棉酚对睾丸支持细胞间隙连接蛋白表达的影响

目的:探讨药物棉酚对睾丸Sertoli细胞间隙连接蛋白Cx43表达的影响。方法:培养TM4睾丸Sertoli细胞,用1.25、2.5、5、10μmol/L的棉酚分别染毒细胞6、12、24、48 h。CCk-8试剂盒检测细胞毒性,应用细胞免疫荧光化学、RT-PCR检测Cx43在正常TM4细胞和在不同浓度及不同染毒时间的TM4细胞中的表达情况。结果:半定量RT-PCR及免疫荧光结果显示,正常TM4细胞中有较多的Cx43表达;棉酚染毒24 h后,Cx43 mRNA水平开始随时间增加而逐渐下降(P<0.05),且随剂量增加Cx43蛋白表达强度逐渐减弱(P<0.05)。结论:棉酚可抑制TM4细胞表达Cx43,可能是其抗生育的机制之一。     

大鼠睾丸支持细胞溶酶体的周期性变化

作者在透射电镜下观察了大鼠精子发生过程中支持细胞（Ｓｅｒｔｏｌｉ细胞）中溶酶体的结构及分布的改变。结果Ｓｅｒｔｏｌｉ细胞中溶酶体数目多，在细胞中所处的位置有周期性变化，细胞中全部胞质和在基底部胞质中溶酶体的截面积占胞质截面积的比例在生精第ＶＩＩ阶段最大，近腔部溶酶体截面积占胞质截面积在第ＩＩ、ＩＸ阶段最小；Ｓｅｒｔｏｌｉ细胞总胞质和在基底部单位胞质截面积的溶酶体数在第ＶＩＩ阶段最大，近腔部单位胞质截面积溶酶体数在顶体期后几阶段最大，第ＩＸ阶段最小。Ｓｅｒｔｏｌｉ细胞溶酶体的周期性变化是与生精细胞相互影响、相互作用，也是精子连续正常发生的前提条件之一。     

枸杞、黄芪对大鼠睾丸支持细胞功能的影响

目的:探讨中药枸杞、黄芪对大鼠睾丸支持细胞(Sertoli细胞)功能的作用及机制。方法:对18~22 d的SD大鼠睾丸Sertoli细胞进行分离培养,用MTT法检测枸杞(50、100、200、400μg/m l枸杞多糖)、黄芪(12.5、25、50、100 g/L黄芪提取液)对Sertoli细胞增殖的影响,用一步法RT-PCR方法检测枸杞、黄芪对正常培养状态和过氧化物(H2O2)损伤状态下Sertoli细胞抑制素(INH)βB亚基转录的影响。结果:高浓度枸杞(400μg/m l)、黄芪(100 g/L)对Sertoli细胞的增殖有促进作用(P<0.05),高浓度杞芪合剂(400μg/m l枸杞+100 g/L黄芪)对Sertoli细胞增殖有明显促进作用(P<0.01);在正常培养状态下,枸杞、黄芪及杞芪合剂对Sertoli细胞INHβB亚基的转录具有明显促进作用(P<0.01);在过氧化物(H2O2)损伤状态下,Sertoli细胞INHβB亚基的转录明显降低(P<0.01),黄芪对Sertoli细胞INHβB亚基的转录水平具有上调作用(P<0.05),枸杞、杞芪合剂对其转录水平具有明显上调作用(P<0.01)。结论:枸杞、黄芪及杞芪合剂对体外培养的Sertoli细胞INHβB亚基的转录具有促进和保护作用。     

双酚A对大鼠睾丸支持细胞糖代谢的影响

目的:观察不同浓度双酚A(BPA)对原代培养大鼠睾丸支持细胞(SC)糖代谢及乳酸脱氢酶(LDH)表达的影响,探讨BPA致男性不育的机制。方法:采用两步酶消化法分离雄性Wistar大鼠睾丸SC,建立SC原代培养模型,免疫组化鉴定Fas L。传代后SC随机分为对照组和实验组(100 nmol/L、10μmol/L和1 mmol/L BPA)。培养48 h后,CCK-8法测定细胞增殖活性,核磁共振波谱法测定细胞内代谢物浓度,RT-PCR及Western印迹检测LDH的表达。结果:体外分离培养SC的纯度为(96.05±1.28)%(n=10),CCK-8实验结果显示:与对照组相比,暴露于100 nmol/L BPA组[(98±8)%]、10μmol/L BPA组[(96±3)%]和1 mmol/L BPA组[(95±3)%]的细胞增殖率无明显变化(P0.05);核磁共振波谱显示:与对照组相比,10μmol/L和1 mmol/L BPA作用下SC内葡萄糖及乳酸浓度明显降低(P0.05);RT-PCR及Western印迹结果显示:LDH mRNA的表达随BPA浓度升高呈现降低趋势(100 nmol/L、10μmol/L及1 mmol/L组P均0.05),而LDH蛋白的表达只在1 mmol/L组明显降低(P0.05)。结论:较高浓度BPA降低LDH,影响SC糖代谢过程。推测BPA通过影响SC糖代谢,减少向生殖细胞乳酸的供给,影响精子发生过程。     

壬基酚对体外培养大鼠睾丸间质细胞分泌雄激素影响的研究

目的:探讨壬基酚(NP)对大鼠睾丸间质细胞分泌雄激素的影响。方法:建立体外培养大鼠睾丸间质细胞原代培养体系,并采用3β-HSD染色对间质细胞进行鉴定;以不同浓度的NP(分别为较低浓度0.005、0.015、0.025、0.05、0.1μmol/L及稍高浓度0.5、5.0、10.0、15.0、25.0μmol/L)作用于间质细胞,采用3β-HSD染色观察间质细胞形态的变化,并检测间质细胞分泌睾酮含量的变化。结果:间质细胞经NP处理后,细胞形态发生变化,细胞密度降低,NP作用浓度达到25μmol/L时,细胞发生裂解。0.005及0.015μmol/L NP处理后,间质细胞睾酮分泌量增加,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。NP浓度达到0.5μmol/L后,睾酮分泌量与对照组相比显著下降(P<0.05),且当NP浓度为5,10,15,25μmol/L时睾酮分泌量下降极为明显(P<0.01)。结论:低浓度NP能促进间质细胞分泌睾酮,而高浓度NP抑制睾酮分泌,且高浓度NP能诱导间质细胞坏死。     

大鼠睾丸Leydig细胞的培养和鉴定

目的:研究体外培养大鼠睾丸Leyd ig细胞的有效方法。方法:原代培养大鼠睾丸Leyd ig细胞,用4 U/m l人绒毛膜促性腺激素(hCG)作用细胞,对照组未用hCG,放射免疫法测定培养液中睾酮浓度,3β羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)免疫组化染色观察睾丸Leyd ig细胞形态和生物学特性。结果:培养细胞成分均一、增殖旺盛、分化率高。接种72 h后大鼠睾丸Leyd ig细胞纯度达95%。接种后24 h内,hCG刺激组较对照组睾酮分泌量明显提高(P<0.05)。结论:体外培养的睾丸Leyd ig细胞可分泌高浓度的睾酮;睾丸Leyd ig细胞的纯化和培养方法的建立,可为中老年男性雄激素部分缺乏综合征睾酮替代治疗的基础和临床研究提供一条可行的思路。     

氯烯雌酚醚对雌性大鼠去势后骨密度的影响

目的 确定氯烯雌酚醚对去势雌性大鼠骨密度及子宫重量的影响。方法 鼠龄70d的Wistar雌性大鼠48只，分别给予假性手术与注射用油(SV组)、去势与注射用油(OV组)、假性手术与氯烯雌酚醚(SE组)及去势与氯烯雌酚醚(OE组)处理，双侧卵巢去势或假性手术后7d，天每晚腹腔注射氯烯雌酚醚或注射用油4ml／kg，共45d。处死大鼠时，测定子宫湿重，同时收集右股骨、右胫骨及第1腰椎，行骨密度测定。结果 4组间子宫重量差异均有显著性。骨密度显示：(1)OV与SV、SE及OE间差异有显著性；(2)OE、SE与SV间差异无显著性。结论 氯烯雌酚醚能抑制雌性大鼠去势后的骨量丢失，减缓去势后的子宫萎缩，对骨骼有雌激素样的保护作用。     

局部高温对青春期前大鼠睾丸支持细胞波形蛋白的影响及其与生精细胞凋亡的关系

目的:探讨局部高温对青春期前大鼠睾丸支持细胞波形蛋白表达和分布的影响及其与生精细胞凋亡的关系。方法:选取青春期前SD大鼠40只,随机分为对照组8只和实验组32只,实验组按热处理后2、4、12、24h均分成4个亚组;通过对睾丸局部高温(43℃水浴15min)处理,对照组以22℃水浴15min处理,采用组织化学和免疫组化方法,分析高温对青春期前大鼠生精小管细胞形态结构、支持细胞波形蛋白表达与分布的影响,采用TUNEL法检测各组生精细胞凋亡情况。结果:与对照组比较,高温处理后2h及4h即可见生精细胞与支持细胞发生分离,且自基膜脱落至管腔,数目逐渐增多;免疫组化发现,对照组波形蛋白沿基膜形成环样并随支持细胞胞质向管腔伸展分布,2h组波形蛋白围绕支持细胞核周分布,伸至管腔的蛋白表达减少或消失,其表达量与对照组比较无差别,12h及24h组与对照组比较差异有显著性(P<0.01);凋亡检测表明,12h及24h组生精细胞凋亡明显增加,而2h及4h组生精细胞凋亡与对照组比较反而减少。结论:高温可导致支持细胞波形蛋白的表达增多及分布变化,其改变与生精细胞凋亡有密切关系,高温可能通过直接作用于支持细胞而破坏生精过程。     

大鼠睾丸支持细胞对骨髓问充质干细胞免疫抑制作用的影响

目的探索睾丸支持细胞（Sertoli细胞）对骨髓间充质干细胞（BMSC）免疫抑制作用的影响,为二者在移植免疫中的联合应用提供思路。方法二步酶解法处理大鼠睾丸,分离Sertoli细胞;Percoll法分离大鼠BMSC;Ficoll法分离淋巴细胞;刀豆蛋白A（ConA）刺激进行T细胞转化试验;将Sertoli细胞、BMSC和Sertoli细胞＋BMSC分别加入未经ConA处理的静止淋巴细胞培养体系和经ConA处理后的T细胞转化体系,MTT法测定淋巴细胞增殖情况,观察BMSC、Sertoli细胞或二者共培养对T细胞活化、增殖的影响。结果 BMSC、Sertoli细胞以及二者共培养对静止的淋巴细胞无明显作用。BMSC、Sertoli细胞及二者共培养对T细胞的活化、增殖均有明显的抑制作用,且Sertoli细胞与BMSC共培养时抑制作用呈现一定的协同性。结论 BMSC和Sertoli细胞均具有负性免疫调节作用,二者共培养可以进一步增强BMSC的免疫抑制效应。     

不同温度下体外大鼠睾丸支持细胞胶质细胞源性神经生长因子的表达

目的:通过观察不同温度下体外大鼠睾丸支持细胞(Sertoli cell,SC)胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)表达特点,探讨高温致不育的机制。方法:采用组合酶消化法和选择性贴壁法分离雄性Wistar大鼠睾丸SC,将分离的SC分别置于不同温度进行体外培养,观察其贴壁、形态学变化,FasL免疫组化鉴定。实验分为对照组(35℃)、实验组(36℃、37℃、38℃、39℃)。CCK-8法检测SC增殖情况,HE染色观察细胞形态及结构,RTPCR、免疫荧光及Western印迹检测细胞GDNF的表达。结果:本实验条件下,体外分离培养SC纯度=(95.30±2.15)%(n=10),CCK-8实验结果显示,36℃时细胞增殖率最高(P0.01),36℃时,随着温度的提高,增殖率逐渐降低,39℃对细胞增殖具有明显抑制作用(P0.01);免疫荧光结果显示,GDNF表达于SC胞质,36℃时荧光最强,RT-PCR及Western印迹检测结果显示,高于36℃时,GDNF mRNA及蛋白的表达随着温度的增加而降低,36℃、37℃、38℃、39℃4组与对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:不同温度下,体外培养SC的增殖能力和GDNF表达明显不同。36℃时,随着温度的提高,增殖能力受到抑制,GDNF表达水平显著降低。本研究结果证实,高温下大鼠睾丸SC正常功能受到抑制,从而影响生精功能。     

Selected Enzyme Histochemistry of Sertoli Cells 1. Immature Rat Sertoli Cells in Vitro

Sertoli cells were collected from the testes of 21 day old, sexually immature Wistar rats. The cells were then incubated for 10 or 14 days in culture medium with or without the addition of FSH. This time period corresponds to the time period in vivo when rat Sertoli cells undergo active differentiation with concomitant histochemical and morphological changes. Cells cultured 10 and 14 days after initial plating were processed for the histochemical detection of three esterases and four dehydrogenases by observing relative staining intensities of azo dye precipitation and formazan reaction product, respectively. Appropriate controls were established. The presence of FSH mildly increased the staining activity of LDH, SDH and G-6-PDH in both 10 and 14 day cultured cells. However, SDH staining intensity/cell did not increase to surpass LDH staining intensity/cell as it does in vivo during this period of time. Addition of FSH also slightly increased staining of non-specific esterase. Type B esterase and 3 beta-ol DH activity was not evident in 10 and 14 day cultured cells, even in the presence of FSH. Our results indicate that, based on histochemical parameters, immature Sertoli cells do not mature in culture commensurate with the cell in vivo.     

Selected Enzyme Histochemistry of Sertoli Cells 2. Adult Rat Sertoli Cells in Co-culture with Peritubular Fibroblasts

Summary: Sertoli cells and peritubular fibroblasts were collected from sexually mature Wistar rats and incubated by themselves (ASC) or in co-culture (AS/PC) for ten days with or without follicle stimulating hormone (FSH). Freshly collected cells and those of the ASC and AS/PC cultures were processed for histochemical detection of three esterases and four dehydrogenases. The relative staining intensities of azo dye and formazan reaction products were recorded for the cell cultures, co-cultures and appropriate controls. Freshly collected Sertoli cells stained heavily for lactic dehydrogenase (LDH), succinic dehydrogenase (SDH), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PDH), non-specific esterase (Est.) and 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-OLDH). For Sertoli cells alone in culture (ASC) there was a marked decline of enzyme reaction product deposition/cell for LDH and Est. and absence of cellular staining for SDH, G-G-PDH, B-Est. and 3β-OLDH. The addition of FSH did not change this histochemical staining pattern for the adult cells in vitro. The presence of peritubular cells in adult Sertoli cell cultures (AS/PC) resulted in the maintenance of metabolic enzyme staining (i.e., LDH, SDH, G-6-PDH and Est.) in Sertoli cells, minimal staining for B-Est., but absence of detectable enzyme reaction product for 3β-OLDH. Sertoli cells co-cultured with other fibroblasts or in medium pre-conditioned with peritubular cells but not containing them stained minimally for LDH and Est. and did not generate reaction product for any of the other enzymes. The addition of FSH to the AS/PT co-culture as in the ASC cultures did not affect the enzyme histochemical staining profile of Sertoli cells. Results indicate that direct contact with peritubular cells provides specific positive support for the general metabolic state of adult Sertoli cells in vitro and that in addition to peritubular cells, factors other than FSH are necessary to provide a complete micro-environment for maintaining the fully differentiated state of adult Sertoli cells in culture. Zusammenfassung: Sertolizellen und peritubuläre Fibroblasten wurden von sexuell ausgereiften Wistar-Ratten entnommen und allein (ASC) oder in Cokultur (AS/PC) über 10 Tage mit oder ohne FSH inkubiert. Frisch gewonnene Zellen und diejenigen aus den ASC- und AS/PC-Kulturen wurden der histochemischen Untersuchung der drei Esterasen und vier Dehydrogenasen zugeführt. Die relativen Färbeintensitäten der Azo-Färbung und der Formazan-Reaktion wurden für die Zellkulturen, die Cokulturen und entsprechende Kontrollen dokumentiert. Frisch gewonnene Sertolizellen zeigten eine starke Färbung in Bezug auf Laktatdehydrogenase (LDH), Succinyldehydrogenase (SDH), Glukose-6-Phos-phat-Dehydrogenase (G-6-PDH), nichtspezifische Esterase (Est.) und 3beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3β-OLDH). Für Sertolizellen allein in Kultur (ASC) zeigte sich eine deutlich verminderte Ablagerung von Enzymreaktionsprodukten pro Zelle für LDH und Est. und das Fehlen der Zellfärbung für SDH, G-6-PDH, B-Est. und 3β-OLDH. Die Zugabe von FSH veränderte das histochemische Färbemuster der ausgewachsenen Zellen in vitro nicht. Die Anwesenheit von peritubulären Zellen in den Kulturen der adulten Sertolizellen (AS/PC) bewirkte, daß die metabolische Enzymfärbung (i.e., LDH, SDH, G-6-PDH und Est.) blieb, daß sich β-Est. nur minimal anfärbte und daß Enzymreaktionsprodukte für 3β-OLDH nicht gefunden werden konnten. Sertolizellen, die mit anderen Fibroblasten zusammen oder in einem Medium, das mit peritubulären Zellen vorbehandelt wurde, diese aber nicht enthielt, kultiviert wurden, zeigten eine minimale Anfärbbarkeit für LDH und Est., nicht jedoch für eines der anderen Enzyme. Gibt man ebenso wie zu den ASC-Kulturen zu den AS/PT Cokulturen FSH zu, so zeigt sich keine Veränderung des enzymhistochemischen Färbemusters der Sertolizellen. Die Ergebnisse zeigen, daß der direkte Kontakt mit peritubulären Zellen eine spezifische Unterstützung der allgemeinen metabolischen Situation adulter Sertolizellen in vitro bewirkt und daß zusätzlich zu den peritubularen Zellen andere Faktoren als FSH nötig sind, um eine vollständige Mikroumgebung zu schaffen, um den hochdifferenzierten Status der adulten Sertolizellen in Kultur zu bewahren.     

支持细胞体外培养研究进展

总结了支持细胞 (Sertolicell,Sc)原代培养的 3种方法 :Sc分离培养、生殖细胞 Sc共培养及组织培养 (器官培养 )。采用胰蛋白酶、胶原酶及透明质酸酶等消化方法从动物睾丸分离Sc ,将纯化的Sc平铺在Matrigel包被的培养皿中作体外原代培养 ,培养基通常为 1∶1(vol/vol)无血清Ham sF12营养液和Dulbecco改良Eagle培养基 (DulbeccomodifiedEaglemedium ,DMEM) (F12 /DMEM)。培养条件 :5 %CO2 、35℃。生殖细胞 Sc共培养可模拟体内精子发生的微环境 ,用于研究生殖细胞与Sc之间的相互作用。同时也总结通过转基因动物建立的永生Sc株 ,该细胞具有与真正Sc一样的某些特征     

大鼠SERTOLI细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化的影响

目的探索Sertoli细胞(SCs)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂、成骨和成神经诱导分化的影响。方法密度梯度离心法分离BMSCs,二步酶消化法分离SCs;对第3、4代BMSCs进行成脂、成骨及成神经诱导,并与SCs共培养,观察其形态学变化。结果油红O染色显示BMSCs成脂诱导后,胞浆出现折光性强的脂滴,加入SCs后,脂滴明显减少,染色不明显;茜素红S染色显示BMSCs成骨诱导后可显示钙结节,加入SCs后,钙结节更多,结节内红染更明显;成神经诱导在加入SCs前后没有明显差异。结论 SCs可促进BMSCs成骨分化,而抑制其成脂分化,对成神经分化则没有明显影响。     

雌激素对青春期大鼠Sertoli细胞及血睾屏障的影响

目的:研究在Sertoli细胞分化和成熟阶段,外源性雌激素对Sertoli细胞FasL表达以及血睾屏障的影响,进一步讨论影响血睾屏障的相关因素及其可能机制。方法:体内体外分别给与青春期SD大鼠大剂量的雌激素(二乙烯雌酚和雌二醇),运用免疫荧光方法和Western印迹观察Sertoli细胞内FasL的表达以及电镜下血睾屏障结构的变化。结果:外源性大剂量雌激素作用下,Sertoli细胞内FasL表达量明显增强(P<0.05);同时出现Sertoli细胞膜和生精上皮血睾屏障部位FasL的表达量上升;在18d实验组,电镜显示示踪剂镧透过血睾屏障,到达生精上皮全层。结论:外源性大剂量雌激素能使Sertoli细胞内FasL的表达量和分布区域发生改变并影响血睾屏障的结构。     

睾酮对体外大鼠阴茎海绵体组织细胞增殖的影响

目的:探讨睾酮对雄性SD大鼠阴茎海绵体组织细胞增殖的影响。方法:无菌条件下获取大鼠阴茎海绵体组织,免疫组化法检测其雄激素受体的表达,再分别采用酶消化法培养平滑肌细胞和贴壁法培养成纤维细胞,用四氮唑蓝(MTT)还原法观察对照组及睾酮10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L、10-3mol/L浓度组对海绵体组织细胞增殖的影响。结果:雄激素受体在大鼠阴茎海绵体组织表达,10-5mol/L睾酮刺激可促进大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞和成纤维细胞增殖,MTT还原法测定分别为68100±2200和70200±1300(P<0.05);10-4mol/L睾酮刺激可抑制平滑肌细胞和成纤维细胞增殖,MTT法测定A值为分别55000±1400和59100±1500(P<0.01);其他组作用不显著。结论:大鼠阴茎海绵体组织存在雄激素受体,睾酮可经雄激素受体途径对阴茎海绵体组织细胞增殖的产生影响,不同浓度睾酮可促进或抑制海绵体平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖。     

大鼠脂肪干细胞体外诱导成平滑肌样细胞的研究

目的:研究大鼠脂肪干细胞(ADSCs)体外单层培养条件下诱导分化为平滑肌样细胞的可行性。方法:从SD大鼠的腹股沟脂肪垫分离获取脂肪干细胞,测定其生长曲线。取第4代细胞用成脂诱导液诱导分化,并用油红O染色鉴定。取第4代细胞用成骨诱导液诱导分化,并用Von Kossa染色鉴定。取第4代细胞用含有β-巯基乙醇的成平滑肌诱导液诱导,并用免疫组化的方法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果:脂肪干细胞成梭形和多角形,体外生长迅速,生长曲线表明传代2 d后细胞进入对数生长期。第4代细胞成脂诱导后,油红O染色证实细胞内存在脂滴;成骨诱导后,Von Kossa染色证实有矿化结节。脂肪干细胞诱导平滑肌样细胞免疫组化结果,β-巯基乙醇诱导组和未诱导组细胞α-SMA的表达阳性率分别为(29.80±6.89)%、(2.89±1.24)%。诱导组细胞α-SMA的表达阳性率高于未诱导组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:脂肪干细胞经诱导后出现明显的平滑肌细胞特征,可成为平滑肌相关疾病在组织工程研究上新的种子细胞来源。     

An assessment of inhibin-like activity secreted by Sertoli cells in culture using castrated adult male rats

Sertoli cells isolated from testes of 16–18 days old male rats were maintained in culture. Incubation media from these culture were pooled on day 7 and tested for its inhibin-like activity either with (SCCM) or after charcoal treatment (CSCCM) in castrated adult male rats. The assay was based on the tacit assumption that SCCM or CSCCM would specifically lower circulating blood serum levels of FSH. Subcutaneous (sc)injections of CSCCM at a dose level of 1 mg protein per rat, per day, x 3 days caused a specific suppression of FSH levels, while lower dosages of CSCCM (Protein content of 300 μg or 600 μg/rat/day, x 3 days) were without any affect on basal levels of FSH and LH. SCCM was ineffective at all dose levels tested. Intracardiac injections of varying doses of LHRH (25 to 400 ng/rat) to CSCCM pre-treated rats (200 μg/rat/day, x 3 days) failed to increase the levels of LH and FSH. These results support the presence of inhibin like activity in SCCM by a bioassay procedure alternate to in vitro pituitary cell culture system used by other investigators.