多发性骨髓瘤患者浆细胞免疫表型特点及其临床意义研究

目的：观察多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓中浆细胞免疫表型特点，及其与患者临床预后的相关性。方法：收集35例MM患者资料，骨髓涂片及切片分别经瑞氏-吉姆萨和HE染色后，观察分析骨髓细胞形态及病理学特点。同时，取患者骨髓或外周血分别进行流式细胞术检测及相关实验室检查。结果：MM患者骨髓浆细胞不仅数量明显增多，且形态明显异常，切片中浆细胞分布类型包括塞实型16例（45.71%），结节型14例（40.00%）和间质型5例（14.29%）。MM患者中出现血清LDH、β2-MG、Cr和BUN等检测指标升高的比例分别占80%、85.71%、62.86%和60%。MM患者浆细胞CD38、CD138均呈阳性表达，CD56、CD200、CD117和CD28阳性患者比例分别为65.71%、94.29%、60%和54.29%，CD20、CD81、CD33、CD27及CD13阳性患者比例分别为37.14%、42.86%、28.57%、57.14%和34.29%，而CD19及CD45阳性患者比例分别为22.86%和31.42%，且Igκ或Igλ链表达缺失呈单克隆增生。其中CD27和CD28的表达情况与MM患者预后密切相关，浆细胞CD27表达缺失及CD28阳性表达的患者5年总生存率较低（P < 0.05）。结论：MM患者骨髓中浆细胞免疫表型明显异常，其中CD27和CD28的表达与患者病情进展和临床预后具有显著相关性，因此免疫表型检测在MM患者临床诊断、治疗监测中具有重要意义。     

多发性骨髓瘤患者浆细胞免疫表型特点及其临床意义研究

目的：观察多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓中浆细胞免疫表型特点,及其与患者临床预后的相关性。方法：收集35例MM患者资料,骨髓涂片及切片分别经瑞氏-吉姆萨和HE染色后,观察分析骨髓细胞形态及病理学特点。同时,取患者骨髓或外周血分别进行流式细胞术检测及相关实验室检查。结果：MM患者骨髓浆细胞不仅数量明显增多,且形态明显异常,切片中浆细胞分布类型包括塞实型16例（45.71%）,结节型14例（40.00%）和间质型5例（14.29%）。MM患者中出现血清LDH、β2-MG、Cr和BUN等检测指标升高的比例分别占80%、85.71%、62.86%和60%。MM患者浆细胞CD38、CD138均呈阳性表达,CD56、CD200、CD117和CD28阳性患者比例分别为65.71%、94.29%、60%和54.29%,CD20、CD81、CD33、CD27及CD13阳性患者比例分别为37.14%、42.86%、28.57%、57.14%和34.29%,而CD19及CD45阳性患者比例分别为22.86%和31.42%,且Igκ或Igλ链表达缺失呈单克隆增生。其中CD27和CD28的表达情况与MM患者预后密切相关,浆细胞CD27表达缺失及CD28阳性表达的患者5年总生存率较低（P < 0.05）。结论：MM患者骨髓中浆细胞免疫表型明显异常,其中CD27和CD28的表达与患者病情进展和临床预后具有显著相关性,因此免疫表型检测在MM患者临床诊断、治疗监测中具有重要意义。     

沙利度胺与利妥昔单抗协同抗骨髓瘤细胞作用的体外研究

背景与目的：利妥昔单抗（美罗华）的疗效与细胞膜上的CD20表达密度有关,如何提高多发性骨髓瘤细胞上CD20的表达、增加美罗华对多发性骨髓瘤的疗效,是目前临床尚未解决的问题。本文探讨沙利度胺是否能增强美罗华的抗骨髓瘤细胞作用及其可能的机制。方法：用10、50、75、100、150、200、300μg/ml的沙利度胺,0.5、1、2、4、8、12、16μg/ml的美罗华,上述7种浓度的沙利度胺联合16μg/ml的美罗华以及上述7种浓度的美罗华联合75μg/ml的沙利度胺分别加入18例初治和20例复发难治的多发性骨髓瘤患者瘤细胞甲基纤维素的半固体培养体系中,观察它们对瘤细胞集落形成的影响,并用流式细胞仪测定经上述7种浓度沙利度胺处理前后瘤细胞表达CD20的表达情况。结果：初治多发性骨髓瘤患者瘤细胞集落形成的抑制现象出现于：①单用浓度大于或等于75μg/ml沙利度胺或单用16μg/ml美罗华;②75μg/ml沙利度胺加或不加16μg/ml美罗华;③浓度大于或等于75μg/ml沙利度胺加或不加16μg/ml美罗华;复发难治多性骨髓瘤患者瘤细胞集落形成的抑制现象出现于：①75μg/ml沙利度胺加16μg/ml美罗华;②浓度大于或等于100μg/ml沙利度胺加或不加16μg/ml美罗华;浓度大于75μg/ml沙利度胺可增加复发难治多发性骨髓瘤细胞CD20抗原的表达。结论：体外沙利度胺能增强美罗华对多发性骨髓瘤细胞集落形成的抑制作用,这种增强作用与沙利度胺增加瘤细胞CD20抗原表达有关。     

Tetraspanin-induced death of myeloma cell lines is autophagic and involves increased UPR signalling

Background:

Multiple myeloma (MM) therapy is hindered by the interaction of the heterogeneous malignant plasma cells with their microenvironment and evolving drug resistance. We have previously shown that the membranal tetraspanins, CD81 and CD82, are under-expressed in MM cells and that their reintroduction causes massive non-apoptotic death. In this study, we aimed to characterise the tetraspanin-induced MM death.

Methods:

Multiple myeloma cell lines were transiently transfected with eGFP–CD81N1/CD82N1 fusion proteins and assessed for death mode by flow cytometry (propidium iodide, ZVAD-fmk, 3MA), activation of unfolded protein response (UPR), and autophagy (immunoblot, RT–PCR).

Results:

Cell death induced by CD81N1 and CD82N1 in MM cell lines was autophagic and involved endoplasmic reticulum (ER)-stress manifested by activation of UPR pathways, PERK (protein kinase-like ER kinase) and IRE1 (inositol-requiring 1). We also established the relative X-box binding protein 1 baseline expression levels in a panel of MM cell lines and their general dependence on autophagy for survival. Timeline of UPR cascades and cell fate supported our results.

Interpretation:

This is the first publication implicating tetraspanins in UPR signalling pathways, autophagy, and autophagic death. Integration of our findings with published data highlights the unifying dependence of MM cells on ER–Golgi homoeostasis, and underscores the potential of tetraspanin complexes and ER-stress as leverage for MM therapy.     

Flow cytometric differentiation of abnormal and normal plasma cells in the bone marrow in patients with multiple myeloma and its precursor diseases

Flow cytometric (FC) enumeration of abnormal plasma cells (APCs) for diagnosis and prognostication of plasma cell dyscrasias (PCD) is challenging. We studied antigen expression in normal plasma cells (NPC) (N = 34) and APC in a series of unselected PCD (N = 59). NPC subpopulations often demonstrated CD19(−), CD20(+), CD45(−) or dim and CD56(+), an immunophenotype observed in PCD. However abnormal CD81 was only observed in APCs (APC detection sensitivity 95%; specificity 100%). We evaluated differences in antigen expression patterns among MGUS (N = 14), SMM (N = 35) and MM (N = 10), finding the combination of CD45 and CD56 helpful in differentiating MGUS from SMM and MM (p = 0.0002).     

达雷木单抗治疗多发性骨髓瘤最新进展研究

多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是一种克隆性浆细胞紊乱所致的恶性疾病,表现为贫血、高钙血症、肾功能衰竭和溶骨性病变等。在过去的十年中,随着免疫调节药物（IMiD）和蛋白酶体抑制剂（PI）不断应用,MM的治疗取得了重要的进展,但其死亡率及复发率仍然很高,故仍需探索新的药物及最佳治疗方案。达雷木单抗（daratumumab,DARA）作为一种以CD38为靶点的IgG1κ型全人源单克隆抗体逐渐得到关注和认可,DARA针对不同的患者亚群都获得了显著而持久的疗效,且疗效随着随访时间的延长而趋明显。     

多发性骨髓瘤干细胞研究进展

肿瘤干细胞具有高度增殖与自我更新及多向分化的潜能,与肿瘤的复发和难以根治密切相关.在多发性骨髓瘤中亦存在这样一小部分骨髓瘤干细胞,积极探索其起源、免疫分型、信号转导机制、耐药性及其他生物学特性对多发性骨髓瘤的根治有重要意义.     

多发性骨髓瘤患者OPN、CD44v6的表达与病情进展的关系

背景与目的:骨桥蛋白(osteopontin,OPN)与其受体--CD44受体和整合素受体结合后,参与骨重建、骨质重吸收、血管重塑、癌细胞浸润和转移等过程.为此本研究检测了多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者的OPN和变异的CD44受体(CD44v6)水平,以探讨其与MM病情进展的关系.方法:32例MM患者,分为A组(包括初发和复发病例)和B组(化疗后病情稳定)2组,同时收集外伤骨折或非肿瘤良性贫血患者15例作为对照.采用酶链免疫吸附试验(ELISA)分别检测了患者和对照组的单个核细胞及骨髓基质细胞(bone marrow mononuclear eells,BMSCs)培养上清液的0PN、CD44v6水平并进行相关分析.结果:A组(19例)患者的0PN表达水平显著高于B组(13例)和对照组患者(P<0.05).对A组中的14例患者和B组中的10例患者进行了CD44v6水平检测,其结果A组的CD44v6表达水平显著高于B组和对照组患者(P<0.05),B组的CD44v6水平显著高于对照组(P<0.05);0PN水平与CD44v6(r=0.52,P=0.000)、恶性浆细胞数(r=0.74,P=0.000)、M蛋白水平(r=0.53,P=0.014)、血β2-MG水平(r=0.62,P=0.002)均呈正相关.结论:0PN和CD44v6水平升高与删的发生和病情进展有关;可能与MM的肿瘤负荷、疾病阶段和肿瘤浸润有关.     

Enhancement of myeloma development mediated though myeloma cell-Th2 cell interactions after microbial antigen presentation by myeloma cells and DCs

Microbial agents are regarded as a potential cause of tumors, but their direct effects on tumors, such as myeloma, are not well studied. Our studies demonstrated that expression of HLA-DR and CD40 on the myeloma cell membrane surface is upregulated by interferon-γ and/or microbial antigens (Ags). Unlike prior studies, our study showed that Th2 cells cannot promote myeloma growth directly. However, Bacillus Calmette-Guerin Vaccine (BCGV)-specific Th2 cells stimulated by BCGV-loaded dendritic cells (DCs) promoted myeloma clonogenicity directly when the myeloma cells expressed major histocompatibility complex Class-II molecules (MHC-II) and took up BCGV Ag. B-cell lymphoma 6 (Bcl-6) protein expression and the proportion of HLA-DR(+) or CD40(+) cells were higher in colonies of Th2 cell-stimulated myeloma cells. Furthermore, anti-HLA-DR or neutralizing CD40 antibody could prevent this increase in Bcl-6 expression and colony number. These results indicate that microbes and microbial Ag-specific Th2 cells may directly impact the biology of myeloma and contribute to tumor progression. Activation may be limited to MHC-II(+) myeloma cells that retain B cell and stem cell characteristics. Taken together, our data suggest that factors involved in microbial Ag presentation, such as DCs, Th2 cells and so on, are potential targets for myeloma therapeutic intervention.     

基于潜在类别分析的不同CD73多发性骨髓瘤患者预后复发的影响因素分布特征研究

目的 探究多发性骨髓瘤(MM)患者复发的影响因素,并分析不同CD73⁺表达率患者复发影响因素的分布特征。方法 选择2017年2月—2021年2月我院收治的108例MM患者作为研究对象,根据治疗后1年的复发情况分为复发组和未复发组。筛选影响患者复发的因素;采用聚类分析和潜在类别分析方法分析不同CD73患者复发影响因素的分布特征。结果 108例患者的复发率为23.15%(25/108);男性、体质指数(BMI)<20 kg/m²、国际分期系统(ISS)分期Ⅲ期、高危遗传学风险、β2-微球蛋白(β2-MG)≥3.5 mg/L、p53基因缺失、CD73⁺均是导致患者复发的危险因素(P<0.05),维持治疗是保护因素(P<0.05)。聚类分析结果显示,复发风险呈明显聚集性,可将患者分为复发高风险组(CD73⁺表达率>40%)和低风险组(CD73⁺表达率<40%),复发率分别为37.50%(15/40)和14.71%(10/68),差异具有统计学意义(P<...     

慢病毒载体介导SPROUTY2基因过表达对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖作用的影响

目的 探讨慢病毒表达载体介导的人SPROUTY2基因过表达对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖、克隆性生长和细胞外调节蛋白激酶（ERK）抑制剂敏感性等生物学特性的影响.方法 克隆人SPROUTY2基因,构建SPROUTY2基因与绿色荧光蛋白（GFP）的重组慢病毒表达载体LV-S-GFP及对照载体LV-GFP.脂质体法包装病毒;优化慢病毒感染RPMI8226细胞的条件;荧光显微镜观察GFP表达;反转录聚合酶链反应（PCR）、蛋白质印迹法（Western blot）方法分别检测目的基因及其蛋白的表达,CCK-8法检测RPMI8226细胞增殖及其对ERK 1 /2抑制剂AS703026敏感性的影响,软琼脂克隆形成实验检测细胞的克隆性生长能力.结果 成功地构建了共表达SPROUTY2基因和报告GFP的高滴度慢病毒颗粒.LV-S-GFP实验组RPMI8226细胞中SPROUTY2的表达明显高于LV-GFP对照组,灰度值分别为（230.85±32.12）％和（140.35±36.62）％（P＜ 0.05）.过表达SPROUTY2基因对骨髓瘤细胞增殖具有抑制作用,并可以增强ERK1/2抑制剂AS703026对RPMI8226细胞的杀伤作用.过表达SPROUTY2基因可明显抑制RPMI8226细胞的克隆性生长.结论 慢病毒载体系统可高效介导SPROUTY2基因在RPMI8226细胞中的表达,抑制骨髓瘤细胞增殖及克隆性生长,并能够提高其对ERK抑制剂的敏感性.     

miRNA-181a对多发性骨髓瘤细胞生物学特性影响的初步研究

目的 探讨miRNA-181a(miR-181a)在多发性骨髓瘤(MM)患者中的表达情况及其对MM细胞生物学特性的影响.方法 应用免疫磁珠筛选的方法分离并纯化25例初治、复发难治MM患者及10例非恶性血液病患者骨髓CD138+细胞,应用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-181a表达情况.同时检测RPMI 8226、H929及U266三种MM细胞株中miR-181a的表达.应用miR-181a抑制剂及激动剂观察下调和上调miR-181a表达对MM细胞生物学特性的影响,并对miR-181a进行靶基因预测.结果 与非恶性血液病患者相比,MM患者CD138+细胞中miR-181a表达上调.对MM细胞株的观察发现,与非恶性血液病患者骨髓CD138+细胞相比,RPMI 8226及U266细胞株miR-181a高表达,而H929细胞株则低表达.相比对照组,应用100 nmol/L miR-181a抑制剂下调miR-181a后,U266细胞的增殖活力在24、48及72 h分别为(50.5±4.1)%、(52.3±2.2)%和(69.5±4.3)%,低于对照组的(67.1±3.3)%、(71.5±3.6)%和(78.1±5.4)%(均P<0.05),提示细胞增殖受抑.而应用100 nmol/L miR-181a激动剂上调miR-181a后,H929细胞在24、48 h时的增殖活力分别为(38.5±3.6)%和(82.2±6.9)%,高于对照组的(21.2±2.4)%和(61.3±5.4)%(均P<0.01),提示细胞增殖增强.细胞周期分析提示,miR-181a抑制剂使U266细胞周期阻滞在G0/G1期.细胞药敏实验结果显示,多柔比星、紫杉醇及5-氟尿嘧啶作用后,与药物单独处理的细胞相比,miR-181a抑制剂下调U266细胞miR-181a表达的细胞增殖活力下降.在48 h和72 h的吸光度(A)值显著低于对照组.细胞迁移实验显示,miR-181a抑制剂下调miR-181a能抑制U266细胞的迁移能力,实验组细胞的迁移比例为(62±10)%,低于对照组的(89±12)%(P<0.05),而miR-181a激动剂则能提高H929细胞的迁移能力,实验组细胞的迁移比例[(242±9)%]高于对照组的(98±8)%(P<0.01).结论 MM细胞高表达miR-181a.miR-181a的高表达可能会促进MM细胞的增殖、转移及耐药,可能与MM患者预后有关,是MM预后评估一个重要的候选生物标志物.对miR-181a靶基因进行进一步预测,同时应用基因缄默的策略可能会改善MM患者的预后.     

沙利度胺联合VAD方案治疗多发性骨髓瘤的疗效及对患者免疫功能的影响

目的 研究沙利度胺联合VAD方案治疗多发性骨髓瘤的疗效及对患者免疫功能的影响.方法 选取74例多发性骨髓瘤患者,根据分层随机分组法分为观察组和对照组,每组各37例.对照组采取VAD方案进行治疗,观察组在此基础上加以沙利度胺进行治疗.分析两组患者治疗前和治疗4个周期后免疫功能、骨髓瘤细胞、β2-微球蛋白、M蛋白、血红蛋白指标变化,比较两组患者的临床疗效和不良反应.结果 治疗4个周期后,观察组的CD4+CD25+、IL-6、TGF-β指标明显低于对照组,INF-γ/IL-10指标高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05).治疗4个周期后,观察组的骨髓瘤细胞、β2-微球蛋白、M蛋白指标明显低于对照组,血红蛋白明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01).观察组总有效率高于对照组(P<0.05).观察组和对照组的皮疹、感染、便秘、嗜睡等不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 在治疗多发性骨髓瘤中采取沙利度胺联合VAD方案能有效改善患者的免疫功能,临床疗效较好,不良反应属于轻度型,患者均可耐受.     

多发性骨髓瘤患者CD200的表达及与预后的关系

目的:探讨CD200在多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）中的表达及其与预后的关系。方法:选取初诊的MM患者71例,利用流式细胞术（FCM）检测MM细胞中CD200的表达,检测了其中40例患者外周血T细胞亚群百分比。收集受试者临床资料,通过随访获取总生存期（OS）,采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线、Cox比例风险回归分析CD200表达与MM患者预后的关系。结果:71例MM患者中,51例（71.8%）阳性表达CD200,20例（28.2%）不表达CD200。CD200+MM患者CD4+T百分比和CD4/CD8比值低于CD200-患者（P<0.05）。CD200-MM患者中位总生存期（OS）为26.0（95%CI 18.7~33.2）个月,CD200+患者中位OS时间未达到（χ2=4.210,P=0.040）。CD200+MM患者1年和2年的OS率为66.7%和42.5%,CD200-MM患者1年和2年的OS率为72.9%和60.6%。Cox回归风险模型分析结果显示MM患者年龄＞65岁［HR=4.145（95%CI 1.252~13.728）,P=0.020］、CD200阳性［HR=2.617（95%CI 1.044~6.561）,P=0.040］是独立于其他临床指标的预后危险因素。结论:MM患者 CD200表达存在异质性,CD200阳性表达是MM患者OS的不良预后因素。     

浆细胞骨髓瘤CD56表达的临床病理及预后意义

目的CD56在浆细胞骨髓瘤(PCM)中的表达及其临床病理和预后提示意义.方法选取浆细胞骨髓瘤22例为研究对象,同时选取原发的髓外浆细胞瘤(EMP)3例和反应性浆细胞增生5例进行对比研究.S-P免疫组化染色方法检测CD56在不同病变中的表达.结果反应性浆细胞增生及原发的EMP中均无CD56表达,而9例(41%)PCM CD56+.CD56+患者的整体生存时间和无疾病生存时间长于CD56-者(1og-rank检验,P＜0.05).CD56表达与患者年龄、临床分期和组织学分级均无相关性(P＜0.05).结论CD56是PCM较常见、较特异的一个免疫表型,但不能将其作为确定PCM中具独特临床病理学特点亚群的标记,只是PCM的一个预后提示因子.此外,CD56可能是鉴别原发EMP和PCM髓外浸润的一个有意义的标记.     

As2O3对多发性骨髓瘤细胞的细胞毒作用的机制研究

背景与目的:多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是恶性浆细胞疾病,目前仍难以治愈;已有研究证明三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)在体外能够抑制骨髓瘤细胞增殖并诱导其凋亡.本研究拟探讨As2O3对多发性骨髓瘤细胞的可能作用机制.方法:采用MTr法检测As2O3对5株骨髓瘤细胞U266、SKO-007、LP-1、HS-Sultan和KM3的抑制作用,求出其IC50,同时研究维生素K3(vitamine K3,VK3)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine,NAC)和还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)对As2O3的协同或拮抗作用;利用光学比色法测定不同浓度As2O3作用后的5株骨髓瘤细胞以及As2O3与VK3、NAC或外源性GSH共同作用后的U266细胞的GSH含量,对细胞GSH含量与IC50进行相关性分析.结果:As2O3对5株骨髓瘤细胞均有增殖抑制作用,但其敏感性不同,细胞内GSH含量与其IC50正相关(r=0.87,P＜0.05);氧化剂VK3与As2O3有明显协同作用,抗氧化剂NAC和GSH对As2O3具有拮抗作用.结论:As2O3可能是通过与细胞内的含巯基化合物结合,降低细胞内GSH含量,从而诱导骨髓瘤细胞凋亡.     

The frequency of T regulatory cells modulates the survival of multiple myeloma patients: detailed characterisation of immune status in multiple myeloma

Background:

Multiple myeloma (MM) is an immunoproliferative disease characterised by the uncontrolled proliferation of plasma cells, which is accompanied by defects in the immune system.

Methods:

This study aimed to characterise the frequency of T regulatory cells (Tregs), dendritic cells (DCs) as well as sub-populations of T cells bearing regulatory properties like CD4⁺GITR⁺, CD4⁺CD62L⁺, CD3⁺TCRγδ⁺ along with the concentrations of IL-10, TGFβ, IL-6 in 66 patients with MM. Subsequently, the influence of therapy on those components of immune system was assessed.

Results:

The percentage of both myeloid and plasmacytoid DC was lower in MM compared with control group while Treg (CD4⁺CD25^highFOXP3⁺) frequencies were significantly higher in MM patients compared with healthy control (6.16% vs 0.05%, respectively). Also, the percentages of CD4⁺GITR⁺, CD4⁺CD62L⁺ were increased compared with healthy volunteers. We found that patients with higher percentages of Treg live shorter (median overall survival 21 months vs not-reached, P=0.013).

Conclusion:

This study identifies several abnormalities of immune system in MM, which only partly could be normalised after successful therapy. The dysfunction of immune system such as decreased antigen presentation along with increased frequencies of suppressive cells and cytokines might facilitate progression of the disease and infectious complications limiting survival of MM patients.