登革病毒2型感染BALB/c小鼠的IL-4、IFN-γ产生动态观察

目的 :探讨登革病毒 2型 (DEN2 )临床分离株感染BALB/c小鼠后其血浆中IL 4、IFN γ产生动态及相关关系。方法 :用不同剂量DEN2临床分离株经皮下多点注射 ,建立BALB/c小鼠感染模型 ,并用双抗体夹心ELISA法检测感染后不同时间各组动物血浆中IL 4、IFN γ浓度。结果 :DEN2感染可使BALB/c小鼠产生IL 4、IFN γ增加 (P <0 0 5 ) ,且细胞因子浓度与病毒感染剂量有关。初次感染阶段两者水平均有升高 ,而再次感染阶段以IL 4升高为主。结论 :在初次感染阶段TH1/TH2应答均发挥重要作用 ;而再次感染阶段以TH2应答为主。     

用登革Ⅲ型病毒免疫小鼠后特异性IgG抗体的动态变化

目的：以登革Ⅲ型病毒(DV3)免疫成年BALB／C小鼠,观察血液中特异性IgG抗体的动态变化。方法：以不同剂量DV3经皮下注射和肌肉注射接种成年BALB／C小鼠,用间接免疫荧光法检测不同时间机体末梢血中特异性IgG抗体及其水平。结果：不同剂量DV,免疫BALB／C小鼠均可诱导体液免疫应答,特异性IgG抗体于免疫后第8～12天开始产生,于第15～18天达高峰(1：80),继而下降。特异性IgG类抗体可维持47d以上,其中以1000TCID50DV3免疫BALB／C小鼠最早产生特异性抗体且水平最高。结论：经皮下和肌肉注射DV3,可诱导BALB／C小鼠产生特异性IgG类抗体。     

DV2 NGC株感染BALB/C小鼠后IL-4、IFN-γ产生动态的研究

目的 :观察 2型登革病毒NGC株感染BALB/C小鼠后其IL 4、IFN γ产生动态 ,研究登革病毒感染的免疫机制。方法 :用不同含量的DV2NGC株经皮下多点注射 ,间接ELISA法测定感染后不同时间各组小鼠血浆IL 4、IFN γ含量。结果 :DV2NGC株感染小鼠产生IL 4和IFN γ动态不同。初次感染早期 ,IL 4水平明显升高 ,而IFN γ处于较低水平 ;再次感染后第 1天 ,IL 4水平达最高峰 (4 2 94 6 6 8± 349 0 38) pg/ml,IFN γ则于第 4天和第 1 1天达较高水平 ,两者的产生彼消此长 ,且产生动态与感染病毒量有关。结论 :DV2NGC株感染早期 ,体…     

DV2 NGC株感染BALB/C小鼠后IL-4、IFN-γ产生动态的研究

目的：观察2型登革病毒NGC株感染BALB／c小鼠后其IL-4、IFN-γ产生动态，研究登革病毒感染的免疫机制。方法：用不同含量的DV2 NGC株经皮下多点注射，间接ELISA法测定感染后不同时间各组小鼠血浆IL-4、IFN—γ含量。结果：DV2 NGC株感染小鼠产生IL-4和IFN-γ动态不同。初次感染早期，IL-4水平明显升高，而IFN-γ处于较低水平；再次感染后第1天，     

登革2型病毒NGC株基因组亚克隆的构建及其鉴定

目的 构建登革2型病毒NGC株基因组全序列的亚cDNA克隆，为进一步构建全长感染性cDNA克隆奠定基础。方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列中的酶切位点设计2对引物，从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA，采用长链RT—PCR技术扩增出覆盖病毒基因组全长的2个cDNA片段，并克隆至pCR—XL—TOPO载体后测序。结果经酶切鉴定和序列测定表明，获得的cDNA克隆为登革2型病毒NGC株特异的。结论已成功构建出登革2型病毒NGC株基因组的2个cDNA亚克隆。     

两株登革2型病毒E、NS1蛋白基因序列测定及其系统发生分析

目的 :对从登革出血热 (denguehemorrhagicfever ,DHF)病人血清分离到的一株登革 2型病毒 (denguevirustype 2 ,DEN 2B株 )和DEN 2NGC株作E、NS1蛋白部分基因序列测定并进行系统发生树分析 ,了解其变异及分子进化特证。方法 :利用RT PCR法扩增B株和NGC株E、NS1部分基因片段 ,PCR产物直接测序 ;利用DNAssist软件预测其氨基酸序列 ,以及PHYLIP软件的CLUSTAL方法绘制系统发生树。结果 :B株与NGC株E蛋白基因区第 1～ 4 76nt(4 76bp)碱基序列存在 8个位点的差异 ;编码氨基酸存在 4个位置的不同 ;NS1基因区第 5 89～ 1 0 0 …     

登革2型病毒特异性抗原片段的筛选及验证

目的筛选、鉴定登革2型病毒特异性抗原,为进一步研究其生物学功能奠定基础,并利用纯化抗原建立检测登革2型病毒
抗体的ELISA方法。方法分别利用DNAStar及ANTHEPROT软件对登革病毒1-4型、流行性乙型脑炎及黄热病毒M、E蛋白
进行分析,分析登革2型病毒型特异性抗原表位,并参考GenBank中的序列信息进行比对,分析其在不同登革2型病毒株中的保
守性。然后选择预测得分值较高的表位,利用pET32a原核表达系统进行原核表达,Western blotting验证其免疫学反应特异性,
特异性片段经亲和层析纯化后,包被ELISA微孔板,并对ELISA反应条件进行系统优化。结果经系统的生物信息学分析,初步
预测获得登革2型病毒特异性抗原表位8个,并对其中得分值较高的6段进行了高效表达,经Western blotting分析,获得登革2
型病毒特异性抗原片段1段。经纯化后作为检测用抗原,建立了检测登革2型病毒抗体的ELISA方法。初步应用表明,所建立
方法具备良好的特异性,可检测1~200倍稀释的患者血清,S/N比值均在10以上。结论获得登革2型病毒特异性抗原片段1段,
并建立检测登革2型病毒抗体的ELISA方法。
     

西双版纳州2016年登革1型和2型病毒疫情的流行病学调查

目的 了解云南省西双版纳州2016年登革热流行特征和登革病毒血清型、基因型及其传播来源.方法 收集登革热病例资料,采集患者急性期血清标本,用RT-PCR法检测登革病毒核酸,并进行登革病毒C/PrM区核苷酸序列测定和进化分析.结果 2016年西双版纳州共确诊登革热病例53例,其中本地感染病例24例(勐腊县21例和景洪市3例),输入性病例29例(来自缅甸24例和老挝5例).流行月份为7-11月.病例年龄以20～49岁组为主,男女性别比为1.9∶1.蚊媒监测景洪5-10月布雷图指数(Breteau index,BI)为8.4～21,勐腊6-10月BI为7.6～18.2,勐海县9-10月BI为8.4～8.8,其它月份BI均小于5.从患者血清中获得13株登革病毒的C/PrM区基因核苷酸序列,进化分析表明,10株为登革病毒血清型1型(DENV-1)中的基因Ⅰ型(Genotype-Ⅰ,G-Ⅰ),3株为登革病毒血清型2型(DENV-2)的亚洲基因Ⅰ型(Asian genotypeⅠ,AG-Ⅰ),均为东南亚地区的优势基因型.无论DENV-1或DENV-2均与近几年云南省瑞丽市、临沧市和东南亚地区的同型流行株具有较近的亲缘关系.结论 西双版纳州2016年发生了包括本地和输入性病例并存的DENV-1 G-Ⅰ和DENV-2 AG-Ⅰ流行,并证实相邻的缅甸和老挝边境地区存在这两种血清型登革病毒流行,来自缅甸和老挝的输入性病例是引起西双版纳本地流行的主要原因.此为西双版纳首次发生DENV-1和DENV-2 AG-Ⅰ的本地流行.     

H9N2亚型猪流感病毒感染BALB/c小鼠动物模型的建立

目的建立H9N2亚型猪流感病毒感染BALB/c小鼠动物模型,为研究病毒致病机制提供模型动物。方法通过滴鼻的方法将H9N2亚型猪流感病毒感染BALB/c小鼠,观察小鼠的症状和组织病理变化。结果BALB/c小鼠的临床症状明显,病理变化典型。结论H9N2亚型猪流感病毒感染BALB/c小鼠的疾病模型成功建立。     

登革热病毒Ⅱ型临床株感染小鼠TH1/TH2类细胞因子的产生

目的:观察登革病毒2型临床分离株B株(DEN2B)感染Balb/c小鼠后,其血浆中γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2,4,5,6,10(IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10)、β-转化生长因子(TGF-β)的动态变化,并探讨DEN2B株感染后小鼠Ⅰ型辅助性T细胞(TH1)、Ⅱ型辅助性T细胞(TH2)应答机制及其相关关系。方法:1.用不同剂量DEN2B株经皮下多点注射感染Balb/c小鼠,建立动物模型;2.双抗体夹心ELISA法检测不同剂量DEN2B株感染后各组动物血浆中(体内)IFN-γ,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,TGF-β的产生动态。结果:1.DEN2B株感染动物后,各剂量组动物血浆中均检出特异性抗DEN2IgM,IgG类抗体,出现病毒血症及不同程度临床表现,建立了DEN2B株感染Balb/c小鼠动物模型;2.DEN2B株感染动物后,其血浆IFN-γ,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,TGF-β水平在感染后不同时期均出现不同程度增加,各种细胞因子水平变化情况与正常组差别有统计学意义(P<0.05)。各种细胞因子产生动态有差异。结论:IFN-γ,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,TGF-β等细胞因子与登革病毒感染所致疾病病情关系密切,DEN2B株再次感染阶段以TH2应答为主。     

白纹伊蚊C6/36细胞登革Ⅱ型病毒结合分子的筛选

摘要：目的筛选白纹伊蚊C6/36细胞表达连接登革Ⅱ型病毒分子。方法提取C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白,收集和纯化登革
Ⅱ型病毒,用12%SDS-PAGE分析C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白,转于硝纤膜上,用病毒覆盖蛋白结合实验（VOPBA）筛选C6/36
细胞表达连接登革Ⅱ型病毒分子。结果C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白经12% SDS-PAGE分离后转膜,分别与纯化的病毒液和
阴性对照液孵育,用抗登革病毒Ⅰ~Ⅳ单克隆抗体检测,结果显示病毒孵育组在67 000和30 000的位置有特异性的条带出现,而
阴性对照组无此条带。结论用VOPBA法初步从白纹伊蚊C6/36细胞中筛选67 000和30 000等登革Ⅱ型病毒结合分子,其功
能的鉴定正在进行。
     

两种2型糖尿病小鼠溃疡创面愈合比较

目的比较目前常用的基因自发突变2型糖尿病小鼠C57BL/6J-db/db和STZ诱导的C57BL/6J小鼠的溃疡创面愈合特征,为应用稳定的糖尿病小鼠溃疡模型进行相关动物实验研究提供依据。方法建立糖尿病小鼠溃疡模型,统计0、3、5、7、10、14 d小鼠创面动态愈合率及愈合时间;7、14 d取组织,HE染色和Masson染色,免疫组化(CD31和PCNA)观察创面病理组织变化;荧光定量测定愈合相关因子collagen-IIIα、α-SMA的基因表达。结果基因突变db/db小鼠较STZ诱导小鼠的创面愈合时间显著延迟,由(16.6±0.8)d延长至(20.2±1.3)d(P0.001);db/db组较STZ组肉芽组织生长缓慢,新生上皮长度不足、胶原沉积紊乱,创面愈合较差;7 d,db/db组的CD31和PCNA显著性低表达(P0.01);7、14 d,db/db组基因上调量的倍数明显低于STZ组。结论两种糖尿病小鼠创面均出现愈合延迟,但基因突变糖尿病db/db小鼠相比于STZ诱导组小鼠在创面愈合延迟的程度上和愈合难易程度上,更适合进行糖尿病溃疡创面的研究。     

登革2型病毒E抗原基因的RT—PCR扩增及表达载体的构建

扩增并克隆登革２型病毒Ｅ抗原基因，构建Ｅ抗原基因表达载体。方法应用ＲＴ－ＯＰＣＲ法，基因克隆和限制性内切除酶酶切分析。结果增殖病毒标准株并提取病毒总ＲＮＡ。在登革２型病毒Ｅ抗原基因两侧疏水区设计一对ＰＣＲ引物。     

C6/36细胞系分离登革1型病毒的方法学探讨

目的应用C6/36细胞系3种细胞分离方法分离血清中登革1型病毒并探讨其分离效率。方法采用血清预稀释法,将已鉴定为登革I型病毒的阳性血清作10^-1-10^-10等10个10倍梯度稀释并接种于长满单层C6/36细胞的培养管;采用共培养法,将血清作50至6400等8个梯度倍比稀释,再加等体积C6/36细胞悬液作共培养;采用直接接种法,将25μl、50μl、100μl、150μl、200μl血清接种于长满单层C6/36细胞的培养管。连续7d,每天观察细胞生长情况,收获细胞分离液并提取核酸,然后采用Real-time PCR检测其CT值。结果血清标本呈登革I型病毒阳性,CT值为26.3;血清预稀释法与共培养法均未发现由血清毒性引发的非特异性细胞病变,除了10^-10稀释度呈弱阳性外,其余稀释度的CT值均在11-15之间。直接接种法中25μl、50μl接种量培养管未发现由血清毒性引起明显的非特异性细胞病变,检测其CT值约为19,100μl、150μl、200μl接种量的细胞第2d就因血清毒性完全被破坏。结论3种方法都能成功分离登革1型病毒,降低血清对细胞的干扰作用能提高分离效率。     

登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达质粒.方法 RT-PCR扩增NSI-NS2a基因片段后,将其克隆人真核表达载体pReceiver-M01a;过PCR、酶切、测序和间接免疫荧光染色鉴定重组质粒.结果 经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒构建正确,命名为pRe-NS1-NS2a;重组质粒转染Vero细胞后,间接免疫荧光染色显示细胞质中有登革2型病毒特异性蛋白的表达.结论 成功构建了真核表达质粒pRe·NS1-NS2a.     

白蚊伊蚊经卵传递登革2型病毒的实验研究

目的证明白蚊伊蚊亲代能够经卵传递登革2型病毒给子代,并且在传递过程中病毒毒力呈逐渐增强趋势。方法采用套式PCR分批检测感染雌蚊的子一代至子四代卵内登革病毒结合C6／36细胞培养分离病毒及TCID50法滴定病毒滴度。结果白蚊伊蚊能经卯传递DEN-2,至少可传四代以上：且在传代中病毒毒力有增强的趋势。结论实验证明白蚊伊蚊对登革2型病毒有较大的媒介效能,且在维持登革病毒的自然循环中起重要作用。     

IL-2和LAK细胞联合基因治疗对辐射后BALB／C小鼠造血功能的作用

为了探讨白细胞介素-2(IL-2)和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)应用于亚致死量全身照射后小鼠造血功能低下基因治疗的效果，进行了IL-2和LAK细胞过继免疫治疗对小鼠造血系统影响的实验研究．观察其造血重建作用。结果表明，过继免疫治疗能减轻亚致死量放射性对造血细胞的损伤，促进外周血白细胞的恢复，延长生存时间。提示．过继免疫治疗对放射损伤后造血功能的恢复具有应用价值。     

SCID小鼠和BALB/c裸鼠对两株人体肿瘤细胞系移植敏感性的研究

本文用MDA -MB2 31乳腺癌细胞致瘤块和人肺腺癌 1Ax - 83细胞系 ,在严重联合免疫缺陷 (SCID)小鼠、BALB c裸鼠的乳房垫和腋背侧皮下移植。结果表明 ,SCID小鼠对两株人体肿瘤细胞系成瘤率为 10 0 % (2 1 2 1)高于BALB c裸鼠 57 1% (8 14) ,两者差异显著 (P <0 0 5) ,SCID小鼠比BALB c裸鼠潜伏期明显缩短、且肿瘤生长较快。MDA -MB - 2 31乳腺癌细胞致瘤块移植组 ,SCID小鼠乳房垫接种者肺转移 10 0 % (5 5)、淋巴结转移 2 0 % (1 5) ,腋背侧皮下移植肺转移 50 % (2 4 )、淋巴结未见转移 (0 4 ) ;而BALB c裸鼠乳房垫接种者未见转移 (0 4 ) ,腋背侧皮下接种者仅 2 0 %(1 5)有肺转移。人肺腺癌 1Ax - 83细胞系移植组SCID鼠无自然消退 ,而BALB c裸鼠消退率 50 %(1 2 )。结论 :SCID小鼠比BALB c裸鼠更适宜做某些肿瘤移植模型 ,尤其是乳腺癌原位移植动物模型。     

B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台的搭建及BALB/c小鼠感染模型的建立

【摘要】 目的 本研究利用基因工程技术全基因合成B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88的8个基因节段,并利用反向遗传技术从体外拯救B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88,同时建立BALB/c小鼠感染模型,为下一步研究B型流感病毒致病机制、传播机制以及开发新型疫苗奠定基础。方法 通过基因合成和反向遗传技术体外拯救B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88。全基因组测序验证拯救病毒基因组序列与Genbank序列的一致性。将拯救病毒以105EID50的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、生存率、肺脏病毒复制等方面进行致病性分析,建立小鼠感染模型。结果 成功从体外拯救出B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88,命名为B-S9。全基因组测序结果表明,B-S9基因组序列与Genbank公布序列一致。B-S9能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性; 攻毒后第3天,B-S9感染小鼠体重出现下降,攻毒后第8天,小鼠体重开始回升;攻毒后第3天和第6天,B-S9感染小鼠的肺脏内均能检测到病毒复制,且攻毒后第3天的小鼠肺脏病毒滴度比攻毒后第6天的小鼠肺脏滴度高132倍。结论 成功搭建B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台,并建立BALB/c小鼠感染模型。目前国内外对B型流感病毒的研究还较少,该反向遗传操作平台的建立为B型流感病毒致病机制和传播机制的研究奠定了基础,同时也为包括B型流感病毒减毒活疫苗在内的新型疫苗的研制开辟了新途径。     

DEN-2NGC株感染Balb／c小鼠TH1／TH2类细胞因子产生的差异

目的：通过观察2型登革病毒（DEN2）NGC株初次感染和再次感染Balb／c小鼠后，小鼠血浆中TH1和TH2类．细胞因子的产生及其动态变化，研究DEN2感染的免疫机制。方法：用不同量的DEN2 NGC株经皮下多点注射，建立Balb／c小鼠感染模型，间接ELISA法测定感染后不同时间小鼠血浆IL-2、IFN-γ，IL4、IL-5、IL-6、IL-10的含量。