骨组织工程材料的表面修饰和细胞粘附

由于人工合成高分子聚合物材料亲水性差 ,细胞吸附力差 ,在材料表面包被、铰链某种蛋白或短肽则有利于细胞在材料上的粘附 ,并影响细胞的增殖和分化。本文重点介绍了与成骨细胞有关的蛋白或短肽 ,并描述了细胞在材料上的粘附过程     

结合RGD肽的聚酯材料表面粘附内皮细胞的抗剪切力研究

精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)是许多粘附蛋白的高度保守氨基酸序列.生物材料表面结合RGD肽有助于内皮细胞在材料上的粘附、迁移和增殖.本研究在体外流动条件下观察结合RGD肽或纤维粘连蛋白的聚酯材料表面粘附内皮细胞的抗剪切能力,并通过观察肌动蛋白和踝蛋白的表达初步探讨影响细胞粘附稳定性的机制.结果显示材料表面结合RGD或纤维粘连蛋白可以增加细胞的粘附强度,提高抗剪切能力;而RGD和纤维粘连蛋白导致的细胞抗剪切能力增加可能与细胞内肌动蛋白和踝蛋白的表达增加有关.     

RGD肽对内皮细胞在聚酯材料表面粘附、增殖的影响

RGD是许多粘附蛋白结构中的高度保守序列，与细胞在生物材料表面的粘附、增殖密切相关。本研究在聚酯薄膜表面分别预衬纤维粘连蛋白和共价接枝RGD三肽，然后在不同聚酯材料上种植体外培养的人脐静脉内皮细胞，结果显示RGD可明显促进细胞在材料表面的粘附和增殖，与纤维粘连蛋白相比，RGD促进细胞粘附的作用更为明显，而在细胞增殖方面，二者的作用无显著性差异。本研究为改进生物材料的表面设计，促进心血管移植物的内皮化提供了一个切实可行的思路。     

VAPG是平滑肌细胞粘附的特异性配体

据GobinAS[JBiomedMaterRes ,2 0 0 3,6 7A(1) :2 5 5 2 97]报道弹性蛋白衍生肽———缬氨酸—丙氨酸—脯氨酸—谷氨酸(VAPG)可成为平滑肌细胞的生物特异性粘附配体。通过嫁接肽序列制成水凝胶材料 ,GobinAS及其同事对它在平滑肌细胞粘附和扩展中的作用进行评价。这些材料是聚乙二醇 (PEG)的丙烯酸盐衍生物 ,即具有光敏聚合性水凝胶。由于PEG含量较高 ,所以这些材料排斥蛋白吸附和细胞粘附性高。然而 ,PEG的双丙烯酸盐衍生物能够与粘附性肽修饰的PEG单丙烯酸衍生物混合 ,可促进细胞粘附。利用光敏聚合作用 ,PEG单丙烯酸盐衍生物…     

BSA和胶原的竞争性吸附与细胞粘附

细胞在材料表面的粘附是贴壁依赖型细胞生长的前提,细胞只有在表面以一定的粘附力发生粘附并铺展后,细胞列哨B生长。当细胞与表面的粘附力较强时,有利于细胞生长,而当粘附力较弱时,则有利于细胞分化。现在普遍认为细胞粘附过程由细胞表面的受体对细胞外基质（ECM）蛋白的特异性识别所调节。胶原等细胞外基质影响细胞的形态和功能,并提供细胞分化和增殖的信号。而培养介质是复杂的溶液,它们中许多有血清或添加的蛋白和表面活性物质。因而细胞在材料表面的粘附受蛋白质竞争性吸附所调节,包括基底预处理、培养基以及细胞分泌等许多不…     

截短型转位肽重组抗体/颗粒酶B基因的构建及表达

目的：构建携带截短型转位肽重组抗体／颗粒酶B基因的真核表达载体，并将其在HER2阳性SKBR-3肿瘤细胞及HER2阴性Hela肿瘤细胞中表达。方法：用PCR法获得截短型转位肽重组抗体／颗粒酶B基因片段，并克隆构建真核表达载体，以脂质体法转染SKBR-3细胞及Hela细胞，用免疫细胞化学染色检测其在不同细胞中的表达及对细胞形态的影响。结果：成功构建了编码截短型转位肽重组抗体／颗粒酶B基因的真核表达载体pCMV-e238Fv-FSD-GrB，用免疫细胞化学检测发现，绝大多数Hela细胞可高表达e23sFv-FSD-GrB蛋白，且细胞形态正常，而表达e23s17v-FSD-GrB蛋白的SKBR-3细胞形态发生变化，出现固缩细胞。结论：截短型转位肽重组抗体／颗粒酶B基因真核表达体系的建立，为确定PE转位肽的最小转位功能区段奠定了基础。     

细胞粘附分子的研究进展

细胞与细胞，细胞与细胞外基质粘附作用，是机体构建或维持组织或器官以及功能最基本的生命现象。细胞粘附分子是一群在多种细胞上表达，介导细胞间粘附和作用的糖蛋白物质。它们除参与介导细胞粘附机制，还互相传递信息，调节细胞功能，并与许多疾病密切相关。对其粘附机制的阻断，使之成为临床上治疗的一个有效手段，已引起人们的关注。     

成纤维细胞在PHB可降解材料上的粘附与生长研究

聚羟基丁酸酯（PHB）多孔材料可作为组织工程用的支架,然而细胞在此材料表面不易粘附生长,这与粘附蛋白在聚合物材料表面的吸附有关。基于材料表面的粘附与细胞生长、增殖、分化和组织发育密切相关,粘附强度可影响工程组织的最终结构与功能,本文通过对PHB材料进行多聚赖氨酸衣被,有效地实现了在PHB可降解支架上种植细胞来构建工程组织。用离心法制备厚度为20um的透明PHB薄膜,用多聚赖氨酸衣被,对照组为不衣被的PHB薄膜和玻璃片。接种成纤维细胞系NIH3T3,相差显微镜观察细胞的粘附生长过程。细胞在多聚赖氨酸衣被表面迅速粘…     

CCR9亲和短肽的筛选及其结合活性的鉴定

目的获取与CC趋化因子受体9(CCR9)具有亲和力的特定短肽。方法以CCR9的第2个胞外环为靶蛋白,反复筛选Ph.D.-12噬菌体展示肽库获得阳性克隆,通过ELISA测定噬菌体阳性克隆短肽与CCR9的亲和力,共聚焦显微镜检测短肽与CCR9高表达细胞MOLT4结合能力。结果经过3轮淘选、富集,确定了8个噬菌体克隆有插入序列,其中克隆C-4与靶蛋白具有较高亲和力,表达的短肽P1(VHWDFRQWWQPS)可抑制相应C-4克隆与靶蛋白的结合,并可与CCR9高表达的MOLT4细胞结合。结论通过噬菌体肽库筛选出了能与细胞表面分子CCR9结合的短肽序列VHWDFRQWWQPS。     

抗粘附肽YIGSR的衍生物对Lewis肺癌侵袭、转移能力的抑制作用

采用高转移肿瘤细胞对基底膜成分的体外粘附、侵袭模型和Lewis肺癌细胞自发肺转移模型 ,研究了YIGSR均叉、杂叉聚合肽的抗肿瘤侵袭、转移活性。实验结果 ,RGD和YIGSR的杂叉肽和YIGSR的均叉肽对PG细胞较对照的YIGSR肽表现了更明显的粘附抑制作用 ,并降低了PG细胞的体外侵袭能力 ,降低了移值Lewis肺癌细胞肺转移小鼠的肺重量或肺转移瘤结节数 ,但对小鼠原发部位移植瘤重量无明显影响 ;YIGSR聚合肽的以上作用有一定的剂量依赖性。     

雪旺氏细胞内NGF含量的定量测定方法研究

目的：建立一套测定单个细胞内蛋白含量的新方法。方法：纯化培养乳鼠雪旺氏细胞，施加实验因素，通过间接免疫荧光法标记细胞内ＮＧＦ蛋白，而后用流式细胞仪（适用于细胞悬液样品）或粘附细胞仪（适用于粘附细胞样品）进行测定。结果：流式细胞仪及粘附细胞仪均可得到每一实验组的精确测定结果，并能进行统计分析，提供统计图表和各种数据。结论：应用流式细胞仪或粘附细胞仪可对单个雪旺氏细胞内的ＮＧＦ含量进行定量研究     

利用噬菌体肽库筛选HeLa细胞表面与人CD59结合的活性短肽

目的寻找HeLa细胞表面与人CD59特异性结合的短肽序列。方法分别用非转基因HeLa细胞和转染CD59基因的HeLa细胞的裂解蛋白进行5轮亲和筛选,并通过竞争结合实验,然后用ELISA方法筛选噬菌体阳性克隆。提取单克隆DNA测序,并对其进行DNA序列分析推导出短肽序列。结果随机挑选的16个单克隆中有10个克隆对HeLa细胞有特异性结合力,经测序得到一条高度同源的多肽序列。结论通过噬菌体随机肽库对肿瘤细胞进行全细胞蛋白筛选,得到了噬菌体多肽能高特异性与肿瘤细胞结合的短肽序列,为下一步设计肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供了参考依据。     

S层介导嗜水气单胞菌粘附HEp—2细胞

用ＨＥｐ－２细胞作为体外模型，比较嗜水气单胞菌Ｓ层缺失突变株ＴＭ６及其亲本菌株Ｊ－１的粘附力，结果表明Ｊ－１株对ＨＥｐ－２细胞的粘附力明显高于ＴＭ６株。用Ｊ－１株Ｓ层蛋白抗体ＰＲ的Ｆａｂ片段预先与细菌反应，可使Ｊ－１株的粘附菌数下降，且呈剂量依赖关系，但对ＴＭ６株的粘附菌数无影响。用纯化的Ｊ－１株Ｓ层蛋白预先与ＨＥｐ－２细胞作用，亦能抑制Ｊ－１株对ＨＥｐ－２细胞的粘附，对ＴＭ６株也无影响。同时，将ＨＥｐ－２细胞与纯化的Ｊ－１株Ｓ层蛋白混合并孵育，用嗜水气单胞菌ＴＦ７株Ｓ层蛋白抗体ＰＦ１作免疫酶分析，结果表明Ｓ层蛋白可结合在ＨＥｐ－２细胞上。综上可见，Ｓ层是嗜水气单胞菌的一种粘附素。可介导嗜水气单胞菌粘附ＨＥｐ－２细胞。     

RGD多肽修饰的改性PLGA仿生支架材料对骨髓间充质干细胞粘附、增殖及分化影响的研究

目的：探索RGD多肽修饰的改性PLGA支架材料上骨髓基质细胞的增殖、粘附及分化情况。方法用异型双功能交联剂Sulfo-LC-SPDP将GRGDSPC多肽共价结合到改性PLGA支架材料上，以未接多肽的改性PLGA材料做对照，取第三代MSC接种到材料上，培养1d、2d、3d、4d后比较材料上的细胞密度来反映细胞的增殖程度；取第三代MSC接种到材料上，培养4h、12h后沉淀法定量检测粘附的细胞数，培养24h后摄光镜图像比较粘附细胞的数量和形态，并用FITC连接的鬼笔环肽对细胞骨架染色，在荧光显微镜下观察细胞骨架的组织情况；取第三代MSC接种到材料上，用成骨性培养基培养7d、14d、21d，检测细胞中ALP活性来了解MSC分化情况。结果：培养1d、2d、3d、4d后细胞的增殖程度无显著性差异；培养4h、12h后实验组细胞粘附率均显著高于对照组，且24h后细胞的粘附质量、细胞骨架的组织情况也较对照组为好；培养14d后实验组细胞表达显著高的ALP活性。结论：RGD多肽修饰对细胞增殖无明显促进作用，但能提高改性PLGA支架材料对骨髓基质细胞的粘附性，对MSC向成骨细胞分化有显著促进作用。     

壳聚糖水凝胶的研制及其与C2C12细胞粘附、支持作用的实验研究

研制可注射的壳聚糖水凝胶材料,并对该材料的理化特性进行检测,同时检验其是否能粘附并支持C2C12细胞生长。对不同温度下的壳聚糖溶液进行pH值的测定,并以壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠溶液为原料,制备温敏性壳聚糖水凝胶,对该材料的粘度及37℃成胶时间进行测定,显微镜下观察水凝胶材料的结构,通过C2C12细胞在其表面上的粘附与生长情况,判定该材料是否具有良好的细胞相容性。结果表明：该材料具有温度敏感性,即室温下为液态,37℃变为固态。当壳聚糖溶液浓度为2%时,加入45%β-甘油磷酸钠溶液后的成胶作用时间最短,约为15min。C2C12细胞在壳聚糖水凝胶材料上的粘附与生长情况良好。壳聚糖水凝胶可作为可注射性组织工程化心肌的支架材料,用于携带有效细胞进行缺血性心脏病的治疗。     

再生柞蚕丝素蛋白对人骨髓间充质干细胞体外扩增的支持作用

大量的研究表明家蚕丝素蛋白具有良好的生物相容性。而对于柞蚕丝素蛋白在医用生物领域的研究报道在国内外尚较少。本研究选择再生柞蚕丝素蛋白为研究对象，观察了人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）在再生柞蚕丝素膜上的粘附、生长及表面抗原的变化。结果在1h观察再生柞蚕丝素对hBMSCs的粘附力几乎与胶原相同，明显优于家蚕丝素和聚苯乙烯培养板。MTT法检测结果显示在第4d hBMSCs在再生柞蚕丝素膜上的增殖明显高于其他各组。电镜观察结果显示hBMSCs在再生柞蚕丝素膜上能够很好的粘附、生长，细胞间能相互连接形成片状结构。流式细胞仪检测再生柞蚕丝素蛋白对hBMSCs表面抗原的表达亦无明显影响。本研究结果显示再生柞蚕丝素蛋白体外支持hBMSCs的粘附、生长，具有良好的细胞相容性。     

316L不锈钢表面抗体的固定及体外细胞相容性研究

表面快速内皮化是预防支架植入后血栓和再狭窄的新途径。本实验分别将合成的仿生海洋生物粘性多肽及对内皮细胞特异性结合的CD34抗体固定到316L不锈钢片及支架表面，并对其体外细胞相容性进行了初步研究。结果表明：固定的多肽及抗体促进了内皮细胞在钢片表面的粘附和增殖，提高了细胞活性，增加了细胞与不锈钢基体的结合强度。提高多肽浓度，可以促进内皮细胞的粘附，但浓度过高，反而抑制细胞的粘附；提高抗体浓度，可以增加抗体的固定及细胞的粘附。支架固定抗体后，内皮化速度加快。该方法促进了材料表面的原位内皮修复速度，因此可用于支架材料及组织工程材料等的表面改性。     

三嵌段高分子骨组织工程支架材料的表面多肽修饰与细胞粘附性研究

目的用甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸-半胱氨酸对三嵌段高分子骨组织工程支架材料进行表面修饰，并检测其细胞粘附性。方法利用异双官能交联剂将甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸-半胱氨酸多肽固定在聚丙交酯／乙交酯／天冬氨酸-聚乙二醇材料表面，并进行X线光电子分光镜检测和表面接触角测定；体外培养骨髓基质细胞，接种至表面修饰的材料上，测定细胞粘附力，并和未修饰材料对比。结果固定交联剂和多肽后X线光电子分光镜检测示硫元素的含量分别为0．3％和0．2％；硫元素的结合能是164eV和163．9eV；表面接触角为60．2±2．364度；细胞粘附力为（521．45±134．98）×10^-10牛顿。结论甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸-半胱氨酸能共价固定在聚丙交酯／乙交酯／天冬氨酸-聚乙二醇材料表面；多肽修饰后的材料能特异性的介导骨髓基质细胞粘附，增强其粘附力。     

钙粘附蛋白在人类早期胚胎的表达

目的 检测钙粘附蛋白在人类早期胚胎的表达，探讨钙粘附蛋白在胚胎着床及发育中的作用。方法 应用特异性单克隆抗体，采用间接免疫荧光方法，检测人种植前胚胎(分别为2、4、6、7、8细胞胚及囊胚)上皮型钙粘附蛋白的表达，并应用激光共聚焦显微镜对荧光进行定量检测。结果 各期人种植前胚胎表面均见上皮型钙粘附蛋白表达，囊胚期表达明显增高。结论 人类早期胚胎在发育过程中能表达上皮型钙粘附蛋白，且表达量逐渐增加，可能对胚胎成功着床有重要意义。     

蛋白转导在基因治疗中的应用

蛋白转导是近几年生命科学领域发现的一种独特现象,具有蛋白转导功能的蛋白通过几个短的碱性小肽组成的蛋白转导域(proteintransductiondomain,PTD)的介导,能将与其共价连接的DNA、多肽或蛋白质以及其他大分子物质通过非经典途径穿过细胞膜甚至血脑屏障,并在细胞间自由传递。PTD这种能携带融合蛋白自由进入细胞的独特功能为人类一些疾病的基因治疗提供了一种新的运载工具,在基因治疗中有着美妙的应用前景。