反义AFP增强子/TK基因重组逆转录病毒载体的构建及在肝癌细胞中的专一性表达

目的构建在肝癌细胞中特异性高表达的重组逆转录病毒载体,观察其对体外培养肝癌细胞生物学行为的影响。方法应用DNA重组技术将α-甲胎蛋白増强子(AFE)核心区DNA与单纯性疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因融合,反向插入逆转录病毒载体pLXSN,重组体命名为pL/TK/AFE/SN;经PA317细胞包装、G418筛选、病毒滴度测定,挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩增培养,收获病毒上清,感染体外培养的Hap3B肝癌细胞和Hela宫颈癌细胞。用Southernblot、Northernblot检测转染细胞的DNA、mRNA,以羟甲基无环鸟苷(GCV)对细胞的杀伤毒性检测外源基因在转染细胞中的表达。结果酶切及Southernblot证实插入pL/TK/AFE/SN的反义AFE/TK基因大小、方向及克隆位点正确。达到一定的产病毒滴度。Northernblot分析显示Hep3B肝癌细胞有TK基因mRNA水平表达;应用GCV后,导入反义AFE/TK基因的Hep3B肝癌细胞生长明显受抑制(P<0.01)。结论成功构建了含反义AFE/TK基因的重组逆转录病毒载体并包装出具有感染能力的假型逆转录病毒;重组载体所含的反义AFP増强子能调控外源性TK基因特异地在Hep3B肝癌细胞中高表达。     

Retroviral vector containing human p16 gene and its inhibitory effect on Bcap -37 breast cancer cells

目的　研究p16基因对肿瘤细胞生长抑制及细胞周期阻滞作用。方法　将p16cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN构建成p16基因逆转录病毒重组体pLp16SN。利用基因转染方法 ,将pLp16SN及pLXSN导入逆转录病毒包装细胞系PA317细胞 ,获得逆转录病毒。用逆转录病毒感染Bcap 37乳腺癌细胞 ,经G4 18筛选获阳性克隆。利用Northern和Westernblotting方法检测p16基因的表达。检测转基因细胞的生长速度 ,细胞周期及裸鼠成瘤等细胞生物学行为的改变。结果　Northern及Westernblotting显示转染p16基因的Bcap 37细胞p16基因mRNA及蛋白质表达明显增高。此细胞较未转染基因的Bcap 37细胞和转染空载体的Bcap 37细胞生长速度慢 ,G1期细胞比率增高 ,裸鼠接种成瘤体积小。结论　p16基因高表达能够抑制乳腺癌细胞Bcap 37的生长 ,并阻滞细胞从G1期进入S期     

HSV1—TK逆转录病毒载体构建及表达

目的 构建含TK基因逆转录病毒载体并检测其在转染细胞中的表达，为肺癌基因治疗积累实验资料。方法 从PHSV106质粒中切下约2．4kbTK基因片段，插入逆转录病毒载体PLXSN多克隆位点，酶切筛选正、反向连接质粒。正向连接子电穿孔法转化肺癌细胞A549，用PCR、细胞原位杂交法分别检测TK基因整合和表达。结果 经酶切鉴定得到正向连接子、电穿孔法转导A549细胞，经G418筛选出了转基因细胞，TK基因已整合在转染细胞中并阳性表达。结论 成功构建了TK基因逆转录病毒载体，转导该载体的肺癌细胞可表达TK基因。     

逆转录病毒介导人重组骨形态发生蛋白基因转染骨骼肌卫星细胞mRNA的表达

目的：探讨逆转录病毒介导重组人骨形态发生蛋白7（recombinant human bone morphogenetic protein7,rhBMP7)基因转染骨骼肌卫星细胞的可行性及目的基因的表达情况。方法：体外获取和培养大鼠骨骼肌卫星细胞，构建rhBMP7逆转录病毒载体，利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，经G418筛选后，制备含目的基因和重组逆转录病毒液，病毒液感染骨骼肌卫星细胞，使用RT－PCR方法检测rhBMP7 mRNA的表达情况。结果：成功地构建了逆转录病毒真核表达载体，逆转录病毒介导rhBM7基因转染的骨骼肌卫星细胞能有效地表达外源性rhBMP7的mRNA。结论：采用逆转录病毒介导的方法可将rhBMP7转染至骨骼肌卫星细胞中，目的基因可在mRNA水平有效表达。     

逆转录病毒介导的SHP-1基因在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达

目的 构建逆转录病毒表达载体pLNCX2-SHP-1.获取重组逆转录病毒.并将SHP-1基因转导入乳腺癌MDA-MB-231细胞株.方法 采用RT-PCR方法从高表达SHP-1的人乳腺癌细胞株MCF-7中克隆出SHP-1基因全长cDNA,构建重组逆转录病毒表达载体pLNCX2-SHP-1,通过脂质体介导将其转染入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定产病毒的细胞株,将病毒感染人乳腺癌细胞MDA-MB-231.采用Western blotting方法检测SHP-1基因在MDA-MB-231细胞中的表达情况.结果 成功构建重组逆转录病毒表达载体pLNCX2-SHP-1,转染包装细胞PT67,筛选出对G418具有稳定抗性的克隆PT67/SHP-1,获取重组逆转录病毒上清液,并感染人乳腺癌细胞MDA-MB-231.从蛋白水平证实,感染后的MDA-MB-231有SHP-1基因的表达.结论 将SHP-1基因定向克隆入逆转录病毒载体的方法可成功获取重组逆转录病毒,感染MDA-MB-231细胞得到稳定表达SHP-1基因MDA-MB-231/SHP-1,为进一步研究奠定了基础.     

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的 构建人骨形态发生蛋白（human bone morphogenetic protein7，hBMP－7）逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell,MSCs)mRNA的表达。方法 构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞，采用原位杂交、RT－PCR检测hBMP－7mRNA在MSCs中的表达。结果 成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体，经hBMP－7基因转染的MSCs可表达外源性BMP－7mRNA。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将hBPM－7转染至MSCs中并表达外源性基因。     

逆转录病毒介导人重组骨形态发生蛋白基因转染骨骼肌卫星细胞mRNA的表达

目的探讨逆转录病毒介导重组人骨形态发生蛋白7(recombinant human bone morphogenetic protein 7, rhBMP7)基因转染骨骼肌卫星细胞的可行性及目的基因的表达情况。方法体外获取和培养大鼠骨骼肌卫星细胞,构建rhBMP7逆转录病毒载体,利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PT67,经G418筛选后,制备含目的基因的重组逆转录病毒液,病毒液感染骨骼肌卫星细胞,使用RT-PCR方法检测rhBMP7 mRNA的表达情况。结果成功地构建了逆转录病毒真核表达载体,逆转录病毒介导rhBM7基因转染的骨骼肌卫星细胞能有效地表达外源性rhBMP7 的mRNA。结论采用逆转录病毒介导的方法可将rhBMP7转染至骨骼肌卫星细胞中,目的基因可在mRNA水平有效表达。     

外源hTERT基因对大鼠肝细胞增殖的影响

目的:构建含目的基因人端粒逆转录酶(hTERT)重组逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT,体外感染原代大鼠肝细胞,观察对大鼠肝细胞增殖的影响.方法:将hTERT插入逆转录病毒载体pLNCX2获得重组逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT,转染包装细胞293T后可获得表达hTERT逆转录病毒,感染体外培养的原代大鼠肝细胞,通过RT-PCR及western-blot检测基因在细胞中的表达情况.结果:重组载体pLNCX2-hTERT经双酶切鉴定及序列测定,证实构建正确.转染原代大鼠肝细胞后能明显促进其增殖.结论:体外转染原代大鼠肝细胞后能有效促进其增殖,这为进一步解决人工肝细胞来源问题奠定了实验基础.     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

野生型p53,GM-CSF和B7-1基因转移对卵巢癌细胞系SKOV-3增生的影响

目的研究人野生型p53、GM-CSF和协同刺激因子B7-1基因共转染对卵巢癌细胞增生的影响。方法以携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒载体转染卵巢癌细胞系SKOV-3,荧光显微镜观察,流式细胞计数计算转染效率;以携带野生型p53、GM-CSF和B7-1基因的腺病毒转染SKOV-3细胞,RT-PCR检测目的基因表达,观察转染前后细胞形态的变化,绘制细胞生长曲线。结果当腺病毒的感染强度达到400 pfu/细胞时,转染率可达到81%;以携带目的基因的腺病毒转染SKOV-3细胞,能检测到相应基因表达;转染后SKOV-3细胞形态发生改变,增生减缓。结论腺病毒载体能介导目的基因转入卵巢癌细胞,并有效表达;人野生型p53、GM-CSF和B7-1基因共转染能减缓卵巢癌细胞的增生。     

HBx基因重组逆转录病毒载体的构建及表达

目的:构建携带HBx基因的重组逆转录病毒载体,为进一步研究HBx基因在HBV相关性HCC(原发性肝癌)发病机制中的作用以及建立肝癌动物模型奠定基础.方法:根据基因库中已公布的HBx序列设计引物,采用PCR技术从HBx腺病毒质粒中扩增出HBx基因.将HBx基因克隆到逆转录病毒载体pSEB-HUS质粒中.酶切、PCR及测序鉴定后经脂质体介导转染L02细胞,Western Blotting检测HBx蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序鉴定证实目的基因正确克隆至逆转录病毒质粒pSEB-HUS中,目的基因序列与GENE BANK报道一致,转染L02细胞后荧光显微镜可观察到GFP的表达.Western Blotting检测可见HBx蛋白的表达.结论:成功构建HBx重组逆转录病毒载体.     

病毒介导的基因转染在组织工程中的应用

目的 构建重组病毒载体，将较多细胞因子通过病毒载体转入种子细胞，提高细胞增殖及分泌基质能力，维持表型，延缓老化。方法 应用基因工程技术，构建缺陷型逆转录病毒重组载体和缺陷性腺病毒重组载体。分别通过PT67包装细胞筛选克隆及293细胞扩增，获得假病毒上清液，经浓缩纯化后转染靶细胞结果成功构建胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、Fas配体(Fas-Ligand)、绿色荧光蛋白(GFP)等逆转录病毒载体以及TGFβ1、人骨形成蛋白因子-7(hBMP7)、端粒酶、Smad3、Smad7等腺病毒载体，其中GFP-逆转录病毒重组载体在软骨细胞表达至2月。结论 通过有效的含目的基因重组载体转染种子细胞，延缓体外培养细胞的老化及促进细胞的增殖与基质分泌，获得组织工程所需要的大量种子细胞，为组织工程构建奠定了基础。     

EBV LMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的构建含EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白基因2A（LMP2A）的逆转录病毒表达载体，筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）扩增获取目的基因LMP2A，定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro，形成重组质粒pMSCVpuro-2A，脂质体法将pMSCVpuro-2A转染逆转录病毒包装细胞PT67。嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆，扩大培养产毒细胞克隆，收获病毒进行滴度测定，RT-PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达。结果限制性酶切、PCR及测序鉴定证实LMP2A正确插入逆转录病毒表达载体；筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆；收获病毒的滴度为3．2×10^7CFu／L，且重组腺病毒在PT67细胞能有效转录。结论携带LMP2A基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCVpuro-2A构建成功，转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒，进而筛选获得了能转录表达LMP2A的产毒细胞系PT67-LMP2A。     

hTERT启动子调控的TRAIL基因载体的构建及表达

目的：构建hTERT启动子调控的TRAIL基因载体，探讨hTERT启动子调控的转基因表达。方法：PCR法扩增膜结合型TRAIL基因，回收产物与带有hTERT启动子的载体连接，构建重组载体ph—TERT—TRAIL；瞬时转染乳腺癌细胞系MCF-7／ADR；采用RT—PCR法检测外源基因TRAILmRNA水平的表达，流式细胞术(FCM)检测蛋白水平的表达。结果：重组载体phTERT—TRAIL经PCR、酶切出现相应长度的片段；测序结果连入TRAIL基因；目的基因的序列分析结果与Genebank中的数据高度同源；RT—PCR显示细胞中外源基因TRAIL在mRNA水平明显表达；FCM显示转染了重组载体phTERT—TRAIL的细胞较未转染带有TRAIL基因载体的细胞TRAIL蛋白表达水平上调。结论：成功构建重组载体ph—TERT-TRAIL，hTERT启动子调控的TRAIL基因在乳腺癌细胞系MCF-7／ADR中明显表达。     

含人白细胞介素-2基因逆转录病毒载体系统的建立及转染人白血病细胞株的研究

应用逆转录病毒载体LNCIL－2介导人白细胞介素（IL）－2基因经包装细胞PA317包装成重组病毒后，转染人白血病细胞株K562、HL－60，经G418筛选获阳性克隆，阳性克隆上清表达IL－2活性。转染后细胞经Southern检测存在新霉素抗性基因（neoR）。转染IL－2基因的白血病细胞生长速度、克隆形成率均落后于转染空载体或未转染基因的细胞。表明含人IL－2基因逆转录病毒载体系统已成功建立，转染人IL－2基因的白血病细胞增殖活性下降。     

人DC-SIGN基因克隆及其转基因细胞的构建

目的克隆人DC-SIGN基因,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体,获得稳定表达DC-SIGN分子的L929基因转染细胞。方法利用RT-PCR的方法从人外周血单核细胞来源的树突状细胞（DC）总RNA中克隆出人DC-SIGN基因,通过双酶切（EcoRI,BamHI）装入逆转录病毒载体pGEZ-Term中,脂质体法共转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清感染L929细胞,72h后,加入Zeocin进行筛选,挑选出能稳定表达DC-SIGN蛋白的L929细胞株。结果构建了用于表达的含DC-SIGN基因的重组逆转录病毒载体,经转染包装细胞293T后,获得具有感染能力的重组DC-SIGN逆转录病毒和转染L929细胞,继而经RT-PCR、流式细胞仪表型检测,筛选出了稳定表达人DC-SIGN蛋白的L929转基因细胞。结论构建了含人DC-SIGN基因重组逆转录病毒载体和稳定表达人DC-SIGN蛋白的细胞株,为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。     

Hsv—tk、重组人TNF—α融合基因表达载体的构建及瞬时表达

目的：构建pEGFP-TK-TNF-α表达载体，观察其在喉癌细胞Hep-2中的瞬时表达，方法：应用PCR方法对各自的进行扩增并经测序载体pGEM-T-Easy测序，利用逆转录病毒载体PLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因TK－rhTNF-α并将其亚克隆至pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间成功构建表达载体pEGFP-TK-rhTNF-α，并在该载体转染人喉细胞Hep-2后观察融合蛋白表达情况，结果：酶切鉴定证实TK－rhTNF-α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间，并在转染人喉癌细胞Hep-2中观察到TK－rhTNF-α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRI和BamH1位点间，并在转染人喉癌细胞Hep-2中观察到TK－rhTNF-α融合基因及绿色荧光蛋白的表达。结论：pEGFP-TK-rhTNF-α表达载体便于观察转染细胞中TK－rhTNF-α融合蛋白的表达情况及蛋白定位，为自杀基因联合细胞因子基因疗法提供有利条件。     

大鼠心肌肌凝蛋白α重链基因逆转录病毒载体的构建

目的：克隆编码大鼠心肌肌凝蛋白α重链aa736-960的cDNA片段,构建携带huIL-2/myosin融合基因的逆转录病毒载体。方法：以RT-PCR方法从幼齿大鼠心肌组织中扩增出681bp的目的基因,与huIL-2cDNA序列拼接,构建融合基因huIL-2/myosin及其逆转录病毒载体,采用脂质体转染NIH3T3细胞,经G418筛选后,用RT-PCR和免疫组化法分析重组逆转录病毒的表达。结果：核苷酸序列测定显示,克隆基因的核苷酸及推导的氨基酸序列与报告序列一致,开放阅读框正确;逆转录病毒载体pLNC-huIL-2-myosin酶切结果与预期一致,RT-PCR检测提示转染细胞有pLNC-huIL-2-myosinmRNA转录;免疫组化分析表明转染细胞胞质内有大量肌凝蛋白表达。结论：大鼠心肌肌凝蛋白α重链基因逆转录病毒载体构建成功,并可在NIH3T3细胞中表达,为心肌肌凝蛋白基因转移诱导机体特异性免疫耐受对心肌免疫损伤的防治研究打下了基础。     

特异性沉默EBV潜伏期基因LMP1 pSUPER retro RNAi系统的构建

目的 构建并筛选携带针对Epstein-Barr病毒（EBV）潜伏膜蛋白基因LMP1的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞克隆.方法 用DNA重组技术,将60 bp能转录产生靶向LMP1小发夹RNA（shRNA）的寡核苷酸序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,脂质体法将重组逆转录病毒载体转染包装细胞系PA317,G418筛选建立稳定产生逆转录病毒的细胞克隆.结果 重组逆转录病毒载体经限制性内切酶酶切,电泳后可观察到7 167 bp和281 bp两条DNA条带;测序鉴定结果表明序列正确;重组载体转染包装细胞,可表达绿色荧光蛋白,经G418筛选,得到抗性细胞克隆.结论 特异性沉默EBV潜伏期基因LMP1的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系构建和筛选成功.     

逆转录病毒介导外源基因高效感染大鼠骨髓间充质干细胞

目的 通过逆转录病毒系统将小鼠同源盒基因Soxl转移至大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）。检测外源基因的表达，感染效率及感染时间。方法 常规分子生物学亚克隆技术构建重组逆转录病毒载体，转染至包装细胞株PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液，感染rMSC，并用带EGFP表达盒的pLEGFP-N1载体的逆转录病毒系统作为平行对照，评估感染率；使用Westernblot以及免疫组织化学的方法检测携带目的基因的重组逆转录病毒在rMSC中的感染和表达情况。结果 本实验成功地制备了pLXSN—Soxl重组逆转录病毒载体并制备出高滴度病毒颗粒；将病毒上清感染rMSC，EGFP阳性细胞为21％，感染时间持续20d，而对照脂质体转染法EGFP阳性细胞仅为3％。免疫组化及Westernblot显示用重组逆转录病毒液感染的rMSC可表达外源基因产物Soxl蛋白。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将外源性基因高效转移至rMSC中，并有外源性基因的稳定表达。