程化肌腱组:骨髓间充质干细胞(MSCs)与HHK在模拟微重力条件下形成细胞-材料复合体,修复兔跟腱缺损。采用组织学和免疫组织化学方法观察术后3,6和12周损伤肌腱的修复情况。利用分子生物学手段检测新生肌腱Ⅰ型胶原mRNA表达。结果:扫描电镜下可见MSCs-HHK组织工程化肌腱上有大量梭形的MSCs贴附生长,细胞平行排列,细胞间有突起相连。与HHK组相比,组织工程化肌腱组新生肌腱组织Ⅰ型胶原mRNA呈较高表达,腱细胞增生活跃,胶原纤维更为成熟。结论:在模拟微重力条件下以MSCs为种子细胞,HHK为支架材料构建的组织工程化肌腱能够有效地修复兔跟腱缺损。     

猪骨髓间充质干细胞体外诱导构建组织工程化软骨

目的:如何修复气管缺损是一项医学难题,组织工程技术有望解决这一难题.要构建工程化气管软骨,种子细胞是关键因素之一.探讨利用组织工程方法,将猪骨髓间充质干细胞在体外诱导、培养后,构建软骨组织的可能性.方法:实验于2006-10/2007-05在北京协和医院中心实验室完成.①实验材料:小型猪6只由中国农业大学提供,雌雄不限,体质量15～20 kg;聚羟基乙酸纤维(Equl.com.美国).②实验过程及评估:抽取猪的胸骨骨髓, 经密度梯度离心法在体外进行分离、纯化,得到骨髓间充质干细胞, 并在含有转化生长因子β1的特定培养基内进行培养、诱导,免疫组织化学检测诱导细胞Ⅱ型胶原分泌.将诱导分化的骨髓间充质干细胞接种于聚羟基乙酸支架上,将其作为实验组;对照组为未接种细胞的单纯聚羟基乙酸支架;将两组标本环行包裹于直径为0.4 cm的离心管外表面,植入自体猪皮下,进行体内培养,分别于6,8,10周后取材,进行大体观察和组织学检测,评估工程化软骨的形成.结果:①通过密度梯度离心法可获取骨髓间充质干细胞,对其进行培养扩增后可获得较多的细胞.②猪骨髓间充质干细胞通过特定的诱导后可向软骨细胞分化,诱导细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学检测结果为阳性.③猪骨髓间充质干细胞-聚羟基乙酸复合物经过体内第6,8,10周培养后,标本出现软骨组织外观,进行组织学切片可见软骨陷窝,Ⅱ型胶原蛋白的免疫组织化学检测为阳性.结论:猪骨髓间充质干细胞在成软骨诱导剂作用下,经体外和体内培养后,可生成组织工程化软骨.     

Ⅰ/Ⅲ型胶原膜联合自体骨髓间充质干细胞修复兔膝关节软骨缺损

研究表明Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原都有利于骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和分化.目的:观察Ⅰ/Ⅲ型胶原膜联合自体骨髓间充质干细胞修复兔膝关节软骨缺损的可行性.方法:取24只新西兰大白兔制作双膝股骨滑车直径3.8 mm、深2 mm关节软骨缺损模型,分为2组:实验组缺损区植入Ⅰ/Ⅲ型胶原膜-自体骨髓间充质干细胞复合物,对照组缺损区植入单纯Ⅰ/Ⅲ型胶原膜.结果与结论:膝关节股骨标本组织学染色显示,实验组植入8周时为类透明软骨修复,12周时接近于正常软骨;对照组植入8周时以纤维样组织修复为主,12周时为纤维软骨修复.实验组植入后8,12周组织学评分均明显高于对照组(P<0.001).表明运用Ⅰ/Ⅲ型胶原膜-自体骨髓间充质干细胞复合物可修复关节软骨缺损.     

应用组织工程化肌腱修复兔跟腱缺损

目的：由于肌腱来源受限及人工代用品力学性能差等缺点限制了临床肌腱损伤的修复，为此探索组织工程化肌腱修复兔跟腱缺损的可行性，以期为肌腱修复提供实验依据。方法：实验于2000—08／2001—12在第一军医大学中心实验室完成。30只新西兰白兔分为2组：人发角蛋白(HHK)组：用HHK材料修复兔跟腱缺损；组织工程化肌腱组：骨髓间充质干细胞(MSCs)与HHK在模拟微重力条件下形成细胞—材料复合体，修复兔跟腱缺损。采用组织学和免疫组织化学方法观察术后3，6和12周损伤肌腱的修复情况。利用分子生物学手段检测新生肌腱Ⅰ型胶原mRNA表达。结果：扫描电镜下可见MSCs—HHK组织工程化肌腱上有大量梭形的MSCs贴附生长，细胞平行排列，细胞间有突起相连。与HHK组相比，组织工程化肌腱组新生肌腱组织Ⅰ型胶原mRNA呈较高表达，腱细胞增生活跃，胶原纤维更为成熟。结论：在模拟微重力条件下以MSCs为种子细胞，HHK为支架材料构建的组织工程化肌腱能够有效地修复兔跟腱缺损。     

不同来源骨髓间充质干细胞的体内成软骨

背景：骨髓间充质干细胞经体外诱导后可修复软骨缺损,但目前采用的种子细胞多来源于自体或同种异体。目的：观察同种异体及异种来源的骨髓间充质干细胞诱导成软骨后修复喉软骨缺损的效果。方法：分别取人胚胎骨髓间充质干细胞和刚出生兔骨髓间充质干细胞的第3代细胞种植于聚乳酸-羟基乙酸共聚物生物支架上,并加入转化生长因子β1和软骨形态发生蛋白诱导成软骨细胞。将两种细胞体系植入新西兰白兔体内,并于植入后4,8周取材行大体、组织学观察。结果与结论：植入后4,8周人胚胎骨髓间充质干细胞和兔骨髓间充质干细胞均有新生组织填充,经组织学观察大部分为软骨细胞,分泌软骨细胞基质糖胺聚糖和Ⅱ型胶原,且两种细胞支架复合物所生成的软骨细胞数大致相同,并无明显的免疫排斥反应。提示异种来源的骨髓间充质干细胞复合聚乳酸-羟基乙酸共聚物在转化生长因子β1和软骨形态发生蛋白联合诱导下所得的组织工程化软骨,与同种来源的骨髓间充质干细胞所获得的组织工程化软骨修复喉软骨缺损具有可比性。     

聚乙酸-聚乙醇酸共聚物复合同种异体细胞修复软骨缺损

背景:以自体骨髓间充质干细胞和软骨细胞作为种子细胞修复软骨缺损可达到理想效果,但存在细胞数量不足及二次创伤等问题。目的:观察同种异体骨髓间充质干细胞和软骨细胞与聚乙酸-聚乙醇酸共聚物复合修复关节软骨的可行性。方法:将15只新西兰大白兔随机分为实验组、对照组、空白组,制作关节软骨缺损模型,分别于骨缺损处植入同种异体骨髓间充质干细胞和同种异体软骨细胞与聚乙酸-聚乙醇酸共聚物复合体、自体骨髓间充质干细胞和自体软骨细胞与聚乙酸-聚乙醇酸共聚物复合体、聚乙酸-聚乙醇酸共聚物材料。结果与结论:术后12周苏木精-伊红及Masson三色染色显示,实验组软骨缺损处可见软骨细胞,呈圆形或多角形,柱状排列,软骨陷窝形成明显,可见大量细胞外基质沉积,修复组织显示出透明软骨样,与周围软骨结合好,与底层骨结合紧密;对照组与实验组无明显差别;空白组软骨缺损处可见纤维样细胞。说明同种异体骨髓间充质干细胞和软骨细胞与聚乙酸-聚乙醇酸共聚物复合可修复关节软骨缺损。     

纳米β-磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原层状支架复合骨髓间充质干细胞修复膝关节骨软骨缺损

背景:关节软骨损伤修复面临的难题主要表现在再生软骨的结构及生理功能距正常软骨相差较远,无法满足正常生理需要,目前修复方法很多,但效果均不理想.目的:探讨纳米β-磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原层状支架-骨髓间充质干细胞复合物修复犬膝关节骨软骨缺损的可行性.方法:12月龄杂种犬10只,随枫分为实验组、缺损对照组,无菌条件下自髂后嵴处抽取骨髓分离培养骨髓间充质干细胞,传至第3代消化、收集,调整细胞浓度为2×109L-1,与纳米β磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原共培养24 h,即制成纳米β-磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原层状支架-骨髓间充质干细胞复合物.两组犬均制备右膝关节骨软骨缺损,实验组于缺损处植入支架-细胞复合物,缺损对照组不做任何处理.结果与结论:第12周,实验组缺损内充填以白色半透明组织,表面光滑,触之较软,稍高出周围软骨面,软骨细胞分布较均一,排列无方向性;第24周,实验组缺损内充填白色半透明新生软骨组织,色泽与正常软骨相似,质韧,表面平整,与正常软骨界限消失,表面细胞平行于关节面,深层细胞排列紊乱,细胞呈团状,基质异染广泛,与周围正常软骨连接良好.缺损对照组缺损未修复,底部为白色纤维组织.提示骨髓间充质干细胞是修复关节软骨缺损较理想的种子细胞,在新生软骨形成的同时,纳米β-磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原层状支架逐渐降解吸收,是组织工程修复关节软骨缺损适宜的支架材料.     

改性纳米羟基磷灰石/聚乳酸-聚羟乙酸复合骨髓基质干细胞修复兔桡骨缺损

背景:前期试验证实骨髓基质干细胞能够在改性纳米羟基磷灰石/聚乳酸-聚羟乙酸材料表面黏附、增殖,该材料具有良好的生物安全性。目的:观察骨髓基质干细胞与改性纳米羟基磷灰石/聚乳酸-聚羟乙酸材料复合修复兔桡骨缺损的效果。方法:建立兔15mm桡骨缺损模型,随机分为3组:空白对照组不进行任何处理,实验组植入改性纳米羟基磷灰石/聚乳酸-聚羟乙酸+骨髓基质干细胞组织工程化骨,对照组植入单纯改性纳米羟基磷灰石/聚乳酸-聚羟乙酸支架材料。结果与结论:①X射线评价:术后1～12周,实验组骨缺损修复程度及速度明显优于空白对照组与对照组(P<0.05)。②组织学检测:实验组术后4周即可观察到新生骨和纤维组织长入材料空隙,局部形成陷窝结构;8周时新生骨组织增多,部分可观察到成熟的骨小梁结构;12周时可见大量成熟骨细胞,骨小梁排列紧密,移植材料逐步被新生骨取代,与正常骨组织形态基本一致,且骨小梁出现时间早于空白对照组与对照组。说明骨髓基质干细胞复合改性纳米羟基磷灰石/聚乳酸-聚羟乙酸构建的组织工程化骨能够促进骨缺损处新骨的生成,较单纯支架材料具有明显优势。     

骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质组合生长因子诱导向软骨细胞分化

背景：用组织工程学方法高质量修复关节软骨缺损并达到很好的远期疗效目前尚无定论。鉴于此,课题组提出＂同种异体骨髓间充质干细胞关节腔内定向培养组织工程软骨＂的实验设技。目的：同种异体脱钙骨基质组合转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力,同时探索其在关节腔内培养促进向关节软骨定向分化的方法。方法：分离兔骨髓间充质干细胞并行体外培养,分为两组：实验组DMEM培养液中加入转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ,对照组中未加入诱导因子。比较两组细胞的增殖情况和成软骨分化情况。制备同种异体脱钙骨基质支架材料,实验组骨髓间充质干细胞负载到同种异体脱钙骨基质中,构建组织工程软骨复合体,取另2只兔的腰背筋膜包裹后缝合固定到30只兔膝关节腔内行腔内培养。分别于植入后4,8,12周各取10只标本进行组织学切片观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学观测,并对结果进行分析。结果与结论：实验组中骨髓间充质干细胞集落形成效率明显高于对照组（u=3.326,P〈0.01）。实验组细胞爬片做Ⅱ型胶原免疫组化检测呈阳性,对照组未见阳性细胞。组织工程复合体在腔内培养12周后,苏木精-伊红染色见大量软骨细胞增生,胞核染色呈蓝色;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,大量软骨陷窝形成,周围大量基质包绕;Ⅱ型胶原免疫组织化学反应见细胞外基质中出现大量棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色强阳性。提示转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ可显著促进骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化,骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质结合后可在关节腔内成功培养出组织工程软骨。同种异体脱钙骨基质符合组织工程软骨支架材料的基本要求。     

外源性胶原对组织工程肌腱构建影响的体外形态学观察

背景:I型胶原抗原性低,具有为细胞移行、增殖和分泌提供支架结构的特殊功能。目的:利用I型胶原观察转化人胚腱细胞与人工材料复合后的形态学变化,为体外构建组织工程化肌腱提供实验依据。设计:随机对照观察。单位:四川大学华西医院骨科。材料:实验于1998-07/09在华西医科大学移植免疫室完成。实验设立人发复合胶原组、碳纤维复合胶原组、聚羟基乙酸复合胶原组作为实验组,设立人发未复合胶原组、碳纤维未复合胶原组、聚羟基乙酸未复合胶原组作为对照组。人工材料:健康成人头发(长约30cm,80g左右),碳纤维编织带(兰州碳素厂提供),聚羟基乙酸纤维束(美国Johnson)。方法:①人发复合胶原组选9根健康成人头发,经处理后3根为一股编织成腱,长约0.8cm,直径约0.4cm,两端自身打结。②碳纤维复合胶原组将购买的碳纤维编织带分开,制成直径及长度与人发腱相同的人工材料,两端用5/0丝线捆扎。③聚羟基乙酸复合胶原组将3根聚羟基乙酸纤维束互相编织成束,直径及长度与人发腱相同,两端用5/0丝线捆扎。④各对照组编织支架材料过程与其对应实验组相同。⑤各组支架材料均制备5根。实验组支架材料60Co灭菌后,无菌条件下置于I型胶原溶液中0.5h,取出后室温干燥备用。对照组支架材料均不与I型胶原复合。⑥各组分别与细胞密度为3×106/mm3的转化人胚腱细胞培养基进行体外联合培养,于培养后不同时间点对细胞数量及形态进行倒置显微镜和扫描电镜观察。主要观察指标:①细胞生长情况及附着情况倒置显微镜观察结果。②细胞形态及与材料附着情况扫描电镜观察结果。结果:①细胞生长情况及附着情况倒置显微镜观察结果:培养2h后,各实验组均可见细胞向材料周围聚集,附着于材料的部分细胞呈圆形;培养3d后,附着于材料上的细胞开始增多,形态由圆形向椭圆形演变,可见圆形与椭圆形细胞“共存”现象;而各对照组培养2h和3d后,3种材料上细胞附着均较少。培养5d后,各实验组材料上细胞形态向梭形演变,细胞数量进一步增多,且碳纤维材料之间可观察到大量梭形细胞生长;而各对照组细胞形态大部分仍为圆形及椭圆形,细胞数量少于各自对应实验组。②细胞形态及与材料附着情况扫描电镜观察结果:体外培养5d后,各实验组材料表面腱细胞绝大部分呈梭形,同时腱细胞伸出突起,沿材料纵轴生长,其间有丝状及片状物质,相互交织。而对照组细胞明显较各自对应实验组附着少,细胞也呈梭形或圆形,但未见材料间的丝状及片状物质,也未见细胞伸出突起。结论:人发、碳纤维、聚羟基乙酸表面复合I型胶原后,有利于细胞附着,材料周围的细胞不仅数量增多,且出现圆形与椭圆形细胞“共存”现象,细胞形态向梭形演变,说明外源性胶原有助于细胞对材料的附着以及细胞自身的增殖。     

不同支架材料构建组织工程肌腱的性能评价

目的：总结修复肌腱损伤的主要组织工程支架材料及研究进展。方法：由第一作者采用电子检索的方式,在CNKI数据库中检索1902-01/2010-10有关生物材料应用于组织工程肌腱支架的研究文章,关键词为＂重建肌腱,生物材料,人工肌腱,组织工程,支架材料＂。排除重复研究、普通综述或Meta分析类文章,筛选纳入18篇文献进行评价。结果：来源于自然界的天然生物材料主要有蚕丝、小肠黏膜下层、胶原、衍生肌腱支架材料等,保留了组织正常的三维网架结构,组织相容性好,但力学性能较差、降解速度快。人工合成高分子材料主要为聚乳酸和聚羟基乙酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚磷酸钙纤维等,但存在亲水性低、细胞黏附性能差的不足。结论：天然及合成高分子材料作为组织工程支架材料都有各自的优缺点,绝大多数还处于研究阶段,尚未应用于临床,因此改进支架材料的性能是目前研究的主要方向之一。     

Stem cells as vehicles for orthopedic gene therapy

Adult stem cells reside in adult tissues and serve as the source for their specialized cells. In response to specific factors and signals, adult stem cells can differentiate and give rise to functional tissue specialized cells. Adult mesenchymal stem cells (MSCs) have the potential to differentiate into various mesenchymal lineages such as muscle, bone, cartilage, fat, tendon and ligaments. Adult MSCs can be relatively easily isolated from different tissues such as bone marrow, fat and muscle. Adult MSCs are also easy to manipulate and expand in vitro. It is these properties of adult MSCs that have made them the focus of cell-mediated gene therapy for skeletal tissue regeneration. Adult MSCs engineered to express various factors not only deliver them in vivo, but also respond to these factors and differentiate into skeletal specialized cells. This allows them to actively participate in the tissue regeneration process. In this review, we examine the recent achievements and developments in stem-cell-based gene therapy approaches and their applications to bone, cartilage, tendon and ligament tissues that are the current focus of orthopedic medicine.     

新型组织工程化人工骨的体外初步构建

背景L-聚乳酸可以用于制备骨组织工程支架材料 ,但存在某些缺陷 ,能否复合聚磷酸钙纤维、Ⅰ型胶原来改善材料性能,从而找到新的组织工程化骨体外构建方法?目的应用组织工程学技术,体外初步构建有活性的新型组织工程化人工骨.设计 体外构建细胞-材料复合体,自身对照前瞻性研究.地点和对象本研究在解放军第三军医大学西南医院骨科和兰州铁道医学院复合材料研究所完成,对象为 5例重庆市健康志愿者的髂骨骨髓.干预培养、诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞表型分化,制备性能优越的新型支架材料,再按一定的方法体外构建细胞-材料复合体.主要观察指标细胞碱性磷酸酶染色的阳性率、扫描电镜观察组织工程化骨的微观结构.结果由 L-聚乳酸、聚磷酸钙纤维、Ⅰ型胶原制备出新型的骨组织工程复合支架材料,孔径 300～ 450 μ m,孔隙率 90.1%;细胞接种前碱性磷酸酶阳性率为(55± 8)%,接种后细胞可在材料内良好贴附生长,碱性磷酸酶阳性率为(52± 6)%,两者差异无显著性.结论经成骨诱导的间充质干细胞,可以与由 L-聚乳酸、聚磷酸钙纤维、Ⅰ型胶原制备的支架材料复合,在体外构建出组织工程化人工骨.     

组织工程肌腱细胞研究模型的构建:SD大鼠尾腱细胞可行吗?

背景:目前常用的动物肌腱研究模型(比如兔,罗曼鸡等)的培养方法存在周期长,细胞获取量少等不足,往往成为制约肌腱组织工程实验研究进程的瓶颈.目的:希望建立SD大鼠鼠尾肌腱细胞培养流程,以期用较短时间获取大量种子细胞,为更高的工程化肌腱构造研究创造模型构建条件.设计、时间及地点:对比观察,于2006-02/11在四川大学生物治疗国家重点实验室干细胞与组织工程研究室完成.材料:7～10dSD大鼠2只用于获取鼠尾腱细胞;第4代人包皮成纤维细胞由四川大学华西医院干细胞与组织工程研究室提供.方法:选用SD乳鼠,无菌条件下抽取尾腱,体积分数为10%的小牛血清+DF培养基悬浮组织块培养法获得鼠尾肌腱原代细胞,将第3代细胞与人包皮成纤维细胞为对照,行Ⅰ,Ⅲ型胶原免疫细胞化学染色,染色结果用image-pro plus 5.02行吸光度测量,并做统计分析.主要观察指标:SD大鼠尾腱细胞免疫细胞化学染色结果及染色吸光度测量结果.结果:第2代SD大鼠尾腱细胞Ⅰ型胶原染色呈阳性,Ⅲ型胶原染色呈阴性;人成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学皆呈阳性.尾腱细胞和人成纤维细胞Ⅰ型胶原表达吸光度值均明显高于Ⅲ型胶原(P＜0.05).两种细胞Ⅲ型胶原表达吸光度值与空白对照之间差异无显著性意义(P＞0.05).结论:SD乳鼠尾腱源细胞符合肌腱细胞的生物学特性.采用组织块悬浮培养可以在短期内大量获取原代或传代尾腱细胞.     

玻璃化冷冻保存组织工程肌腱植入大鼠体内的组织学变化

背景：应用玻璃化冷冻方法保存组织工程肌腱具有可行性和应用前景,有待进一步研究。目的：探讨应用玻璃化冷冻保存组织工程肌腱体内植入对大鼠跟腱缺损修复的影响。方法：选用成年SD大鼠64只,于大鼠跟腱中段制备5mm肌腱缺损模型,随机摸球法均分为2组,分别植入玻璃化冷冻保存组织工程肌腱和新鲜非冷冻保存组织工程肌腱。植入后2,4,6,8周,观察植入肌腱材料及周围组织的大体形态和组织学变化。结果与结论：两组肌腱材料体内植入后的大体形态和组织学反应无明显差异。植入后2,4周,植入的肌腱材料发生降解,材料中间及周围有大量炎性细胞浸润和纤维结缔组织增生。植入后6,8周,大量新生胶原纤维组织长入并替代降解的植入材料,形态和排列方式趋近于正常肌腱组织,大鼠跟腱缺损基本修复。结果表明玻璃化冷冻保存组织工程肌腱体内植入可修复大鼠跟腱缺损。     

血管内皮生长因子对免跟腱内源性愈合作用的量效关系

背景:多种生长因子在肌腱愈合过程中参与调控细胞的增生和基质合成,血管内皮生长因子在组织愈合和再生中发挥重要作用.目前对于血管内皮生长因子在肌腱内源性愈合方面的研究尚不多.目的:观察兔跟腱局部硅胶管阻隔后,应用血管内皮生长因子对跟腱内源性愈合作用的量效关系.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-11/2008-04在中南大学湘雅二医院中心实验室完成.材料:健康家兔48只,体质量2.5～3.0 kg,随机均分成空白组、血管内皮生长因子100,50,10 ng组,每组12只,用于建立跟腱损伤模型.方法:切开家兔右侧跟腱表面皮肤、皮下组织,钝性分离跟腱的腓肠肌束支和比目鱼肌束支,于跟骨止点上方约2 cm处横行切断跟腱腓肠肌束支,将2 cm长硅胶管套入一侧断端,5-0缝合线改良Kessler法缝合跟腱,缝合后将硅胶管覆盖跟腱缝合处,空白组硅胶管内不加药,其他3组于手术当日及术后第7,14,21天往硅胶管内加入血管内皮生长因子100,50,10 ng.主要观察指标:术后2,4,6周,每组各取4只家兔行大体标本肉眼观察及组织学观测.结果:术后6周,各组硅胶管外与周围组织粘连较2,4周时减轻,需钝性或用手术刀分离一面,各组肌腱粘连程度分级差异均无显著性意义(P>0.05),管内跟腱断端完全被牢固的新生跟腱纤维组织所连接,各组均愈合良好,血管内皮生长因子100,50,10 ng组较空白组愈合质量好(P<0.05).术后2,4,6周,血管内皮生长因子100,50 ng组成纤维细胞数较血管内皮生长因10 ng组多(P<0.05),血管内皮生长因子100,50 ng组成纤维细胞计数差异无显著性意义(P>0.05),3组胶原水平无差异,血管内皮生长因子100,50,10 ng组成纤维细胞计数及胶原水平均高于空白组(P<0.05).结论:不同剂量外源性血管内皮生长因子均能促进成纤维细胞的增殖和成熟,增加胶原的分泌,促进胶原纤维的成熟,从而促进跟腱的内源性愈合.100,50 ng血管内皮生长因子对促进跟腱愈合效果要优于应用1 0 ng,100 ng与50 ng之间无明显差异.     

纳米壳聚糖-胶原纤维支架的生物相容性

背景:新型仿生纳米壳聚糖-胶原支架在纳米水平上与细胞外基质结构相似,其是否可促进骨髓间充质干细胞的黏附及生长,并显示良好的相容性?目的:评价新型纳米壳聚糖-胶原支架与SD大鼠骨髓基质干细胞的体外相容性.设计:单一样本观察.单位:暨南大学附属第一医院骨科.材料:实验于2007-03/2007-07在暨南大学附属第一医院实验中心完成.选取10只4周龄雌性SD大鼠,SPF级,体质量200 g,由广东省实验动物中心提供(许可证号为SCXK(粤)2003-0002).实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.纳米壳聚糖-胶原纤维支架由理工学院生物材料研究室提供.方法:①分离培养SD大鼠骨髓基质干细胞,流式细胞分析法对细胞表面抗原进行检测.②聚电解质共凝聚技术制作纳米壳聚糖-胶原纤维支架.③取生长良好的P3代,与纳米壳聚糖-胶原纤维支架体外联合诱导培养,以单纯纳米壳聚糖支架材料为对照,通过细胞贴壁率、生长曲线、细胞活力及周期、扫描电镜观察综合评价材料与细胞的相容性. 主要观察指标:①骨髓间充质干细胞分离培养后进行流式细胞表面抗原标志鉴定.②纳米材料及细胞复合2,4,8 d后扫描电镜观察细胞与材料相容情况.③细胞对材料黏附率的测定.④细胞与材料复合5 d检测细胞周期及活力.结果:①细胞表面抗原标志检测结果:CD29表达为90.86%,CD106表达为73.38%,CD44表达为82.61%,CD34表达为0.76%,CD45表达为0.60%.②细胞与材料相容情况:扫描电镜可见纳米壳聚糖-胶原纤维支架为多孔的三维立体结构,材料内部形成大小不一的大孔和互连的小孔,彼此相互交通.应用质量法测得的孔隙率为85%～90%,孔径为50～300 μm,平均150 μm.骨髓基质干细胞复合到纳米壳聚糖-胶原纤维支架后2 d,细胞呈球形散在分布;4 d后细胞呈梭形,延展爬行且有伪足与材料表面锚靠;8 d时细胞增殖,相互间融合,并有大量的细胞外基质分泌,大部分材料颗粒被覆盖.③细胞对材料黏附率:细胞-支架复合物共培养2及6 h,骨髓基质干细胞在纳米壳聚糖-胶原纤维支架的黏附率均高于单纯纳米壳聚糖支架.④纳米壳聚糖-胶原纤维支架与单纯纳米壳聚糖支架的细胞、细胞周期特点比较:纳米壳聚糖-胶原纤维支架细胞活力为96.67%,细胞周期G0-G1为90.81%,G2-M为0.52%,S为8.66%,G2/G1为1.81.单纯纳米壳聚糖支架细胞活力为95.27%,细胞周期G0-G1为87.14%,G2-M为9.69%,S为4.16%,G2/G1为1.80.结论:纳米壳聚糖-胶原支架与骨髓基质干细胞有良好的组织相容性,可用来做组织工程生物材料.     

活化素A和视黄酸诱导骨髓间充质干细胞体外分化为胰岛素分泌细胞

背景:胰岛移植是治疗Ⅰ型糖尿病的最有效的方法。然而,供体组织来源的匮乏限制了其应用。近来干细胞研究的进展表明,干细胞疗法可能解决这一问题。目的:采用活化素A和视黄酸诱导骨髓间充质干细胞分化,探讨骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的可能性。设计:随机对照实验。单位:解放军军事医学科学院生物工程研究所。材料:实验于2004-11/2005-06在解放军军事医学科学院生物工程研究所完成。Sprague-Dawley大鼠6只,雄性,体质量150～160g,由解放军军事医学科学院实验动物中心提供。方法:无菌抽取大鼠股骨骨髓,采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。传代细胞随机分为4组,高糖组、活化素A和视黄酸组、β-巯基乙醇组和阴性对照组。分别采用含有高糖、活化素A和视黄酸、β-巯基乙醇等刺激因素的条件培养基进行诱导。应用免疫细胞化学和反转录聚合酶链反应等方法对分化细胞表型进行检测。主要观察指标:检测胰岛素和胰高血糖素,以及胰岛素1mRNA的表达。结果:骨髓间充质干细胞经过诱导后,①在高糖诱导组中,有散在的胰岛素和胰高血糖素阳性反应细胞出现。②活化素A和视黄酸组及β-巯基乙醇组有较多的胰岛素和胰高血糖素阳性反应细胞出现,而且这些细胞形成类似胰岛样的结构。③高糖组,活化素A和视黄酸组,β-巯基乙醇组均可见胰岛素1mRNA的表达。④阴性对照组未见有胰岛素和胰高血糖素阳性反应细胞出现以及胰岛素1mRNA的表达。结论:实验建立的一种基于活化素A和视黄酸及其他成熟因子的一种诱导方案,成功将骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛素阳性反应细胞,并且形成类似胰岛样结构,但其诱导效率有待进一步提高。