大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学特性研究

目的 探讨体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的方法,并研究其生物学特性.方法 取大鼠股骨和胫骨,以Ficoll密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化大鼠BMSCs,传代扩增,倒置显微镜进行细胞形态学观察,MTT法测定细胞的生长曲线,流式细胞仪细胞表面抗原.结果 原代分离的BMSCs,培养48 h开始贴壁,胞体由圆形变为椭圆形、多角形或短梭型;培养第12天,见胞体渐变为长梭型,并达90%单层融合;经传代扩增,细胞进一步纯化.7代以前,细胞在2 d内处于潜伏期,第3天进入对数生长期,第7天进入平台期;10代后增殖速度变慢;流式细胞仪鉴定BMSCs表而抗原,CD44、CD90、CD34阳性率分别为99.62%、95.13%、2.06%.结论 Ficoll密度梯度离心法结合贴壁法有效分离纯化大鼠BMSCs,且细胞生长稳定,增值能力活跃,具有MSCs的一般生物学特性.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及表型鉴定

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞分离及培养的方法,探讨体外培养骨髓间充质干细胞的生物学特性.方法 采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,测定生长曲线,镜下连续观察细胞的形态变化.流式细胞仪鉴定其表面抗原 CD29、CD34、CD44和CD45的表达情况.结果 原代骨髓间充质干细胞呈集落状生长,细胞呈梭形、纺锤形,呈放射状生长,传代后呈均一的成纤维细胞样.骨髓间充质干细胞生长性状相对稳定,1、3、5代细胞生长曲线基本一致.流式细胞仪鉴定表明,骨髓间充质干细胞CD44、CD29表达呈阳性,CD45、CD38表达呈阴性.结论 采用密度梯度离心法结合贴壁培养法能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,并且在体外培养条件下可大量增生,形成形态均一的细胞集落,可以作为组织工程中种子细胞的来源.     

人碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的 观察人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因体外转染对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)bFGF表达的影响.方法 密度梯度离心、贴壁法培养分离SD雄性大鼠MSCs,体外扩增,流式细胞仪检测MSCs表面抗原表达.利用慢病毒载体系统介导将具有人源性bFGF基因转染至第2代MSCs,在倒置荧光显微镜下观察转染后细胞形态和生长的变化,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot法鉴定bFGF在MSCs中的表达.结果 密度梯度离心、贴壁法培养分离可获得MSCs,P3代大鼠细胞利用流式细胞仪检测CD11b/c阳性细胞表达率为(13.2±0.6)%,CD34阳性细胞表达率为(1.2±0.5)%,CD44阳性细胞表达率(97.8±0.9)%,CD90阳性细胞表达率(96.8±1.4)%.MSCs转染48 h后,绿色荧光蛋白的表达明显增强.RT-PCR证实转基因MSCs表达bFGF mRNA明显增强,Western blot检测证实转基因MSCs在49 KDr出现特异性条带,而空白和空载组的MSCs则未见阳性条带.结论 采用慢病毒介导的基因转染技术可以将bFGF基因转染至MSCs中,并有外源性bFGFmRNA和蛋白的有效表达,MSCs可作为bFGF基因治疗的载体.     

人骨髓间充质干细胞体外分离、培养及鉴定的实验研究

目的观察体外培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)的形态和生长规律,以证实人MSCs是一种理想的种子细胞,以及为进一步深入研究提供基础理论依据。方法对人骨髓淋巴细胞分离液采用密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯MSCs。观察原代、传代细胞的结构、生长情况,对第2代MSCs表面抗原进行测定。结果MSCs原代培养第14～16d时细胞融合成单层,传代细胞保持原代细胞的形态特征。超微结构显示:第2代MSCs细胞核形态不规则,部分核可见多个核仁,胞质内细胞器形态分化幼稚。细胞的生长曲线显示:传代第3d起呈对数生长,第5d达到高峰,10代后无明显克隆出现。P1代克隆形成率为25.83%±2.93%,P5代为14.67%±1.63%,P10代为4.67%±0.52%。MSCs的表型特征显示细胞均一性较好,MSCs表达CD29,CD44,但不表达CD34,CD45。结论用淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁筛选法,可分离、纯化人MSCs,方法简单、经济,易应用;MSCs增殖能力强,可在体外大量扩增,能满足组织工程的要求,是理想的种子细胞之一。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及初步鉴定

目的 探讨体外培养大鼠骨髓间充质干细胞的可行性,分析其部分表型特点,为细胞移植治疗中枢神经系统疾病奠定基础.方法 采用贴壁筛选法分离纯化大鼠MSCs,进行培养,传代扩增,免疫组化鉴定细胞是否表达具有干细胞特性的标记抗原-神经巢蛋白(nestin),并用流式细胞仪进行荧光检测初步鉴定.结果 分离后的MSCs出现增殖性生长,免疫组化显示巢蛋白(nestin)表达阳性,经流式细胞仪检测显示CD44,CD90阳性,CD45阴性.结论 在体外可培养出较大丰度大鼠骨髓间充质干细胞,而且此方法简单易行.     

大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性和示踪标记

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养方法,观察绿色荧光蛋白(GFP)基因通过慢病毒载体感染MSCs的表达.方法 采用原代贴壁法获得骨髓MSCs,观察细胞形态和生长变化,流式细胞仪鉴定细胞表面标志,体外诱导MSCs向脂肪细胞和成骨细胞分化.采用含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因慢病毒载体感染培养的MSCs,比较细胞感染前后生物学特性.结果 原代贴壁筛选结合差异传代培养的MSCs表面标志阳性率分别为CD44 94.81%,CD90 99.53%,CD106 76.34%,MSCs在pH值稳定于7.2～7.4的环境可传20代.体外MSCs诱导分化后特异性染色显示脂质沉淀和骨结节,表达脂肪细胞和成骨细胞特异基因.慢病毒载体可有效感染大鼠MSCs,加入聚凝胺感染效率达到80%,EGFP在MSCs感染后1个月仍持续表达.结论 骨髓MSCs可长期培养,具有良好的多向分化能力.携带EGFP基因慢病毒载体能高效感染MSCs,EGFP可作为MSCs体内研究的示踪标记.     

细胞外基质对大鼠MSCs生物学活性的影响

目的：观察细胞外基质多聚赖氨酸对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）生长特性的影响，以寻求体外培养扩增MSCs更理想的方法。方法：用贴壁法分离获得大鼠MSCs，分别氨酸的培养器皿上，显微镜下观察细胞贴壁速度、生长和形态特点，流式细胞仪分析细胞生长周期。结果：MSCs在用多聚赖氨酸处理过的培养器皿E贴壁、增殖都较普通组快，细胞形态好，细胞活力和长势较普通组活跃。结论：细胞外基质多聚赖氨酸能明显促进MSCs的贴壁和增殖，有助于MSCs的体外扩增培养。     

骨折后外周血间充质干细胞浓度变化的实验研究

[目的]观察骨折后不同时间点外周血间充质干细胞(MSCs)浓度变化,并比较其与骨髓间充质干细胞生物学特性的异同.[方法]根据不同处理条件将SD大鼠分为:对照组和骨折组(骨折后1、3、7d共3组),每组20只.分别于骨折后1、3、7d抽取外周血,密度梯度离心法分离培养外周血MSCs,计数成纤维细胞集落形成单位(CFU-Fs)数.流式细胞仪检测细胞表面标记(CD44、CD90、CD34、CD45).成骨、成脂诱导,碱性磷酸酶、茜素红和油红染色检测其分化特性.[结果]原代外周血MSCs呈集落生长,骨折组集落数明显多于对照组,其中以骨折后3d组形成的集落数最多,具有显著差异(27.25±11.52 CFU-Fs/cuhure vs 2.80±3.96 CFU-Fs/culture,P＜0.01).外周血MSCs高表达CD44、CD90,低表达CD34、CD45,不同的是CD34小部分呈阳性(＜20％).与对照组骨髓MSCs的诱导结果相同,外周血MSCs成骨诱导后28 d出现钙结节,茜素红染色阳性;成脂诱导后21 d有大量脂滴出现,油红染色阳性.[结论]外周血体外密度梯度离心法分离培养的细胞具有多潜能分化的MSCs表面标记且可以向成骨、成脂分化.骨折后外周循环中MSCs数量明显增多,呈一定的时序性变化,可能参与骨折修复.     

人脐血中血管内皮祖细胞体外扩增和鉴定的实验研究

目的：探讨从人脐血中分离、培养、体外扩增血管内皮祖细胞(EPC)的方法及体外进行EPC的鉴定。方法：采用密度梯度离心法从脐血中分离EPC，体外分别培养在包被有FN和不包被FN的培养皿中，采用免疫组织化学技术(SABC法)鉴定培养贴壁细胞表面标志CD31、CD34及KDR的表达；流式细胞仪检测细胞表面标志CD133及表达CD133细胞比例。结果：包被FN的培养皿中细胞贴壁及增殖均比未包被的多，免疫组化染色CD31、CD34及KDR均呈阳性，培养第4天流式细胞仪检测CD133^ 占21．3％。结论：密度梯度离心法可用于体外分离脐血中EPC进行实验研究，FN对于体外培养EPC有非常重要的作用。     

骨髓间质干细胞的分离培养鉴定与生物学特性

目的 观察贴壁法分离提取大鼠乳鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)并进行体外扩增培养的可行性并探讨其生物学特性,为进一步实验研究作基础.方法 实验2008-01/06于南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成.贴壁法分离培养SD大鼠乳鼠MSCs,经CD29、CD34、CD44、CD45鉴定MSCs,并绘制不同代数细胞生长曲线和贴壁率曲线分析其生物学特性.结果 ①原代细胞生长潜伏期略长,孵育24 h后小部分圆形单核细胞开始贴壁,48 h可见巢状克隆集落形成,贴壁细胞呈多形性,贴壁3d后增殖加快,9d后基本融合.②生长曲线及贴壁率曲线提示第2至第6代细胞接种存活率基本相同,生长曲线基本一致,而第7代以后细胞的生长速度渐缓,贴壁时间延长,细胞接种存活率也明显降低,并出现衰化现象.③免疫组化鉴定结果 显示CD29、CD44表达基本阳性,而CD34、CD45表达阴性.结论 贴壁法比较容易分离培养MSCs,为组织工程的应用提供了足够的种子来源,MSCs有一定的增殖能力但并不是无限的,而是随传代扩增逐渐衰化,因此了解和掌握MSCs的生物学特性为进一步研究应用打下基础.     

骨髓间充质干细胞对异种T淋巴细胞增殖的影响及其机制

目的 研究骨髓间充质干细胞(MSCs)对异种混合T淋巴细胞增殖的影响及其机制.方法 采用密度梯度离心法分离豚鼠MSCs;免疫组织化学法检测MSCs膜表面CD45和CD44的表达;流式细胞术检测MSCs周期;CCK-8法检测和绘制MSCs的生长曲线;观察MSCs和其培养上清对体外异种淋巴细胞混合培养的影响.结果 MSCs膜表面CD45表达阴性、CD44表达阳性;分析MSCs周期显示,MSCs中20%左右处于S期、G2期和M期,其余80%左右均处于G0期和G1期.MSCs和其培养上清均能明显抑制异种T淋巴细胞混合培养的增殖反应(P<0.05),加入白细胞介素2(IL-2)能逆转MSCs的抑制作用(P<0.05).结论 MSCS的鉴定可根据细胞形态.膜表面标志物来确定.MSCS及其培养上清对异种淋巴细胞混合培养的增殖反应有显著的抑制作用.     

冠心病病人骨髓间充质干细胞的生物学特征评价

目的　确立胸骨骨髓间充质干细胞分离和培养的方法 ,评价其生物学特征。方法　骨髓取自行冠状动脉旁路移植术的冠心病病人胸骨切口 ,用Percoll液分离骨髓MSCs,体外培养扩增 ,观察细胞生长特性 ,流式细胞仪检测骨髓MSCs表型特征、细胞周期。结果　贴壁的骨髓MSCs多数呈梭形。骨髓MSCs能连续传 15代以上 ,但是第 5代以后或老年病人的细胞增殖速度减慢。骨髓MSCs的表型特征为CD2 9、CD4 4阳性 ,CD34、CD4 5阴性。多数骨髓MSCs在细胞周期的G0 /G1期。结论　冠心病病人手术时从胸骨切口取骨髓并分离培养骨髓MSCs的方法可行 ,骨髓MSCs具有较好的增殖更新潜能 ,是细胞心肌成形术中理想的细胞来源。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的建立一种兔骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）体外分离培养、扩增及鉴定的方法。方法骨髓穿刺法抽取新西兰白兔髂骨骨髓5ml，应用密度梯度离心法分离纯化MSC并进行体外扩增，倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况，计数细胞数目，绘制细胞乍长曲线。HE染色光镜观察细胞形态，采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。结果成功建立了兔MSC体外分离及培养扩增的方法。生长动力学分析发现，传代细胞随传代次数的增加其增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强，生长旺盛。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞，第3～5代细胞增殖能力强，可用于进一步的研究工作。     

兔骨髓基质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的：研究兔骨髓基质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC）体外分离、诱导培养及增殖特点,探讨其生物学特性。方法：抽取兔骨髓,密度梯度离心结合贴壁培养法分离BMSC,诱导培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化。倒置显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,免疫组织化学观察Ⅰ型胶原表达,并检测碱性磷酸酶活性及细胞矿化作用。结果：体外培养的兔BMSC贴壁生长,10～14天后形成克隆。细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列,流式细胞仪检测CD34,CD45阴性,CD44阳性。免疫组化可检测到Ⅰ型胶原表达,碱性磷酸酶活性明显增高,并且出现矿化结节。结论：密度梯度离心结合贴壁培养BMSC,操作简单,细胞易于成活,诱导条件下成骨能力肯定,适合作为骨组织工程的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞的分离培养及在精原细胞培养条件下生物学特征的观察

目的体外分离、培养、纯化小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并观察MSCs在精原细胞培养条件下的生物学特征,为体内诱导MSCs分化为精原细胞奠定基础。方法①分离5～6周龄的BALB/c小鼠胫骨、股骨,冲出骨髓,以Percoll密度梯度离心法和贴壁法相结合的方法分离、培养、纯化MSCs;②通过动态观察、苏木精伊红(HE)染色、透射电镜观察、免疫组化检测细胞表面标记等鉴定MSCs;③用ELISA法检测MSCs培养上清中白细胞介素6(IL6)、IL8、粒细胞集落刺激因子(G CSF)、干细胞因子(SCF)等细胞因子的相对含量,与相应对照组比较;④取第3代MSCs,分组进行诱导培养观察,对照组用基本培养液培养MSCs,实验组用条件培养液诱导培养MSCs。通过显微镜下动态观察、HE染色、免疫组化等方法观察诱导结果。结果①获得纯化的MSCs;②动态观察培养细胞具有不断增殖的干细胞特性,HE染色细胞呈梭形,透射电镜观察细胞较幼稚,免疫组化检测细胞表面标记CD44、CD90呈阳性,从而鉴定了MSCs;③MSCs培养上清中IL6、IL8、G CSF、SCF等的含量显著高于对照组(P<0.05);④实验组细胞形态发生变化,CD29、CD117和Oct4免疫组化染色阳性;对照组细胞形态不变,CD29、CD117和Oct4免疫组化染色阴性。结论①用Percoll密度梯度离心法和贴壁法相结合的方法可获得纯化的MSCs;②     

脐血间充质干细胞的分离培养鉴定及诱导分化研究

目的：分离培养人脐血间充质干细胞（human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,hUCB-MSC）,体外观察其生长特性,并在特定条件下诱导分化,探讨其成脂成骨分化能力.方法：采用沉降法和密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,倒置显微镜下观察其形态及生长情况;流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞表面标志物;用茜素红染色和油红0染色分别鉴定其成骨成脂分化能力.结果：纯化的hUCB-MSC贴壁生长,呈均一梭形,具有较强的增值能力,流式细胞仪分析P3代hUCB-MSC稳定表达间充质干细胞表面抗原标志CD73,CD105和CD90等,不表达造血标志CD34和CD45;成骨诱导后3周后细胞茜素红染色阳性;成脂诱导3周后细胞油红0染色阳性.结论：本实验分离的hUCB-MSC具有较强的增殖能力,表达间充质干细胞的表面标记,具有成骨成脂分化潜能.     

Ad-BMP-2/GFP转染兔骨髓间充质干细胞前后生物学特性的研究

目的：对Ad－BMP－2／GFP转染兔骨髓间充质干细胞（ BMSCs ）前后的生物学特性进行观察。方法采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离获取第10代兔BMSCs,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44、CD45、CD29的表达,用携带BMP2和GFP基因的腺病毒转染细胞。分别通过倒置荧光显微镜下观察转染前后细胞形态改变,MTT 法分析转染前后细胞增殖的情况,体外Ⅰ型胶原免疫组化染色和钙结节茜素红染色以观察转染前后细胞的成骨分化情况,Western Blot 检测转染前后细胞内目的蛋白表达。结果密度梯度离心结合贴壁培养法能获取高纯度第10代兔BMSCs ,流式细胞仪检测显示CD44、CD29阳性,CD45阴性。 Ad－BMP－2／GFP转染兔BMSCs后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,细胞形态向成骨方向分化,在短时间内能促进兔BMSCs 的增殖（P＜0．05）,Ⅰ型胶原免疫组化染色、茜素红染色均呈阳性,Western Blot显示细胞内稳定表达BMP－2目的蛋白。结论 Ad－BMP－2／GFP能成功转染兔骨髓间充质干细胞并能改变其生物学特性。     

兔骨髓间充质干细胞在HA/CS支架中的增殖活性

目的:研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在羟基磷灰石(HA)/壳聚糖(CS)复合支架材料中的生长和增殖情况,探讨复合材料与细胞的相容性。方法:穿刺法抽取新西兰大耳白兔骨髓3ml,通过密度梯度离心法获取MSCs,体外贴壁培养,倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态、数量生长情况,描绘生长曲线。将第2代细胞以高密度接种到支架材料中体外三维培养,观察其细胞相容性。结果:经密度梯度离心结合贴壁筛选得到纯化的间充质干细胞,细胞能够连续传至9代以上,第2、5代细胞增殖能力最强。细胞进行体外三维培养时,可在HA/CS复合支架材料上良好的附着、生长和增殖。结论:兔骨髓间充质干细胞能在体外成功培养,HA/CS复合支架与MSCs具有良好的细胞相容性。