弓形虫株保存方法的研究

弓形虫株保存通常采用小鼠腹腔接种传代方法。本文报道含有弓形虫的小鼠腹水在普通冰箱(4℃)和液氮(-190℃)中存活时间的实验研究。 材科和方法     

弓形虫传代和保种方法的探讨

<正> 利用小白鼠进行传代是弓形虫传代和保种最常用和最基本的方法。多年来,我所用该法保存了多株弓形虫,进行了数千次传代工作,取得了良好的效果和有益的经验。本文较详细地介绍了4种用小鼠进行弓形虫传代和保种的方法,并对其优缺点进行了讨论。 为了克服常规小鼠传代法传代间隔短、次数频的缺点,我们将上代感染小鼠腹水的生理盐水稀释液放入4℃冻箱保存,存放10～20天后再转种下代。在25次试验中,转种成功率达97.2％。这种改良后的方法较上述常规传代法节省人力、物力,并可根据工作需要较灵活地掌握传代时间。     

细胞培养和液氮冻存弓形虫的研究

弓形虫只能在活的组织细胞内生长,因而以往多采用小鼠传代保存,但方法繁琐。目前采用细胞培养和液氮冻存技术,有利于弓形虫的分离、培养、保存、抗原制备及探索药物对弓形虫作用等方面的研究,为了对其方法进一步探讨,我们对五种细胞培养弓形虫及液氮冻存虫株进行了研究。 材料及方法 1 弓形虫株 1983年从昆明屠宰场取猪肺接     

4℃冰箱冷藏保存弓形虫速殖子的可行性观察

观察证实,将含弓形虫速殖子的生理盐水液置4℃冰箱冷藏室保存1、2、3、6、12个月,其转种成功率100%,虫子活力无衰减,表明用该法传代保种弓形虫不仅是可行的,而且较之经典的以小鼠频繁传代更具省时、省力、经济、实用的优点.     

弓形虫保种的实验观察

弓形虫保种常用小鼠腹腔转种传代 ,该法费时费力 ,若转种不及时容易断种 ,为解决此问题 ,我们对弓形虫在 4℃存放不同时间后的感染力 ,及应用保护剂在不同温度下存放不同时间后弓形虫的死亡率进行了观察。材料与方法1　 4℃存放对弓形虫感染力的影响弓形虫 RH株引自上海第二医科大学。将虫株接种于普通小白鼠 ,体重约 2 2 g,3 d后 (小鼠死亡前 )用 2 ml无菌生理盐水洗涤小鼠腹腔 ,收集含弓形虫速殖子的腹腔液 ,4℃贮存。弓形虫贮存至 10 d、2 0 d、30 d、40 d、5 0 d和 6 0 d,分别腹腔接种小鼠 (0 .2 ml/只 ,约 2 0 0 0个虫体 ) ,每组 5只…     

4℃冰箱冷藏保存弓形虫速殖子的可行性观察

观察证实，将含弓形虫速殖子的生理盐水液置4℃冰箱冷藏室保存1、2、3、6、12个月，其转种成功率100％，虫子活力无衰减，表明用该法传代保种弓形虫不仅是可行的，而且较之经典的以小鼠频繁传代更具省时、省力、经济、实用的优点。     

蒿甲醚早期治疗实验小鼠弓形虫病的初步观察

弓形虫病是近年来广泛关注的一种人兽共患寄生虫病 ,可引起孕妇流产、胎儿畸形或死胎 ,也是艾滋病等免疫缺陷病患者常见的并发症和致死原因。目前治疗弓形虫病主要采用磺胺类与乙胺嘧啶的联合疗法 ,但该复方的不良反应大、复发率高 ,因此研究寻找高效低毒的新药有重要意义。文献报道 ,青蒿素类对弓形虫有一定的抑制作用[1 3 ] ,本文初步观察了蒿甲醚早期治疗小鼠弓形虫病的效果。1　材料与方法1 .1　虫株　刚地弓形虫RH株 (强毒株 )引自上海市寄生虫病防治研究所 ,小鼠腹腔接种常规传代。1 .2　药物与试剂　蒿甲醚由昆明制药股份有限公司赠…     

弓形虫动物转种条件的研究

弓形虫病是一种人兽共患寄生虫病 ,人群与动物的弓形虫感染率很高。有关弓形虫在实验动物体内传代、虫株分离以及致病力等方面的研究虽有报道 [1～ 3] ,但鼠龄、接种途径对感染小鼠生存时间的影响 ,以及感染时间与收虫数量的关系的报道甚少。为了全面了解弓形虫动物转种的影响因素 ,本文用胰蛋白酶消化与不消化法收集的弓形虫速殖子、不同虫数经不同途径接种 ,以及感染不同龄鼠 ,观察了感染小鼠的存活时间及不同感染时间收虫量的动态变化 ,为弓形虫生物学、免疫学和分子生物学的研究奠定基础。材料与方法1　材料1.1　动物　昆明种小白鼠 ,雌…     

弓形虫慢性感染对小鼠脑内葡萄糖代谢影响的研究

目的探讨弓形虫慢性感染对小鼠脑内葡萄糖代谢的影响。方法将30只SPF级ICR小鼠随机分成弓形虫感染组和正常对照组,感染组每只小鼠口服感染弓形虫PRU株包囊悬液0.3m（l含包囊10个）,对照组口服0.3ml生理盐水。小鼠感染弓形虫6个月后,应用MicroPET扫描脑内葡萄糖代谢,结束后解剖小鼠进行脑组织病理学观察。结果与正常对照组小鼠相比,弓形虫慢性感染6个月后,＂无症状＂的感染小鼠脑内葡萄糖代谢均显著下降,脑组织中可见大小不一、数量不等的包囊,脑膜下有大量淋巴细胞浸润、血管充血、小血管淋巴细胞袖管形成。结论弓形虫慢性感染可造成宿主脑内葡萄糖代谢下降,神经元变性或细胞丢失。     

氯苯胍对体外弓形虫的作用

<正> 氯苯胍(Robenidine简称Rob)是一种广谱高效的抗球虫药物。1973年日本Ito等证实氯苯胍对实验感染小鼠的急性弓形虫病有治疗作用,但至今仅限于疗效观察和临床试验阶段。本实验采用弓形虫的体外细胞培养技术,研究氯苯胍对弓形虫的作用,还将氯苯胍与磺胺6-甲氧嘧啶(SMM)的作用进行比较,现报道如下。 一、材料 弓形虫-GJP株由兰州兽医研究所提供。IB-RS_2传代细胞,系江西省科学院提供,采用1640营养液,按常规细胞培养方法进行。Rob由杭州第三制     

PCR法评价泼尼松龙诱导弓形虫隐性感染小鼠的复发及阿奇霉素对复发的疗效

目的探讨PCR方法诊断泼尼松龙诱导弓形虫隐性感染小鼠复发的敏感性及阿奇霉素对其复发的治疗效果。方法36只20g左右的雌性ICR小鼠以每组6只随机分成正常组（C）、泼尼松龙组（P）、感染弓形虫组（I）、感染弓形虫＋阿奇霉素组（IA）、感染弓形虫＋泼尼松龙组（IP）、感染弓形虫＋泼尼松龙组＋阿奇霉素组（IPA）。0周,I组、IA组、IP组和IPA组小鼠分别经腹腔注射感染Prugniaud株弓形虫包囊10个/只;第6～7周,P组、IP组、IPA组小鼠每只每天后肢内侧皮下注射盐酸泼尼松龙1mg,IA组、IPA组小鼠每只每天按250mg/kg剂量腹腔注射阿奇霉素。分别在0、1、2、3、4、5、6、7周对各组小鼠采血,并萃取全血DNA,通过PCR法扩增弓形虫特异性B1基因。第7周剖杀所有小鼠计数其脑组织弓形虫包囊数。结果相比AF14652基因引物,B1基因引物敏感度更高且特异性好;感染弓形虫前5周的小鼠可以通过PCR方法扩增到B1基因特异性产物,5周后PCR法未能扩增出特异性产物;感染弓形虫激素组（IA）小鼠在使用泼尼松龙2周后小鼠全部死亡,感染弓形虫激素治疗组（IP）小鼠死亡率低（P〈0.05）;相比感染组（I）和感染＋阿奇霉素组（IA）和感染＋泼尼松龙＋阿奇霉素组（IPA）,感染＋泼尼松龙组（IP）小鼠脑组织包囊个数显著增加（P〈0.01）。结论在PCR方法诊断中,B1基因是很好的诊断弓形虫病的目的基因;泼尼松龙能诱导弓形虫隐性感染小鼠的复发并导致小鼠的死亡;阿奇霉素对弓形虫病治疗有效,但不能完全治愈弓形虫病。     

弓形虫感染致实验动物体温异常的实验观察

目的观察急性弓形虫感染对实验动物体温的影响,探讨弓形虫感染后,机体可能出现的新发病体征方法将实验小鼠随机分为3组:1组为空白对照组,另2组分别感染弓形虫RH株和AH株。以恒定的条件测量小鼠体温,同时观察发病情况。结果感染前的小鼠基础体温为37.5~38℃,小鼠感染弓形虫RH株速殖子后第3 d发病,体温即开始下降,每天下降2~3℃,最低降至28℃,动物死亡。AH株感染小鼠第8 d发病,体温开始下降,每天下降1~3℃,最低降至32℃以下,动物死亡,体温下降不低于32℃的动物可渡过低体温期,即急性发病期,得以存活。对照组小鼠体温未发生明显变化。结论体温下降可能是小鼠弓形虫急性感染发病的一个重要体征。     

弓形虫病的血清学诊断研究 Ⅰ.弓形虫速殖子的纯化

本文参照Tsunematsu(1960)及Petrov(1974)方法,用弓形虫猪株和人株感染小鼠收集腹腔液,经胰蛋白酶消化,G_3砂芯漏斗过滤,离心,制备较纯的虫体抗原,并用冻干法长期保存。对数批感染小鼠的腹腔液在处理前、后分别进行虫体和细胞计数,用伊文思蓝液染色鉴别死活。并测定虫体的得量、纯度,存活率和回收率。弓形虫猪株和人株感染小鼠腹腔液经上述处理后平均每只获虫体分别为(7.9±1.3)×10~6和(7.5±1.7)×10~6,两者得量无显著差异(t=0.55,P>0.05);虫体纯度在处理前为0.688±0.18, 处理后为0.993±0.004有显著性差异(t=8.125,P<0.01);虫体存活率在胰蛋白酶消化前为99％,消化后为98.25％;从四批感染鼠腹腔液经处理后虫体回收率为87.5％(t=1.33;p>0.05)。     

高表达毒力因子ROP18的转基因刚地弓形虫株的建立及鉴定

目的构建并鉴定高表达毒力因子ROP18的转基因刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)虫株。方法 RTPCR扩增刚地弓形虫RH株速殖子的ROP18基因片段。将纯化的PCR产物克隆至p CR-BluntⅡ-Topo载体构建p ROP18质粒,PCR扩增ROP18基因序列。将纯化的PCR产物亚克隆至p TUB8-myc GFPPftail-Ty1载体,构建p TUB8-ROP18-Ty1质粒。将质粒电穿孔转染刚地弓形虫RH株,刚地弓形虫悬液转移到长有贴壁细胞的培养瓶中培养,用含25μg/ml霉酚酸和50μg/ml黄嘌呤的DMEM培养基筛选高表达ROP18的刚地弓形虫RH株。免疫荧光和蛋白质印迹(Western blotting)检测ROP18在转基因刚地弓形虫株中的表达。吉氏染色比较弓形虫RH株和高表达ROP18的转基因RH株弓形虫分别感染人包皮成纤维细胞(HFF细胞)的增殖情况。20只昆明小鼠均分为2组,每鼠分别腹腔内注射1×103高表达ROP18弓形虫RH株和1×103弓形虫RH株,统计小鼠存活率。结果 RT-PCR扩增出1 665 bp的ROP18基因序列。经酶切和测序鉴定证明p TUB8-ROP18-Ty1质粒构建成功。Western blotting分析结果显示,高表达ROP18 RH株可表达相对分子质量(Mr)为56 000的蛋白,与ROP18-Ty1蛋白预期结果一致。免疫荧光结果发现,ROP18-Ty1定位于弓形虫前端的棒状体。吉氏染色结果表明,高表达ROP18 RH株弓形虫感染HFF细胞6、12和24 h后的速殖子数量分别为100.0±16.9、476.0±31.1和860.0±52.3,均显著高于RH株弓形虫(88.0±16.9,300.0±11.3,675.0±35.4)(P0.05)。弓形虫毒力实验结果显示,RH株弓形虫感染小鼠在第8天均存活,第14天存活率下降至30%(3/10),至第16天全部死亡;高表达ROP18 RH株弓形虫感染小鼠在第5天均存活,第8天存活率下降至30%(3/10),至第9天全部死亡。结论构建了高表达毒力因子ROP18的转基因弓形虫虫株。     

弓形虫病的血清学诊断研究Ⅰ.抗原的收集与纯化

本文改良Tsunematsu(1960)及Petrov(1974)两者的方法,用弓形虫猪株和人株感染小鼠,收集腹腔液,经胰蛋白酶消化,G_3砂芯漏斗过滤,离心,制备较纯的虫体抗原,并用冻干法长期保存。对数批感染小鼠的腹腔液在处理前、后分别进行虫体细胞计数,用伊文思蓝液染色鉴别死活。并测定虫体的得量、纯度、存活率和回收率。     

弓形虫RH株在实验小鼠脑组织内的动态分布

目的通过观察实验小鼠脑组织内不同部位弓形虫的动态分布,进一步探讨弓形虫感染与血脑屏障的关系,为弓形虫脑病患者的早期诊断和治疗提供帮助。方法弓形虫（RH株）经静脉途径感染小鼠,应用直接涂片法动态观察小鼠脑组织弓形虫感染情况。结果弓形虫感染第8d,小鼠大脑皮质及间脑内查获虫体,第10d,虫体出现于脑干、中脑及海马。结论实验小鼠静脉途径感染弓形虫后,第8d脑内开始出现虫体,但脑组织各部位出现虫体的时间不一致。脑组织不同部位血脑屏障对弓形虫的阻隔作用存在差异。     

β-干扰素在抗弓形虫感染中的作用

本文作者为探索β-干扰素在抗弓形虫感染及弓形虫病治疗上的作用,分别采用体外实验和体内实验的方法来研究。在实验中,选用Swiss Webster,BALB/C,CBA/Ca小鼠作为实验动物,分别从其腹腔液中收集弓形虫RH株、C56株的速殖子和ME49株的包囊、收集腹腔巨噬细胞。然后将小鼠腹腔巨噬细胞与各种浓度的重组鼠β-干扰素(rMuIFN-β)孵育过夜,再感染弓形虫RH株。通过检测感染细胞的百分比     

抗P30 McAb对弓形虫感染的保护性作用

用杂交瘤技术获得抗弓形虫Ｐ３０ＭｃＡｂ,按不同剂量分别与同等数量的弓形虫ＲＨ株（２×１０５／ｍｌ）作用后,经腹腔注射ＢＡＬＢ／ｃ鼠,发现该ＭｃＡｂ对弓形虫感染具保护性作用。ＲＨ株致死量试验显示：每鼠注射１０个虫体,１ｗｋ内死亡率达６２．５％,９ｄ内全部死亡,而在３．００ｍｇ的ＭｃＡｂ保护下注射１０５ＲＨ株虫体的小鼠可在１０ｄ内无一死亡。用目测概率法计算其ＥＤ５０为每鼠１．２３ｍｇ／１０５ＲＨ株虫体。对照组与实验组小鼠存活时间及存活率间经统计学检验均有显著性差异。     

弓形虫感染致实验动物体温异常的实验观察

目的观察急性弓形虫感染对实验动物体温的影响，探讨弓形虫感染后，机体可能出现的新发病体征方法将实验小鼠随机分为3组：1组为空白对照组，另2组分别感染弓形虫RH株和AH株。以恒定的条件测量小鼠体温，同时观察发病情况。结果感染前的小鼠基础体温为37．5～38℃，小鼠感染弓形虫RH株速殖子后第3d发病，体温即开始下降，每天下降2～3℃，最低降至28℃，动物死亡。AH株感染小鼠第8d发病，体温开始下降，每天下降1～3℃，最低降至32℃以下，动物死亡，体温下降不低于32℃的动物可渡过低体温期，即急性发病期，得以存活。对照组小鼠体温未发生明显变化。结论体温下降可能是小鼠弓形虫急性感染发病的一个重要体征。     

VEG株弓形虫卵囊对昆明小鼠的毒力研究

目的探究VEG株弓形虫卵囊对中国昆明小鼠的致病性。方法分别选择1个,100个~108个的VEG株弓形虫卵囊灌胃昆明小鼠,采用MAT、HE和IHC方法研究小鼠对弓形虫的感染情况,并分析小鼠感染率,生存率及其大脑内的弓形虫包囊数量。结果≥10~2个VEG株弓形虫卵囊可引起小鼠100%感染,最低致死剂量为10~2个卵囊,100%致死剂量为108个卵囊,急性期死亡时间为7DPI~14DPI,弓形虫的成囊率是32.14%(9/28),包囊数量为9~857个/只小鼠大脑,感染小鼠生存率为67.44%(29/43),最长存活时间≥390DPI。结论 VEG株弓形虫卵囊对昆明小鼠的毒力中等,包囊形成率较高。