人子宫内膜细胞原代体外培养方法

目的改良人子宫内膜细胞原代体外培养方法的建立,并对其进行特征鉴定。方法将选择的子宫内膜组织机械法分离,复合酶消化,传代自然增殖法纯化细胞,进行单层培养。通过倒置显微镜观察其大体形态,HE染色观察其胞核情况,免疫细胞化学染色法对间质细胞(endometrial stromal cell,ESC)及上皮细胞(endometrial glandular epithelial cell,EEC)进行鉴定。结果培养的子宫内膜细胞均有ESC和EEC两种形态细胞。EEC和ESC经角蛋白单抗体和波形蛋白单抗体染色,凡是胞质被染成棕黄色的细胞为阳性细胞。结论成功培养了原代人子宫内膜细胞,方法经济、简单,获得细胞成活率高,生长稳定。成功建立子宫内膜细胞原代体外培养体系,为从细胞和分子水平方面研究子宫内膜的各种功能及干预调节奠定基础。     

小鼠子宫内膜细胞的原代培养与鉴定

目的:建立小鼠围着床期子宫内膜细胞的原代培养,并对其进行形态学鉴定。方法:通过挤压法获取小鼠子宫内膜组织,胶原酶Ⅰ消化,过滤法,进行单层培养。通过倒置显微镜观察其大体形态,免疫细胞化学染色法对间质细胞(ESC)及上皮细胞(EEC)进行鉴定。结果:EEC和ESC经角蛋白抗体和波形蛋白抗体染色,胞质被染成棕黄色的细胞为阳性细胞。结论:成功培养了原代小鼠子宫内膜细胞,方法简便有效,获得细胞成活率高,生长稳定。成功建立子宫内膜细胞原代体外培养体系,为从细胞和分子水平方面研究子宫内膜的各种功能及干预调节奠定基础。     

原代人子宫内膜细胞分离及培养鉴定

目的：探究原代人子宫内膜细胞分离及培养的简易方法,并对其纯度及生物活性进行鉴定。方法采用胶原酶消化人子宫内膜组织,经2次筛网过滤、离心及贴壁纯化技术,分离、纯化培养人子宫内膜间质细胞（ESC ）和腺上皮细胞（EEC ）,用细胞角蛋白（cytokeratin）和波形蛋白（vimentin）免疫细胞化学染色法和免疫荧光方法对所分离的细胞进行鉴定。结果 ESC呈平行生长,细胞呈梭形或多角形,波形蛋白抗体免疫细胞化学染色呈阳性,纯度达95％以上。EEC呈漩涡状生长,细胞呈多角形或蝌蚪形,细胞角蛋白抗体免疫细胞化学染色呈阳性,纯度可达90％。结论应用胶原酶消化法及二次筛网过滤法成功分离并培养数量、活力和纯度高的子宫内膜细胞,可操作性强,可供具备基本细胞培养条件的实验室进行推广。     

人子宫内膜细胞的体外培养技术及鉴定

子宫内膜组织标本来源于行子宫全切术，年龄在４５岁以下诊断为单纯子宫肌瘤的妇女，用胰蛋白酶或胶原酶消化分离子宫内膜细胞并进行原代培养均获得成功，细胞活力达８５％以上。细胞传代１０次，最长生存时间达２个月。培养中利用光镜观察细胞生长及形态，通过电镜及链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶（ＳＰ）免疫组化染色法进行细胞鉴定。     

人妊娠子宫平滑肌细胞的组织块培养及鉴定

目的建立简便有效的人妊娠子宫平滑肌细胞的原代培养方法。方法人妊娠子宫平滑肌组织经剪切后接种,原代培养子宫平滑肌细胞,并通过免疫细胞化学方法检测平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA)进行细胞鉴定。结果培养的细胞呈典型的梭状肌细胞样生长,SMA免疫细胞化学染色为阳性。结论该方法简便经济,可获得状态良好的纯净的子宫平滑肌细胞。     

人子宫内膜细胞纯化方法的研究

目的探讨一种人子宫内膜细胞体外分离培养的方法。方法将离体子宫内膜组织立即放入无菌瓶中,冲洗、剪碎,0.1%Ⅰ型胶原酶消化2h,100目和300目细胞筛分离上皮细胞和间质细胞,分别离心（前者700r/min,离心5min,后者1000r/min,离心10min）,应用含20%胎牛血清的DMEM培养基体外培养,并通过免疫细胞染色进行鉴定。结果胶原酶消化及细胞筛过筛后离心可以完全分离子宫内膜上皮细胞和间质细胞,并分别经角蛋白单抗和波形蛋白单抗组化染色为阳性。结论该方法简单,费用低廉,能达到完全分离子宫内膜细胞的目的。     

人子宫内膜基质细胞及腺上皮细胞的分离纯化和体外培养

目的：建立人子宫正常内膜、内膜异位症在位及异位子宫内膜的基质及腺上皮细胞分离、培养的方法，为进一步研究子宫内膜异位症发生、发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：15例正常子宫内膜、15例在位子宫内膜及10例异位内膜经胶原酶消化、筛网过滤、差时贴壁等技术进行分离、纯化和体外培养，光镜观察，应用鼠抗人波形蛋白抗体、鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体免疫组化染色对间质及上皮细胞进行鉴定。结果：正常子宫内膜和子宫内膜异位症在位子宫内膜标本分离、培养均成功；5例异位内膜标本获得成功．基质细胞和腺上皮细胞纯度均可达95％以上，并均可传代。结论：采用酶解、筛网分离及贴壁能获得纯度较高的基质与腺上皮细胞。人子宫内膜细胞分离体外培养的成功，有助于研究子宫内膜异位症的发病机制．为临床实验提供重要的理论依据．     

改良式筛网法人子宫内膜细胞的分离与纯化

目的探讨改良式筛网法在分离子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞中的应用价值。方法通过高浓度胶原酶结合不同浓度、时间消化、过滤及贴壁纯化等技术,应用筛网分离法培养各15例子宫内膜腺上皮和间质细胞,并传代。结果改良式筛网分离法培养中的15例标本中,腺上皮细胞和间质细胞成功率分别为93.3%和93.3%;分离出的腺上皮细胞及间质细胞可体外培养,经分离纯化后腺上皮细胞纯度>90%,间质细胞纯度>98%;两种细胞经传代后间质细胞成功率92.9%;腺上皮细胞传代培养后活力下降,成功率14.3%。结论通过改良式筛网分离法能获得纯度较高的腺上皮细胞与间质细胞;间质细胞可行传代培养;腺上皮细胞传代培养后活力下降,不宜传代。     

人子宫内膜腺上皮细胞的体外分离培养及纯化

[目的]优化子宫内膜腺上皮细胞的分离培养及纯化技术,以获得经济、数量多、活性好、纯度高的子宫内膜腺上皮细胞,为子宫内膜异位症的研究提供可靠的体外模型。[方法]采用复合酶重复消化、80目筛网单次过滤、低速离心、差时贴壁法处理。[结果]经诊断性刮宫获取的19例标本中,18例腺上皮细胞培养成活,1例失败;腺上皮细胞纯度高达94.2%。[结论]复合酶多次消化、80目筛网单次过滤、低速离心、差时贴壁法培养子宫内膜腺上皮细胞,可以获得经济、数量多、活性好、纯度高的细胞。     

人子宫内膜基质细胞的分离纯化和体外培养方法研究

目的：分离和纯化人子宫内膜基质细胞用于宫腔粘连发病机制的研究。方法通过二次酶消化、一次网筛和差时贴壁等方法,分离和纯化人子宫内膜基质细胞,体外培养传代,通过免疫组织化学法进行细胞表型鉴定。结果基质细胞在接种后30 min开始贴壁,可见梭形和多角形2种形态的细胞。免疫组织化学显示这2种细胞具有波形蛋白免疫反应性,反应率可达95％以上,而细胞角蛋白无免疫反应性,提示其为来源于内膜基质的基质细胞。分离出的子宫内膜基质细胞可以在体外进行增殖。结论采用二次酶消化、一次网筛和差时贴壁纯化等方法,可成功分离人子宫内膜基质细胞,且基质细胞可以有限的传代。     

人子宫内膜间质细胞的体外培养

目的：建立分离培养符合实验要求的人在位及异位子宫内膜间质细胞的方法,为进一步探讨子宫内膜异位症发生、发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：胶原酶消化在位和异位内膜组织,进行原代培养,胰蛋白酶消化法传代培养,光镜、免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果：角蛋白、波形蛋白染色证实细胞纯度达95%以上。 结论：胶原酶消化法简便易行,可获得符合实验要求的人子宫内膜间质细胞,可以用于子宫内膜异位症发病机制、药物筛选等研究。     

大鼠嗅球成鞘细胞的分离、培养与鉴定

目的：探讨大鼠嗅球成鞘细胞（Olfactory cnsheating cells,OECs）分离与培养的方法。方法：无菌条件下嗅球置于少量人工脑脊液中，用眼科镊子直接将嗅球撕烂、挤压，得片状组织块，胰酶消化，吹打，细胞悬液进行培养。结果：本方法分离、培养的OECs具有双极或多极突起，且突起十分细长，神经生长因子受体和胶质纤维酸性蛋白免疫组化呈阳性。结论：该方法简便易行，为深入研究OECs神经生物学特性、阐明促进中枢神经元轴突生长的作用机制打下基础。     

小鼠子宫内膜上皮细胞的分离和原代培养

目的 建立一种高效的子宫内膜上皮细胞分离和体外培养方法,为子宫疾病的发病机制或治疗药物筛选的进一步研究提供一个比较理想和有价值的的实验模型.方法 用酶消化、过滤、离心与差速贴壁纯化相结合的方法分离培养小鼠子宫内膜上皮细胞,以上皮细胞角蛋白为抗原的免疫荧光法对分离培养的细胞进行纯度鉴定.结果 小鼠子宫内膜上皮细胞培养4～...     

人表皮干细胞的快速分离培养及鉴定

目的探讨人表皮干细胞的体外快速分离和培养方法。方法运用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离获得表皮干细胞。分离的表皮片经表皮干细胞培养基(ESCM)悬浮,接种于IV型胶原包被的培养板中,37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱内静置培养10min,留用贴壁细胞;Ⅳ型胶原黏附、分离并富集后继续培养。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况;检测细胞克隆形成率及克隆维持时间;免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达。以角质形成细胞作为对照。结果组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞,且克隆维持时间较长;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及Kl9均呈阳性表达。结论运用Ⅳ型胶原黏附结合ESCM培养可以实现人成体表皮干细胞的快速分离和培养。     

小鼠子宫内膜的组织培养

目的:建立小鼠子宫内膜的体外培养方法.方法:用挤压法获得子宫内膜,在添加200 mL/L胎牛血清(FBS),17.5 nmol/L胰岛素,63.5 nmol/L孕酮(P4),7.14 nmol/L雌二醇(E2)的F12/DMEM(1:1)培养液和50 mL/L CO2 950mL/L空气界面进行培养,比较分析20μg/L表皮生长因子(EGF)和50 mL/L CO2 950 mL/L O2气体条件对子宫内膜维持的影响.HE染色,图像分析系统检测样本坏死率,并用SP法检测培养前后子宫内膜中白血病抑制因子(LIF)及类肝素结合样表皮生长因子(HB-EGF)的表达.结果:三组子宫内膜的坏死率(%)分别为19.40±3.38,16.41±3.40和13.71±2.89,其差异有显著性(P=0.000);LIF及HB-EGF在培养前后小鼠子宫内膜的阳性表达率均为100%,且同一指标在培养前后子宫内膜的阳性强弱分布无显著性差异(P分别为0.237,0.224).结论:添加200 mL/L FBS,63.5 nmol/LP4,7.14 nmol/L E2,17.5 nmol/L胰岛素和20μg/L EGF的F12/DMEM(1:1)培养液和50 mL/L CO2 950 mL/L O2的气体环境最有利于小鼠子宫内膜的体外培养;子宫内膜在上述条件下培养24 h后,对囊胚仍具有容受性.     

Wistar大鼠骨髓源性神经干细胞分离与培养及其鉴定

目的分离、培养和鉴定Wistar大鼠骨髓源性神经干细胞。方法从Wistar大鼠骨髓组织中分离骨髓源性神经干细胞,采用无血清培养技术进行培养、传代,应用免疫细胞化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果分离培养获得大量悬浮生长的细胞团,该细胞具有连续增殖的能力,并能分化为神经元和神经胶质细胞。结论 Wistar大鼠骨髓组织中可成功分离培养神经干细胞,该细胞在体外适宜的条件下能够大量增殖,并具有多向分化潜能。     

人羊膜来源间质干细胞的分离、培养及鉴定

目的:探讨来源于人羊膜间质干细胞(amniotic-derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs)的分离、培养及鉴定.方法:无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的羊膜剪成碎片,加入胰酶37℃消化30 min,共2次,然后加入终浓度1.0 g/L的胶原酶和0.1g/L的DNA酶,37℃消化60 min,收集细胞,用含体积分数为10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基进行培养和纯化.倒置显微镜观察细胞形态,取4～6代的细胞用流式细胞仪分析细胞表面标志,取扩增第3代后的AD-MSCs加入全反式维甲酸(RTRA)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)向神经元样细胞诱导分化.结果:来源于羊膜的细胞种植于DMEM/F12培养基中后,可在体外大量扩增并纯化;流式细胞检测显示:CD29、CD44、HLA-ABC阳性表达,CD34、CD45、HLA-DR阴性表达.免疫细胞化学显示AD-MSCs经RTRA和bFGF诱导后表达神经元特异性烯醇化酶,不表达胶质纤维性蛋白.结论:羊膜中存在间质干细胞,其可以在体外培养、扩增、纯化,并可在体外向神经元样细胞分化.     

人在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的原代培养

目的:探讨在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养方法,为研究子宫内膜异位症的发病机制提供体外细胞模型.方法:通过消化、过滤、沉降等方法,分离培养正常对照子宫内膜以及子宫内膜异位症在位、异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞,模拟人体内雌激素水平研究促进细胞生长的方法,光学显微镜观察离体细胞形态.结果:正常对照子宫内膜细胞分离培养成功率达91.7%(11/12),子宫内膜异位症在位子宫内膜细胞成功率为93.8%(15/16),子宫内膜异位症异位子宫内膜细胞成功率为75.0%(12/16).间质细胞传代2次后,生长缓慢,经雌激素作用后,生长明显改善;腺上皮细胞不能传代,经雌激素作用后,生长改善不明显.结论:体外分离培养的人子宫内膜细胞比子宫内膜异位动物模型更接近于人体的特点,在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养可作为研究子宫内膜异位症的体外细胞模型之一.