鼠疫F1McAb酶免疫染色法快速检验鼠疫苗

为缩短检验鼠疫菌的时间，建立了酶免疫染色法检验鼠疫菌的方法，被检涂片标本用含过氧化物酶底物的固定液，固定标本同时，内源性过氧化物酶被消耗，辣根过氧化物酶标记鼠疫F1单克隆抗体和鼠疫菌菌体表面的特异性F1抗原结合，底物被酶催化生成有色沉淀物使鼠疫菌着色，用普通光学显微镜观察结果，常温1h出结果，Kaplow法鼠疫菌被蓝色晶体覆盖，DAB法鼠疫菌呈棕黄色，不含F1抗原的8株细菌均为阴性，酶免疫染色法具有特异，快速，简便的特点，可用于鼠疫菌的快速检验。     

酶标鼠疫F1McAb在酶免疫染色法快速鉴定鼠疫菌中的应用

目的观察酶标鼠疫F1McAb在酶免疫染色法快速鉴定鼠疫菌中的应用效果.方法实验感染鼠疫强毒菌的病死小鼠和处死健康小鼠尸体,20℃以上室温放置,用鼠疫F1McAb酶免疫染色法检测,同时用细菌学检验方法分离鼠疫菌和反向血凝试验(RIHA)检测鼠疫F1抗原.结果直接培养仅从5d内的鼠尸分离检出鼠疫菌,阳性率为53.3%;动物实验检出鼠疫菌的最长时间为8d,阳性率为71.6%.存放13d内,酶免疫染色阳性率为99.1%,RIHA阳性率98.2%,用酶免疫染色法和RIHA检测健康动物腐败脏器全部阴性.以上方法检查鼠疫疫区自毙动物标本12份,酶免疫染色法阳性7份,RIHA阳性6份,动物实验阳性5份,直接培养未获得阳性结果.结论酶免疫染色法检查动物腐败脏器中的鼠疫菌具有较高的敏感性和特异性.     

酶免疫染色技术快速检测鼠疫耶尔森菌

目的研究酶免疫染色技术检测鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的敏感性及特异性,建立鼠疫免疫快速检测技术。方法用酶免疫染色技术对细菌标本和动物标本检测鼠疫菌,动物标本同时用细菌学、RIHA、RGICA和ELISA法平行检测鼠疫菌。结果细菌标本酶免疫染色法检测结果与实际相符,酶免疫染色技术检测鼠疫菌的灵敏性为1 000个/ml;动物标本酶免疫染色法检测鼠疫菌结果和细菌学、RIHA、RGICA和ELISA一致。结论酶免疫染色技术检测鼠疫菌敏感、特异、简便、快速,可用于鼠疫检测工作。     

胶体金免疫层析法快速诊断鼠疫的实验研究

目的建立一种快速、简易的检测鼠疫F1抗原的胶体金免疫层析法(GICA).方法采用直径为20nm胶体金颗粒,标记F1单克隆抗体,并将标记物以6μL/cm喷于玻璃纤维;将另1株F1单克隆抗体与羊抗鼠IgG以1μL/cm喷线固定于硝酸纤维素膜上,装配后以4mm/条切割制成免疫层析检测试条.分别用粗制F1抗原和EV菌对该试纸条的敏感性进行测定,同时用44株鼠疫近缘菌及昆明小鼠、黄胸鼠、褐家鼠、大足鼠的正常血清等标本进行特异性检测.结果本试纸条可在15min之内完成实验,检测粗制F1抗原的浓度可达0.5ng/mL,最小检出EV菌菌量为10万个;本方法的特异性为100%.结论 GICA检测鼠疫F1抗原特异性强、灵敏度高、简便快速,无需特殊仪器设备,有广泛应用价值.     

检测鼠疫抗体胶体金免疫层析试纸条的研制

目的建立快速、简易的检测鼠疫F1抗体的胶体金免疫层析法(G ICA)。方法(1)采用胶体金颗粒标记纯化F1抗原,并将标记物喷于玻璃纤维;同时将纯化F1抗原喷线固定于硝酸纤维素膜上,用于F1抗体的捕捉;按常规组装成检测鼠疫抗体免疫层析试纸条。(2)采用该试纸条与血凝法对同一份兔抗F1抗体进行检测,以评价该试纸条的敏感性。(3)采用该试纸条对44株非鼠疫菌的免疫鼠血清进行检测,以评价该试纸条的特异性。(4)采用该试纸条、血凝法及ELISA对607份血清标本进行检测,以评价该试纸条对现场材料的检测效果。结果(1)该试纸条可在15 m in之内完成检测;(2)在敏感性上,该试纸条对同一份免疫兔血清的检测较血凝法高一个滴度;(3)对被试的44株所选菌株的免疫鼠血清的检测均为阴性;(4)在对607份血清标本的检测中,免疫层析试纸条、血凝及ELISA三种方法的符合率中度,而免疫层析试纸条的敏感性分别比血凝与ELISA高111%和90%。结论以纯化的鼠疫F1抗原为基础建立的G ICA检测鼠疫F1抗体的方法特异性强、灵敏度高、简便快速,无需特殊仪器设备,有较大的推广应用价值。     

胶体金免疫层析法检测鼠疫F1抗原的研究

目的 研究胶体金免疫层析试纸条检测鼠疫F1抗原的敏感性和特异性.方法通过鼠疫F1抗原单克隆抗体(F1MAb)捕捉F1抗原的胶体金免疫层析(GICA)试纸条,检测308只强毒鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)感染鼠脏器标本和225份对照鼠(达乌尔黄鼠217只,小白鼠5只,豚鼠3只)标本,同时用鼠疫反向间接血球凝集试验(RIHA)微量法和细菌培养做平行检测.结果 225只对照鼠鼠疫细菌学检验及GICA和RIHA的F1抗原检测均为阴性,GICA和RIHA在1×108 cfu/ml水平上未发现与近缘假结核耶尔森菌有交叉反应.GICA、RIHA对鼠疫菌检测灵敏性为2.5×105、2.0×105cfu/ml;检测F1抗原灵敏性为1、10 μg/L.GICA与细菌学检验符合率为97.94%(522/533),Kappa值=0.959,阳性检出率组间比较,差异无统计学意义(x2=0.36,P＞0.05);与RIHA符合率为97.94%(522/533),Kappa值=0.959,阳性检出率组间比较差异有统计学意义(x2=9.09,P＜0.05).308只实验鼠样本细菌培养阳性284只,284份细菌培养阳性标本中,GICA有280份检测阳性,阳性率为98.59%,高于RIHA[阳性率为96.13%(522/533)],两组比较差异有统计学意义(x2=5.14;P＜0.05).GICA的敏感度为98.59%(280/284),特异度为97.19%(242/249),阳性预测值为97.56%(280/287),阴性预测值为98.37%(242/246),Youden指数为0.9578.结论 GICA检测鼠疫F1抗原敏感特异,快速简便,是鼠疫早期快速诊断中有应用价值的检测技术.     

双单克隆抗体夹心酶联免疫吸附试验检测鼠疫F1抗原的实验观察

目的 观察双单克隆抗体(F1-McAb)夹心酶联免疫试验(DMcAbS-ELISA)快速检测鼠疫F1抗原的敏感性和特异性.方法 采用鼠疫细菌学检验、DMcAbS-ELISA和反向间接血球凝集试验(RIHA)对比检测鼠疫感染鼠和阴性对照鼠脏器标本.结果 共检测225份阴性对照鼠脏器标本,鼠疫细菌学检验、DMcAbS-ELISA和RIHA法检测F1抗原均为阴性.共检测308只鼠疫感染鼠脏器标本,鼠疫细菌学检验、DMcAbS-ELISA、RIHA法阳性率分别为92.21％(284/308)、90.91％(280/308)和89.61％(276/308),3种方法比较,差异无统计学意义(x2=5.65,P＞0.05).DMcAbS-ELISA法与鼠疫细菌学检验结果符合率为97.00％[(274+243)/533],Kappa值为0.940;与RIHA法符合率为99.25％[(276+253)/533],Kappa值为0.985.脏器标本F1抗原检测的真实性比较:DMcAbS-ELISA法敏感性为96.48％(274/284),特异性为97.59％(243/249),阳性预测值为97.86％(274/280),阴性预测值为96.05％(243/253),一致性为96.99％11/4×(274/280+274/284+ 243/253+243/249)|,Youden指数为0.9407;RIHA法的敏感性为96.13％(273/284),特异性为98.80％(246/249),阳性预测值为98.91％(273/276),阴性预测值为95.72％(246/257),一致性为97.39％[1/4×(273/276+273/284+246/257+246/249)],Youden指数为0.9492.DMcAbS-ELISA法对鼠疫菌检测灵敏度为2.7×104cfu/ml,RIHA法为2.2×105 cfu/ml;两种方法检测F1抗原灵敏度均为10 μg/L.结论 DMcAbS-ELISA法检测鼠疫F1抗原具有敏感、特异、简便、快速的特点,是有应用价值的鼠疫快速诊断技术.     

胶体金免疫层析法与双单克隆抗体夹心ELISA检测鼠疫F1抗原的比较

目的比较胶体金免疫层析法（GICA）和双单克隆抗体夹心酶联免疫吸附试验（DMcAbS-ELISA）检测鼠疫F1抗原的敏感性和特异性。方法用GICA试纸条和DMcAbS-ELISA平行检测308份强毒鼠疫耶尔森菌感染鼠脏器标本和327份对照鼠标本,用RIHA微量法同时检测作为参照。结果327份对照鼠鼠疫细菌学检验及GICA,DMcAbS-ELISA和RIHA的F1抗原检测均为阴性,GICA,DMcAbS-ELISA和RIHA在108cfu/mL水平上未发现与近缘假结核耶尔森菌有交叉反应;308只感染鼠样本细菌培养阳性284只,24只样本未分离到鼠疫菌;F1抗原检测GICA阳性287份,DM-cAbS-ELISA阳性280份,RIHA阳性276份,GICA阳性检出率最高93.19%,与DMcAbS-ELISA和RIHA比较,差异均有统计学意义（χ^2=5.14,9.09;P=0.016,0.001）;GICA与DMcAbS-ELISA符合率97.73%（Kappa=0.845）;GICA和DMcAbS-ELISA与RIHA符合率分别是96.43%和98.70%（Kappa=0.774,0.926）;284份细菌培养阳性鼠标本F1抗原检测GICA阳性率是98.59%,高于DMcAbS-ELISA和RIHA,差异有统计学意义（χ^2=4.17,5.14;P=0.031,0.016）;24份细菌培养阴性实验鼠标本F1抗原检测：GICA检出7份阳性,阳性率29.17%,DMcAbS-ELISA检出6份阳性,阳性率25%,RIHA检出3份阳性,阳性率12.5%,GICA高于DMcAbS-ELISA和RIHA,但差异无统计学意义（χ^2=2.25,0;P=0.125,1.000）。结论GICA检测鼠疫F1抗原敏感特异,快速简便,优于DMcAbS-ELISA和RIHA,是鼠疫快速诊断中有应用价值的检测技术。     

异硫氢酸铵荧光素标记鼠疫F1McAb染色法快速检验鼠疫菌

免疫荧光染色法广泛用于临床疾病的诊断和病毒、细菌的鉴定,我们用异硫氢酸铵荧光素标记鼠疫F1McAb,建立了免疫荧光染色快速检验鼠疫菌的方法,现简报如下.     

胶体金免疫层析法快速检测鼠疫耶尔森菌F1抗体

目的建立检测鼠疫耶尔森菌F1抗体的胶体金标记免疫层析方法。方法胶体金标记纯化鼠疫F1抗原,双抗原夹心法原理制成免疫层析检测试纸条,并对兔、羊、人和黄鼠血清进行检测评价。结果用80份不同动物种属的阴性血清进行检测,未出现非特异性反应,对5份恢复期病人血清、13份免疫兔血清和2份免疫羊血清检测也取得阳性结果,对于8份I HA临界阳性(滴度1∶20)的达乌尔黄鼠血清检出阳性6份。结论建立了可以用于现场快速检测鼠疫F1抗体的胶体金免疫层析方法。     

胶体金免疫层析法诊断鼠疫的特异性试验

目的研究胶体金免疫层析法用于鼠疫快速诊断的特异性。方法采用胶体金免疫层析测试条和鼠疫反向间接血凝试验(RIHA)平行检测。结果检测鼠疫菌F1抗原具有很强的特异性,不与包括小肠结肠炎和假结核耶尔森等其他细菌发生交叉免疫反应。结论该方法简便、快速、敏感,适合现场鼠疫监测。     

Recombinant capsular antigen (fraction 1) from Yersinia pestis induces a protective antibody response in BALB/c mice

Yersinia pestis produces a glycoprotein capsule, the biosynthesis of which appears to be temperature dependent. The fraction I (F1) component of this capsule is specific to Y. pestis and the detection of F1 antibodies is the basis for several serological tests. We report the cloning of the F1 gene and its expression in Escherichia coli using the phagemid vector lambda ZAPII and a F1-specific monoclonal antibody. The recombinant F1 antigen had a molecular weight of 17 kDa, which proved to be identical to that of the F1 antigen produced by Y. pestis. The recombinant cells produced F1 antigen at 37 degrees C but only minimal amounts at 27 degrees C, suggesting that the genetic features affected by temperature in Y. pestis may be operating in the E. coli clone. It is not known if their similar molecular weights reflect the glycosylated nature of both proteins. F1 antigen purified from the E. coli recombinant induced a protective immune response in BALB/c mice challenged with up to 10(5) virulent Y. pestis. The resistance of immunized mice to plague infection correlated with high titers of F1 antibody. The cloned gene expresses an immunogenically competent F1 antigen suitable for use in plague serodiagnostics and vaccine development.     

荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究

目的　利用LightCycler建立一种简便、特异的荧光定量PCR检测方法 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测。 方法　采用SYBRGreenI随机掺入法 ,以Roche试剂盒为标准 ,比较两公司的DNA聚合酶 ,用鼠疫菌 310 0 4建立荧光PCR反应体系 ;针对鼠疫耶尔森氏菌特异的染色体标识序列和质粒上F1抗原基因设计引物 ,检测其灵敏度和特异性 ,以盲测试验进行验证 ;在此基础上鉴定 2 75株鼠疫耶尔森氏菌 ,并测试该法检测脏器污染模拟标本的灵敏度。结果　建立以一个公司试剂为主较低成本的PCR反应体系 ;EV76的检测灵敏度可达每反应体系 1.6个菌 ;检测我国 18个生态型共计 2 75株鼠疫耶尔森氏菌及 2 8株非鼠疫菌株的PCR扩增结果表明 ,鼠疫菌株均出现特异的扩增结果 ,2 8株对照菌株均为阴性 ;肝、脾、肺模拟标本检测灵敏度可达每反应体系 4 0 0 0个菌。结论　该方法对于检测鼠疫耶尔森氏菌具有简便、快捷、高敏感性和特异性的特点 ,适用于鼠疫紧急疫情时的快速诊断和疫源地监测     

基于上转发光免疫层析检测鼠疫抗体方-法的初步优化与评价

目的 优化基于上转发光免疫层析检测鼠疫抗体的方-法(YPAb-UPT-LF)并对其进行评价。方法 依据《中国生物制品规程》收录方-法改进制备的F1抗原免疫家兔,制备兔多抗作为质控品和质控带;通过筛选试纸上的最适F1抗原对YPAb-UPT-LF进行优化,再用健康人血清稀释的多种血清和多抗进行评价。结果 质控品兔抗F1抗体的ELISA效价为31.25 ~ 62.5 μg/L。优化后的YPAb-UPT-LF对质控品的检测灵敏度为1 mg/L,比之前提升了10倍;已被ELISA方-法滴定的F1疫苗接种者血清和多种鼠疫菌株兔免血清稀释100倍后均可被YPAb-UPT-LF检出,覆盖度良好;对F1免疫兔血清、兔抗EV76和羊抗EV76的检测灵敏度分别为1:40 960、1.25 mg/L、0.625 mg/L,考虑到免疫层析的样本需经10倍稀释处理,判定YPAb-UPT-LF的检测能力与ELISA基本持平。结论 本研究成功优化了YPAb-UPT-LF,为鼠疫免疫诊断和F1疫苗评估等提供了备选方-法。     

对常规制备的鼠疫F1抗原、抗体组分及免疫交叉反应的观察

目的对常规方法制备的鼠疫菌F1抗原、抗体的组分进行分析,并观察其免疫交叉反应。方法采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术分析抗原、抗体的组分;应用蛋白印迹观察其与相关细菌的免疫交叉反应。结果常规方法制备的鼠疫F1抗原、抗体组分复杂,混杂有其他多种蛋白;假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌的全膜蛋白与F1抗体存在交叉反应。结论常规方法制备的鼠疫F1抗原、抗体不纯,影响鼠疫免疫学诊断的特异性。     

鼠疫诊断芯片的探针制备

目的 探索制备鼠疫诊断芯片特异性探针的新方法。方法 直接采用限制性核酸内切酶Sau3A Ⅰ消化鼠疫耶尔森菌3个致病性质粒，克隆在T载体上，再经巢式PCR扩增制备成打印芯片的探针。结果 该法收集到250条探针用于打印芯片。分别与鼠疫耶尔森菌，同属的假结核耶尔森菌和小肠结肠炎耶尔森菌杂交，可筛选出杂交信号强阳性的特异点阵。结论 该法简便可行，适于制备鼠疫诊断芯片的探针。     

A 12-case outbreak of pharyngeal plague following the consumption of camel meat, in north-eastern Jordan

Between late January and early February 1997, an outbreak of plague, associated with cervical lymphadenopathy and fever, occurred in the Jordanian village of Azraq ad-Druze, which lies about 50 km west of the border with Saudi Arabia. The 12 cases who presented at hospital were initially assumed to have tularaemia, and all were successfully treated with gentamicin. When, however, their sera were tested for evidence of Yersinia pestis or Francisella tularensis infection (using haemagglutination, enzyme immuno-assays for specific IgM or the F1 antigen of Y. pestis, and micro-agglutination tests), all 12 were found to have anti-Y. pestis IgM. Three dogs shot near the Saudi Arabian border were also found seropositive for antibodies against Y. pestis. Eleven of the 12 patients reported that, 2-4 days before their symptoms appeared, they had eaten the meat cut from the carcass of the same camel, either raw (10 cases) or cooked (one case). All 12 patients were diagnosed as cases of pharyngeal plague (the first cases of plague reported in Jordan for more than 80 years), caused by Y. pestis that most had acquired when they ate raw meat from a camel that was infected with the pathogen.     

从动物和土壤中直接检测鼠疫耶尔森氏菌

目的　探讨用防污染的 PCR- EL ISA(U DPE)技术检测人为污染的土壤和感染的动物标本的可行性。方法　根据鼠疫耶尔森氏菌 Cafl和 Pla基因分别设计了 3条引物 ,组合成 3对引物 ,建立 U DPE检测技术。结果　利用该实验体系可以检出每克土壤中 10 0 0个鼠疫耶尔森氏菌的污染。比检测纯细菌的敏感性低 2 0 0倍 ,说明土壤中有抑制 PCR反应的因子。对 2 0只实验组动物 40份标本 (肝脏和脾脏 )的培养、U DPE和 PCR-电泳检测表明 ,3种方法的检出吻合率为 10 0 % ,均能从 40份标本中检出靶细菌 ,而用 3种方法检测对照组动物的 2 0份肝脏和脾脏均为阴性。结论　利用 UDPE技术可以被用于动物脏器中鼠疫耶尔森氏菌的检测     

一种选择敏感培养基对腐败材料检测鼠疫耶尔森氏菌检测的应用效果北大核心CSCD

目的研制并筛选适合从腐败材料分离鼠疫菌的选择敏感培养基,对其性能进行评价。方法以自制赫氏消化液为基础,加入刺激鼠疫菌和抑制杂菌生长的生化试剂配制成2种选择敏感培养基,以常见致病菌株、耶尔森氏菌属中与鼠疫菌近源的假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌评估2种培养基的敏感性和特异性;应用以上培养基分离野外腐败动物材料的鼠疫菌,评价几种选择培养基的应用效果。结果1号培养基(4%十二烷基硫酸钠选择培养基)对鼠疫菌检测的特异性高、敏感性强,培养24 h鼠疫菌发育为典型成熟菌落,应用该培养基从腐败动物材料中分离鼠疫菌阳性检出率与龙胆紫选择培养基一致。结论4%十二烷基硫酸钠选择培养基分离鼠疫菌效果优于龙胆紫选择培养基,可用于野外腐败动物材料的鼠疫菌快速检验。