Fas/FasL基因转染联合顺铂对直肠癌细胞杀伤作用的研究

目的探讨Fas/FasL基因转染联合顺铂对直肠癌细胞的杀伤作用。方法构建pcDNA3.1-Fas/FasL真核表达载体,将人Fas/FasL基因通过脂质体导入直肠癌8348细胞中,并利用RT-PCR方法检测直肠癌8348细胞的Fas/FasL基因mRNA表达。用MTT法分析顺铂对转染前后的8348细胞抑制增殖和诱导凋亡的能力。结果Fas/FasL基因转染可明显增强直肠癌8348细胞的Fas/FasL表达。分别加入不同浓度顺铂(1、5、10、20、40μg/ml),Fas转染组8348细胞抑制率分别为47.2%、51.8%、57.2%、65.4%、71.0%;后者细胞抑制率分别为29.6%、33.0%、37.8%、41.4%、47.0%,其差异有显著性意义(t=15.33,P<0.01);FasL转染组8348细胞抑制率分别为11.0%、25.4%、31.2%、37.8%、42.4%;对照组8348细胞抑制率分别为26.1%、34.4%、37.6%、42.9%、53.2%,其差异有显著性意义(t=4.43,P<0.05)。结论转染的Fas/FasL基因可显著上调直肠癌8348细胞的Fas/FasL表达;Fas基因转染联合顺铂对直肠癌细胞有更强的杀伤作用;FasL基因转染可减弱顺铂对8348细胞的细胞毒作用,因此为直肠癌的基因治疗和化疗提供了理论依据。     

顺铂联合胞嘧啶脱氨酶自杀基因对直肠癌细胞杀伤作用的研究

目的探讨顺铂联合胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因对直肠腺癌细胞8348的杀伤作用。方法以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,观察在顺铂作用下GFP基因对8348细胞的转染效率;用克隆形成试验观察顺铂对CD基因转染效率的影响;同时用四甲基偶氮唑盐(MTT)试验检测顺铂联合CD/5-氟胞嘧啶(5-FC)对8348细胞的杀伤作用。结果顺铂提高质粒对8348细胞的转染效率26倍。对腺癌细胞的杀伤效率:单纯转染CD基因组为14.9%;IC50的氟尿嘧啶(5-FU)联合CD基因组为54.9%;IC50的顺铂联合CD基因组为88.5%,与其他两组相比,对癌细胞杀伤效率明显增强(P<0.01)。结论顺铂联合CD自杀基因能更有效地杀伤直肠腺癌细胞,可成为治疗直肠癌术后复发及转移的一种有效的方法。     

FasL cDNA转染对直肠癌细胞顺铂耐药性的影响

目的:探讨FasLcDNA转染和表达对直肠癌细胞耐药性的影响。方法:用RT-PCR方法克隆人FasL全长cDNA,构建pcDNA3.1-FasL真核表达载体,用脂质体法转染HR-8348人直肠癌细胞,采用MTT法检测顺铂对转染和未转染直肠癌细胞的生长抑制率。结果:DNA测序证实克隆FasLcDNA898bp与GeneBank序列完全一致。构建真核表达载体转染HR-8348细胞后,FasLmRNA表达明显增强。在不同浓度顺铂(1、5、10、20、40mg/L)的作用下,FasL转染组直肠癌细胞抑制率分别为11.0%、25.4%、31.2%、37.8%、42.4%:对照组癌细胞抑制率分别为26.1%、34.4%、37.6%、42.9%、53.2%,其差异有显著性意义(t=4.43,P<0.05)。结论:FasL转染HR-8348细胞可增强癌细胞的耐药性,减弱顺铂对HR-8348细胞的杀伤作用。     

Fas基因转染对直肠癌细胞生物学行为影响的研究

目的：探讨Fas基因转染对直肠癌细胞生物学行为的影响。方法：以正常人外周血单个核细胞（PBMC）为模板，通过RT－PCR方法扩增出Fas全长cDNA，转染人直肠癌细胞HR－8348，检测Fas基因表达，观察细胞生长状态，采用MTT法观察癌细胞对中1芗反应及细胞存活率。采用H3342释放法检测PBMC对癌细胞的杀伤活性，结果，未转染的HR－8348细胞Fas基因表达为阴性，转染Fas后HR－8348细胞Fas表达阳性，两组细胞形态和生长状态无显差异，分别加入化疗药物5－Fu、卡铂，检测细胞存活率，在相同药物浓度下，两组细胞存活率有显性差异（t=4．73，3．84，P＜0．01）。Fas转染组癌细胞存活率低不转染组，Fas表达阳性癌细胞对5－Fu、卡铂的敏感性增强。PBMC对Fas转染组HR－8348细胞的杀伤活性为56％，对未转染组的杀伤活性为21％，两组有显性差异（X^2＝20．73，P＜0．01），PBMC对Fas阳性癌细胞杀活性明显高于对照组癌细胞。结论：转染Fas可提高癌细胞化疗药的敏感性，增强药物对癌细胞的杀伤作用，并促进机体免疫细胞的杀伤活性。     

PTEN基因联合奥沙利铂对胆管癌细胞生长抑制的研究

目的探讨脂质体介导PTEN基因转染人胆管癌细胞（QBC939）,联合化疗药物奥沙利铂（L-OHP）,分别进行人胆管癌细胞体外培养和体内接种生长,观察分析该基因对胆管癌细胞生长的抑制情况,探索人类胆管癌的生物治疗的可行性和方法.方法将携带PTEN基因的真核表达载体pBP-PTEN和不含该基因的空载体.转胆管癌QBC939细胞,嘌呤霉素抗性筛选克隆、扩增培养.绘制细胞生长曲线及MTT细胞活性观察;利用免疫组化检测转染前后PTEN阳性表达率;透射电镜扫描观察转染前后及联合奥沙利铂后细胞的超微结构变化;流式细胞分析细胞的周期变化和细胞凋亡情况;体外细胞侵袭力抑制试验;裸鼠体内肿瘤生长,病理学及电镜扫描的观测.结果PTEN基因转染后QBC939细胞稳定表达,阳性表达率升高（P＜0.05）;肿瘤细胞活性下降（P＜0.05）,细胞周期G1～S期抑制,细胞凋亡率增加（P＜0.01）;透射电镜细胞较成熟、分化好;细胞侵袭力明显抑制（P＜0.05）;裸鼠体内肿瘤未转染组生长早,加入奥沙利铂后生长受抑制（P＜0.05）,病理证实为腺癌.结论1.脂质体成功将PTEN基因转染人胆管癌QBC939细胞,并稳定表达.2.PTEN基因转染后细胞生长速度无明显变化;MTT实验活性细胞数有所下降.3.转PTEN基因后的胆管癌细胞超微结构变化显示线粒体增多,细胞较成熟、分化好;流式细胞议分析,细胞周期G1期被抑制,细胞凋亡多,侵袭力受到抑制;4.接种转PTEN基因裸鼠的体内成瘤显著抑制;6.转基因的生物治疗联合奥沙利铂（L-OHP）对人胆管癌细胞生长具有显著的抑制作用.     

顺铂杀伤原代胃癌细胞的体内外实验研究

目的 评价顺铂对原代胃癌细胞的体内外杀伤效应。方法 采用纯化后的人体新鲜胃癌细胞,用台盼蓝染色法和四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法检测经顺铂作用后细胞活力及代谢活性的变化;另用末端脱氧核苷酸转移酶法 (TdT法 )和正常免疫小鼠肾包膜下种植法 (SRC法 )分别检测顺铂体外促凋亡效应及体内抑瘤率。结果 经顺铂作用后,肿瘤细胞出现明显的形态学改变和代谢活性的下降;不同个体肿瘤细胞对顺铂敏感性不同,低分化胃癌细胞较高分化者更敏感（ 40.25％比 34.26％）; 10倍血药浓度下顺铂对肿瘤细胞的抑制率高于单倍浓度（ 40.10％比 38.45％）。 经顺铂作用后,原代胃癌细胞凋亡率增加,为 32.12％。顺铂还能明显抑制体内移植瘤的生长。结论 顺铂可能通过包括诱导凋亡在内的多种途径杀伤原代胃癌细胞,尤对低分化者显示了明显的肿瘤杀伤效应。     

Fas基因转染对直肠癌细胞生物学行为影响的研究

目的　探讨Fas基因转染对直肠癌细胞生物学行为的影响。方法　以正常人外周血单个核细胞 (PBMC)为模板 ,通过RT -PCR方法扩增出Fas全长cDNA ,转染人直肠癌细胞HR - 8348,检测Fas基因表达 ,观察细胞生长状态。采用MTT法观察癌细胞对化疗药物反应及细胞存活率。采用H33342释放法检测PBMC对癌细胞的杀伤活性。结果　未转染的HR - 8348细胞Fas基因表达为阴性 ,转染Fas后HR - 8348细胞Fas表达阳性。两组细胞形态和生长状态无显著性差异。分别加入化疗药物 5 -Fu、卡铂 ,检测细胞存活率。在相同药物浓度下 ,两组细胞存活率有显著性差异 (t =4 .73,3.84 ,P <0 .0 1)。Fas转染组癌细胞存活率低于未转染组 ,Fas表达阳性癌细胞对 5 -Fu、卡铂的敏感性增强。PBMC对Fas转染组HR - 8348细胞的杀伤活性为 5 6 % ,对未转染组的杀伤活性为 2 1% ,两组有显著性差异 (χ2 =2 0 .73,P <0 .0 1) ,PBMC对Fas阳性癌细胞杀伤活性明显高于对照组癌细胞。结论　转染Fas可提高癌细胞对化疗药物的敏感性 ,增强药物对癌细胞的杀伤作用。并促进机体免疫细胞的杀伤活性     

顺铂杀伤原代胃癌细胞的体内外实验研究

目的 评价顺铂对原代胃癌细胞的体内外杀伤效应。方法 采用纯化的人体新鲜胃癌细胞，用台盼蓝梁色法和四甲基偶氮唑蓝（ＭＴＴ）法检测经顺铂作用后细胞活力及代谢活性的变化；另用末端脱氧核苷酸转移酶法（ＴｄＴ法）和正常免疫小鼠肾包膜下种植法（ＳＲＣ法）分别检测顺铂体外促凋亡效应及体内抑瘤率，结果 经顺铂作用后，肿瘤细胞出现明显的形态学改变和代谢活性的下降；不同个体肿瘤细胞对顺铂敏感性不同，低分化胃癌细胞较高分化更敏感（４０．２５％比３４．２６％）；１０倍血药深度下喘铂对肿瘤细胞的抑制率高于单倍浓度（４０．１０％比３８．４５％），经顺铂作用后，原代胃癌细胞凋亡率增加，不３２．１２％，顺铂还能明显抑制体内移植瘤的生长。结论 顺铂可能通过包括诱导调亡在内的多种途径伤原代胃癌细胞，尤对低分化显示了明显的肿瘤杀伤效应。     

脂质体转染CD基因联合放射线对人直肠癌荷瘤裸鼠体内抗癌作用的研究

目的　探讨脂质体反复转染CD基因联合放射线对人直肠癌细胞荷瘤鼠体内的抗癌效果 ,为临床治疗直肠癌提供理论依据。方法　构建PXJ4 1/CD载体并进行测序证实 ,制备人直肠癌细胞荷瘤鼠 ,待瘤体长至长径达 0 5cm后 ,设实验组应用脂质体于治疗的当日及第 4、8、12天反复转染 ,于当日起 2Gy/day连续照射患肢 15d ,第 3天起 5 FC 80 0mg/kg/day腹腔注射共 12d ,另设单纯放射组、单纯CD/ 5 FC治疗组、空白对照组 ,观察荷瘤裸鼠的肿瘤生长曲线 ,瘤体积抑制率和瘤重抑制率。结果　荷瘤裸鼠肿瘤生长曲线显示 :实验组肿瘤生长曲线平缓 ,治疗效果显著 ,瘤体积抑制率平均为 81 5 % ,瘤重抑制率平均为 78 7% ,与其它 3组比较差异有显著性意义 (χ2 =2 87 86 ,P <0 0 1)。病理学检查示肿瘤细胞较对照组明显减少。结论　脂质体反复转染CD基因联合放射线治疗直肠癌荷瘤鼠 ,二者可产生协同作用 ,比单纯放疗或单纯CD/ 5 FC有更显著的抗癌疗效     

腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 探讨腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶（CD）基因转染和CD/5-FC对直肠癌细胞的杀伤作用。方法 用重组腺病毒介导外源CD基因转移到人直肠癌细胞株HR-8348,通过检测腺病毒的转导效率,CD基因表达,以及集落形成实验,细胞存活率测定,裸鼠移植癌治疗实验,观察分析CD/5-FC对癌细胞的杀伤作用,结果 重组腺病毒介导CD基因转染,在癌细胞中得到高效表达。CD/5-FC系统对转染含CD重组腺病毒HR-8348细胞的集落形成,细胞生长均有明显的抑制作用,而对无CD基因转染癌细胞无影响,在转染和未转染CD基因的HR-8348混合体系中,CD/5-FC除了杀伤转染CD基因的癌细胞外,对周围的无CD转染癌细胞也有明显的杀伤作用。表现出很强的“旁观者效应”。裸鼠皮下移植癌治疗实验结果表明,CD/5-FC对HR-8348实体癌生长抑制率为71.5%。结论 CD/5-FC对腺病毒介导CD基因转染的直肠癌细胞有很强的杀伤作用和显著的“旁观者效应”。     

FasL逆转录病毒转移体系的建立及其在肝癌细胞中的表达

目的　研究Fas/FasL系统的生物学功能,探讨转FasL基因治疗肿瘤的可行性。方法将大鼠FasL全长cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,获得FasL正向单拷贝插入子pLXSN/FasL     

超声辐照参数对体外基因转染效果的影响

目的探讨超声辐照参数对体外基因转染效果的影响及最佳转染条件。方法将293T细胞种植于24孔板内,24h后更换为转染液进行超声辐照,EGFP质粒浓度为1mg/ml,每孔加入15μg;超声强度分为1.5、2.0、2.5W/cm2,辐照时间分为30、45、60s,微泡浓度分为20%、30%、40%;每个参数相互组合并重复4次。转染后72h于荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光蛋白的表达,以流式细胞仪检测荧光细胞比例,CCK-8检测细胞存活率,计算转染效率。结果超声声强、辐照时间、微泡浓度均对转染效率有显著影响。辐照条件为2.0 W/cm2、辐照时间45s、微泡浓30%时转染效率最高,可达(35.25±1.40)%。结论超声辐照参数共同影响转染效果,低条件下相互协同,高条件下相互抑制,选择合适的辐照参数是超声介导体外基因转染的重要因素。     

转染重组人骨形态发生蛋白-7基因对骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的 观察重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)基因转染骨髓基质细胞(BMSCs)后的稳定表达及表达产物对BMSCs生物学行为的影响。方法利用脂质体介导法将rhBMP．7基因转染BMSCs，以G418筛选出阳性克隆并扩大培养，用免疫组织化学链霉抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法检测转基因细胞的稳定表达；转染48h后，用转基因细胞的培养液上清刺激正常培养的BMSCs，利用^3H标记的胞腺嘧啶氧核苷(^3H-TdR)掺入法、Na2^35SO4掺入法以及氯胺T法检测基因表达产物对BMSCs增殖、合成蛋白多糖以及胶原的影响。结果 转基因细胞4周时仍能表达外源性基因；基因表达产物能明显促进BMSCs的增殖以及蛋白多糖和胶原的合成。结论 rhBMP-7基因转染BMSCs后可获得稳定表达，且基因表达产物能促进BMSCs增殖。诱导其向软骨细胞分化并增强其生物学活性。     

转Fas基因对膀胱癌细胞的作用

目的　探讨Fas基因转染对膀胱癌细胞的作用。　方法　将人FascDNA通过脂质体导入膀胱癌细胞EJ中 ,并利用Northernblot、原位杂交、流式细胞术检测细胞的FasmRNA和分子表达。用流式细胞仪、DNA梯形带和MTT法分析顺铂对转染前后的EJ细胞抑制增殖和诱导凋亡的能力。　结果　Fas基因转染可明显增强膀胱癌细胞EJ的Fas表达 ,顺铂对转染后的EJ细胞抑制细胞增殖和诱导凋亡的能力明显增强。　结论　转染的Fas基因可显著上调膀胱癌细胞EJ的Fas表达 ,促进细胞凋亡 ,联合应用Fas基因转染和顺铂可获得协同的细胞毒作用     

WWOX表达对胆管癌QBC939细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨含有WW结构域的氧化还原酶基因(WWOX)表达对胆管癌QBC939细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 用脂质体转染法将WWOX重组真核表达质粒转染QBC939细胞;采用荧光定量逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)和Westem blot法鉴定WWOX在QBC939细胞中的表达;流式细胞仪(FCM)法检测转染前后各细胞凋亡率的变化;JC-l染色法检测细胞线粒体膜电位(△Ψm)变化;荧光定量RT-PCR和Western blot法检测胆管癌细胞bcl-2表达的变化;将未转染和转染空质粒的细胞作为对照组接种到裸鼠皮下以检测荷瘤,TUNEL方法原位检测移植瘤的凋亡.结果 建立了稳定表达WWOX基因的QBC939/WWOX细胞株,mRNA及蛋白表达明显增加.FCM显示QBC939/WWOX组的细胞凋亡率明显增高[(1.24±0.35)％比(1.73±0.48)％比(21.40±2.35)％,P＜O.01],JC-l显示转染组的线粒体膜电位下降[(4.27±0.64)％比(4.96±0.52)％比(28.60±3.94)％,P＜O.01],bcl-2 mRNA及蛋白的表达均显著降低(P＜0.05).转染组的皮下肿瘤较对照组生长速度明显减慢(P＜0.05),TUNEL实验证实转染组的皮下肿瘤凋亡指数为(13.6±1.5)％,较对照组明显增高,差异有统计学意义(P＜0.O1).结论 WWOX基因能促进胆管癌细胞的凋亡,其机制可能与下调bcl-2的表达,激活线粒体凋亡通路有关.     

FasL基因表达对缺氧状态下直肠癌细胞增殖凋亡的影响

目的探讨直肠癌侵袭转移过程中FasL基因表达对细胞增殖凋亡的影响。方法采用北京军区总医院普通外科实验室构建的4组不同侵袭力的人直肠癌HR-8348细胞亚型HR-8348B、HR-8348L、HR-8348F和HR-8348As,并用化学缺氧法构建上述4组细胞的缺氧12h模型,以Western印迹法验证各组细胞内FasL蛋白的表达水平和缺氧状态下细胞内FasL蛋白的表达,流式细胞仪测定细胞周期分布并计算细胞增殖指数,四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定细胞增殖能力改变并计算细胞抑制率,末端标记法（TUNEL）测定细胞凋亡状况。结果Western印迹显示FasL蛋白于40000处显色。常氧条件下HR-8348F细胞内FasL的表达水平显著高于HR-8348B、HR-8348L和HR-8348As（F=361.149。P〈0.01）;缺氧12h时各组细胞均生长良好,形态较常氧状态皱缩;HR-834F,细胞内FasL的表达水平仍显著高于其他3组（F=278.766,P〈0.01）,但其自身常氧与缺氧状态下FasL的水平差异无统计学意义（t=1.762,P〉0.05）。缺氧12h后各组细胞增殖均受到抑制,HR-8348F细胞的增殖指数（60.43±3.72）显著高于HR-8348B（40.01±3.30）、HR-8348L（41.30±4.06）和HR-8348As（35.87±4.39）（F=39.477,P〈0.01）,增殖抑制率（17.30±1.98）和凋亡指数（13.10±1.04）显著低于HR-8348B（33.70±4.33和21.60±1.31）、HR-8348L（34.20±3.92和20.10±1.15）、HR-8348As（38.00±4.55和23.90±1.23）细胞（F分别为28.811和76.462,P〈0.01）。结论缺氧环境中,直肠癌细胞FasL表达增强可导致细胞增殖加速、凋亡减少和侵袭能力增强。促进细胞对微环境缺氧的耐受。     

重组腺病毒介导Fas基因转染瘢痕疙瘩细胞并诱导其凋亡的实验研究

目的　制备含人Fas基因的重组腺病毒 ,感染瘢痕疙瘩成纤维细胞后 ,使其稳定高效地表达以替换原有无功能的Fas蛋白 ,并恢复正常的重建后Fas信号传导通道。方法　Fas基因自PcDNA3 1 Fas质粒中切取 ,应用PDC315载体系统构建携带Fas基因的重组腺病毒 ,感染瘢痕疙瘩成纤维细胞 ,检测Fas蛋白的表达及功能。结果　成功地构建了携带Fas基因的重组腺病毒 ,感染后瘢痕疙瘩成纤维细胞能稳定表达的有功能的Fas蛋白。结论　利用重组腺病毒转染可以重建被阻断的瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas死亡信号传导通道 ,并再次估证了Fas基因突变与瘢痕疙瘩之间的联系 ,为瘢痕疙瘩基因治疗展示了一条新途径