survivin反义寡核苷酸转染对人乳腺癌细胞系MCF 7生长及对长春瑞滨的增敏作用

目的探讨survivin反义寡核苷酸（ASODN）对乳腺癌细胞系MCF 7的诱导凋亡、抑制增殖和对长春瑞滨的增敏作用。方法采用脂质体介导survivin ASODN转染乳腺癌细胞系MCF 7,半定量RT PCR方法检测survivin基因mRNA表达,Western blot方法检测survivin基因蛋白表达,AnnexinⅤ/PI双染法通过流式细胞仪检测细胞凋亡率变化,PI染色通过流式细胞仪检测细胞周期时相变化,MTT比色法检测转染细胞的生长抑制情况及对长春瑞滨的敏感性,电镜观察反义转染对乳腺癌细胞系MCF 7的凋亡诱导作用。结果survivin反义复合物下调MCF 7细胞的survivin mRNA和蛋白表达,并呈剂量依赖性。细胞周期被阻滞于G2/M期,细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）,反义组细胞生长抑制率明显上升（P＜0.05）。透射电镜下转染组细胞呈凋亡晚期变化。600?nmol/L反义转染组长春瑞滨的IC50值为(3.7±0.42)μg/mL,正常组为(7.1±0.68)μg/mL,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论survivin反义寡核酸可有效下调MCF 7的survivin mRNA及蛋白表达水平,抑制增殖,诱导凋亡,并增强其对化疗药物长春瑞滨的敏感性。     

hR24L基因的克隆及逆转录病毒重组体的构建

目的　克隆人类DNA损伤修复基因hR2 4L ,并构建逆转录病毒表达载体重组体 ,为进一步研究该基因的功能及作用机制奠定基础。方法　用PCR法扩增hR2 4L基因的开放阅读框 (ORF) ,然后连接到 pEGM -T载体中 ,经测序验证无突变后 ,再重组到逆转录病毒表达载体 (pDor -neo)中 ,得到正义和反义重组体。 结果　建立了一种有效的基因克隆方法 ,成功地克隆了hR2 4L基因 ,获得了含有重组体的稳定遗传的细胞株。结论　PCR法是克隆hR2 4L基因的有效方法 ,成功构建逆转录病毒表达载体重组体是研究该基因的重要前提     

反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响

目的观察反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响.方法克隆人VEGF基因,将VEGF-cDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA3,构建反义VEGF表达载体pcDNA3-VEGF(-);利用阳离子脂质体载体,稳定转染人喉癌Hep-2细胞,并通过流式细胞仪检测,观察转染细胞细胞周期的改变,在透射电镜下观察转染细胞超微结构的改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况.结果成功克隆了人VEGF基因,并构建了携带反义VEGF基因的真核表达载体pcDNA3-VEGF(-);将其稳定转染人喉癌Hep-2细胞,获得了稳定表达反义VEGF的细胞系,与正常Hep-2细胞相比,该细胞系细胞周期及超微结构均无明显改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,与对照组相比,肿瘤的生长速度明显减缓.结论反义VEGF基因转染可以有效地抑制喉癌的生长.     

基因的miRNA载体构建及其活性鉴定

目的 构建蛋白质精氨酸甲基转移酶2(PRMT2)基因的miRNA真核表达载体,鉴定其转染乳腺癌MCF7细胞株后的生物活性.方法 根据PRMT2基因序列设计合成4对pre-miRNA片段,定向克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体上,采用菌落的PCR和测序分析鉴定插入序列的完整性;并将重组载体转染至MCF7细胞株中,采用Western blot方法鉴定重组载体转染MCF7细胞后对PRMT2蛋白表达的干扰效果以确定其生物活性.结果 构建的重组体插入片段的碱基序列完全正确,并且重组体瞬时定转染MCF7细胞后成功干扰PRMT2的表达.结论 成功构建了靶向PRMT2基因的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体,且在瞬时转染MCF7细胞后能下调PRMT2的表达.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275对乳腺癌MCF7细胞周期作用及分子机制探讨

目的 研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275对乳腺癌MCF7细胞周期的作用及机制.方法 用0.5、1.0、1.5;μmol/L MS-275作用于乳腺癌MCF7细胞24 h,用MTT 法观察不同浓度MS-275对乳腺癌MCF7细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测乳腺癌MCF7细胞生长及周期,Western-blotting法检测MS-275对乳腺癌MCF7细胞周期相关基因表达的影响.结果 1.0 μmol/L的MS-275对乳腺癌MCF7细胞有明显的生长抑制作用,并呈现一定的量效关系,在1.0 μxmol/L浓度之上可明显诱导乳腺癌MCF7细胞周期阻滞,增强p21、p27基因的表达,降低CCNDl、Cdk4D基因的表达.结论 一定剂量MS-275抑制乳腺癌MCF7细胞的生长,细胞阻滞的发生与p21、p27基因表达的增加及CCND1、Cdk4D基因表达的减少相关.     

反义人DNMT1基因对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖和细胞周期的影响

目的 构建表达人DNMT1基因(DNA methyltransferase 1,DNMT1)反义RNA的真核表达质粒,观察其对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖的影响.方法 应用DNA重组技术,将人DNMT1基因的cDNA片段克隆至pcDNA3.1(-)载体中,构建DNMTl反义RNA真核表达质粒,测序验证,将其转染人人乳腺癌细胞系中,利用荧光定量PCR法检测转染前后细胞DN-MT1基因mRNA表达水平的变化;Western blot检测转染后DNMT1蛋白表达变化;应用MTT法检测细胞生长状况,绘制细胞生长曲线;流式细胞术分析细胞周期的变化.结果 成功构建出能够表达DNMT1反义RNA的真核表达质粒.转染该质粒后,与未转染组和转染正义质粒组相比,MDA-MB-435s细胞中DNMT1基因mRNA和DNMT1蛋白表达量均显著下降;细胞生长变慢;细胞周期分析可见S期明显减少,而G1/G0期细胞显著增加.结论 反义DNMT1能够特异性下调该基因的表达,并抑制乳腺癌细胞的增殖,为乳腺癌基因治疗提供了新的靶标.     

β3GalT7基因转染HL-60细胞及对其生物学行为的影响

目的:初步探讨人类β1,3半乳糖基转移酶7(β3GalT7)基因对HL60细胞的细胞周期、侵袭能力等方面的影响。方法:通过脂质体介导将本实验室构建好的β3GalT7真核正义表达载体pEGFP-C1-T7-Sense和反义表达载体pEGFP-C1-T7-AntiSense转染入HL60细胞;流式细胞仪分析各细胞株的细胞周期改变;Transwell侵袭实验检测β3GalT7对HL60细胞侵袭转移能力的影响。结果:随着β3GalT7表达的增高,G2 S期细胞增多,且细胞侵袭能力增强;而转染反义表达载体pEGFP-C1-T7-AntiSense的结果是相反的。结论:过度表达β3GalT7的HL-60细胞株体外增殖和侵袭能力增强。     

chk1反义寡核苷酸增加HeLa细胞顺铂作用下凋亡敏感性

目的:通过反义封闭chk1基因,阻断细胞周期检测点信号传导通路,从而增加宫颈癌HeLa细胞对顺铂(DDP)的敏感性. 方法:采用MTT法检测梯度浓度DDP作用人宫颈癌细胞株HeLa 24,48和72 h后对细胞的生长抑制率. 以脂质体为载体将chk1正义链和反义链转染HeLa细胞,用Western Blot测量Chk1蛋白的表达,用流式细胞仪和TUNEL法检测DDP作用后细胞凋亡率. 结果:DDP对HeLa细胞有生长抑制作用,并有时间和浓度依赖性. 反义封闭chk1基因可抑制Chk1蛋白表达(P＜0.01), DDP作用下细胞凋亡率为54.1%,高于转染正义链的34.2%(P＜0.01). 结论:反义封闭chk1基因可增加HeLa细胞对DDP的凋亡敏感性.     

hTERT反义寡核苷酸对乳腺癌细胞增殖的影响

目的探讨hTERT反义寡核苷酸抑制端粒酶活性对乳腺癌细胞增殖的影响。方法用脂质体介导反义寡核苷酸转染MCF-7乳腺癌细胞株,采用TRAP-ELISA法检测转染后细胞端粒酶的活性,观察其前后的变化。MTT法检测细胞活性,流式细胞仪观察细胞周期及细胞凋亡率变化。结果转染细胞的端粒酶活性及细胞生长都明显受到抑制。流式细胞仪检测到细胞凋亡峰,细胞阻滞于S期,正义寡核苷酸则无此作用。结论端粒酶hTERT为靶点的反义寡核苷酸可明显抑制乳腺癌细胞的增殖,且具有促凋亡作用。     

靶向survivin反义寡核苷酸对MCF-7乳腺癌细胞系survivin mRNA及紫杉醇药物敏感性的影响

目的探讨靶向survivin基因的反义寡核苷酸（ASODN）对MCF 7细胞的增殖、凋亡及药物敏感性等生物学行为的影响。 方法采用脂质体介导survivin ASODN转染MCF-7乳腺癌细胞系,RT-PCR检测survivin mRNA的表达,MTT法检测细胞增殖能力及对药物的敏感性,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。 结果survivin ASODN可有效下调survivin表达水平,抑制细胞的生长,并呈时间剂量依赖关系;流式细胞术示,24h反义转染组细胞周期被阻滞于G₂/M期,细胞凋亡率增加到15.23%。 紫杉醇作用早期（6h）,survivin mRNA 表达增高,利于肿瘤细胞逃避紫杉醇诱导的细胞凋亡,增加肿瘤耐药机会;反义转染组中细胞早期survivin mRNA表达上调受到抑制,对药物的敏感性增加。 结论survivin基因ASODN转染细胞后,下调survivin的表达,细胞凋亡增加,提高了对药物的敏感性。     

GRβ对肾小球系膜细胞糖皮质激素效应的影响

目的:构建糖皮质激素受体β(GRβ)不同表达水平的肾小球系膜细胞株,研究GRβ对肾小球系膜细胞糖皮质激素效应的影响.方法:利用逆转录病毒载体pLXSN将重组GRβ正义和反义基因转入肾小球系膜细胞,经细胞培养、逆转录聚合酶链反应、基因测序和蛋白质印迹分析鉴定所构建的细胞株,应用MTT法和流式细胞术检测细胞内不同表达水平的GRβ对地塞米松的细胞增殖抑制效应和细胞周期变化的影响.结果:构建的肾小球系膜细胞分别有正确的GRβ正义和反义基因整合,转染了GRβ正义基因的肾小球系膜细胞内GRβ蛋白质表达水平明显高于转染了GRβ反义基因者(109.74±10.63 vs.19.08±1.01,P＜0.05);地塞米松对GRβ高表达的肾小球系膜细胞的增殖抑制效率显著低于GRβ低表达的肾小球系膜细胞(18.47%±2.12% vs.60.33%±5.29%,P＜0.05).在地塞米松的抑制下,转染了正义GRβ基因的细胞中,其S期细胞降低程度和G1期细胞升高的程度均明显低于未转染的细胞.结论:肾小球系膜细胞内高表达的GRβ具有拮抗糖皮质激素效应的作用,细胞内GRβ表达水平是决定细胞对激素敏感或抵抗的重要因素.     

外源性p27Kip1基因转染对人乳腺癌MCF-7细胞株细胞周期和增殖的影响

目的：探讨外源性p27Kip1基因对人乳腺癌MCF-7细胞株细胞周期和增殖的影响。方法：应用脂质体转染法将含人野生型p27Kip1基因质粒DNA转染乳腺癌MCF-7细胞,免疫细胞荧光化学方法验证p27Kip1基因转染MCF-7细胞后蛋白表达情况;流式细胞仪检测细胞周期的变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线,观察外源性p27Kip1对乳腺癌细胞MCF-7生长的影响。结果：免疫细胞荧光化学方法证实p27Kip1基因转染MCF-7细胞后存在蛋白表达;流式细胞仪检测结果提示,细胞周期出现G0/G1期阻滞;细胞计数法绘制细胞生长曲线显示细胞增殖明显抑制。结论：外源性p27Kip1基因对乳腺癌MCF-7细胞生长和细胞周期有明显抑制作用。     

曲古霉素A诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡反义cDNA文库的构建和效应基因的初步筛选

目的 构建曲古霉素A诱导人乳腺癌细胞凋亡反义cDNA文库,以筛选曲古霉素A抗肿瘤的效应基因.方法 收集经曲古霉素A处理不同时间点的人乳腺癌细胞MCF-7,提取poly(A)+RNA,将逆转录合成的cDNA反向插入载体PCEP 4中以构建反义cDNA文库.文库DNA随机转入人宫颈癌细胞HeLa中,以转染PCEP 4卒载体细胞为对照组,用200 nmol/L曲古霉素A和200μg/ml潮霉素同时筛选,至对照组细胞全部死亡,文库组仍有存活细胞时停止曲古霉素A筛选.存活克隆扩增后提取Hirt DNA并转化感受态细胞,获得的转化克降扩增后进行酶切鉴定并测序,得到多个EST片段,经生物信息学分析后选择感兴趣的EST片段进行初步功能验证.结果 构建的反义cDNA文库含有2 × 106重组子,重组效率>90%;经DNA测序和生物信息学分析提示第27号存活克隆是锌转运蛋白LIV1,该克隆在功能验证时表现出对曲古霉素A非常显著的抵抗效应.结论构建的反cDNA文库容量较大,质量较高;基因LIV1可能是曲古霉素A抗肿瘤的效应基因之一.     

洛伐他汀对BRCA1高表达MCF-7乳腺癌细胞周期调控蛋白的影响

目的探讨胆固醇合成抑制剂洛伐他汀(lovastatin, LOV)对BRCA1基因高表达MCF-7乳腺癌细胞株细胞周期调控蛋白表达的影响.方法将BRCA1基因进行扩增、鉴定后,运用脂质体转染MCF-7乳腺癌细胞,通过MTT比色法检测细胞增殖功能,RT-PCR方法检测细胞周期调控蛋白cyclinD1、cyclinD3、CDK2、CDK4的mRNA以及Western blot检测cyclinD1、CDK4蛋白表达水平.结果 LOV处理后,细胞的增殖能力减弱,cyclinD1、 cyclinD3、CDK2、CDK4 mRNA表达及cyclinD1、CDK4蛋白表达均降低,其中,以BRCA1基因高表达MCF-7乳腺癌细胞株经LOV处理后变化更为显著.结论 BRCA1基因在LOV诱导的细胞周期蛋白抑制中可能起重要作用,其高表达增强了MCF-7乳腺癌细胞对LOV的敏感性和LOV对乳腺癌细胞的增殖抑制作用.     

RNAi抑制MCF7细胞Lon基因后的生物学效应

目的 通过构建Lon基因表达下调的哺乳动物细胞模型,观察Lon基因对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响.方法 设计针对Lon蛋白酶基因的小干扰RNA(siRNA),构建pSilencer U6 2.1-Lon真核表达载体,并用脂质体法转染人乳腺癌细胞MCF7.RT-PCR法检测Lon基因下调的水平,通过采用高温、紫外线照射、顺铂处理,观察Lon基因下调后细胞敏感性的变化(MTT法);流式细胞术检测siRNA诱导细胞凋亡的作用.结果 RT-PCR显示重组质粒pSilencer U62.1-Lon转染MCF7细胞后,Lon基因明显下调,RT-PCR未见扩增目的条带,细胞培养结果显示细胞增殖能力明显减弱.MTT结果显示,pSilencer U6 2.1-Lon转染的MCF7细胞经紫外线照射和顺铂处理后,增殖能力明显下降,与空载体转染组和未转染组相比有显著差异(P＜0.05).加热应激实验显示,41℃处理后,RNA干扰转染组(pSilencer U6 2.1-Lon)与空载体转染组(pSilencer U6 2.1)、未转染组相比有显著性差异(P＜0.05).而在43℃和45℃时,3组之间均无显著性差异(P＞0.05).流式细胞术检测pSilencer U6 2.1-Lon质粒组细胞凋亡率为(22.47±3.15)%,相对于空载体转染组的(2.3±0.9)%和无质粒转染组的(1.14±0.79)%有明显提高,而空载体转染组和无质粒转染组相比无明显差异.结论 RNAi能有效下调Lon蛋白的表达.Lon基因的下调可抑制乳腺癌细胞MCF7的增殖,诱导细胞凋亡,并可增加MCF7细胞对紫外线和顺铂的敏感性.     

人DNA修复基因hR24L参与细胞周期检定点调控

目的：研究酵母ＲＡＤ２４Ｌ基因功能，克隆人类同源物。方法：分离ＲＡＤ２４基因区域ｒａｄ２４Ｌ突变株，以人的ｃＤＮＡ表达文库转化突变株，筛选回复表型；大剂量Ｘ线照射观察细胞周期。结果：ｒａｄ２４Ｌ对紫外线敏感，从转化文库后的回复表型中克隆出人类ｈＲ２４Ｌ全长ｃＤＮＡ。结论：克隆的人类ＤＮＡ修复基因ｈＲ２４Ｌ，它能校正ｒａｄ２４Ｌ的突变表型，参与细胞周期检定点调控。