耐药肿瘤细胞β-1整合素表达及对细胞凋亡的影响研究

目的：探讨耐药肿瘤粘附分子β－1整合素的表达以及其对细胞凋亡的影响。并寻找逆转耐药的途径。方法：采用人肺腺癌细胞株A549及耐阿霉素细胞株A549－ADR，免疫组化方法检测耐药细胞β－1整合素的表达；TUNEL法检测其对细胞凋亡的影响。结果：耐药细胞β－1整合素表达水平高于敏感细胞（P＜0．01）；敏感细胞及耐药细胞FN后其凋亡率较未结合FN细胞明显降低（P＜0．01）；用抗β－1整合素抗体阻断与FN结合耐药细胞株β－1整合素，其凋亡率与未阻断β－1整合素，但与FN结合的耐药株相比，有显著差异（P＜0．001）。结论：耐药肿瘤细胞β－1整合素表达增加，成为耐药表型；其机制主要通过抑制细胞凋亡产生耐药；阻断其作用可以逆转肿瘤耐药。     

β1整合素及纤维粘连蛋白与肺癌细胞凋亡关系的实验研究

目的 研究β1整台素及纤维粘连蛋白与人肺癌细胞凋亡之间的关系．方法 体外无血清培养条件下，以培养在包被纤维粘连蛋白底物上的人肺腺癌SPC-A-1细胞为靶细胞、用不同浓度抗β1，整台素单克隆抗体阻断β1整合素与纤维粘连蛋白相互作用，采用苏木素-伊红(HF)染色．吖啶橙荧光染色，DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡情况，并计算凋亡指数。结果 抗β1整合素单克隆抗体列SPC-A-1细胞凋亡有明显的促进作用，在一定的范围内，呈时间、剂量依赖性。结论 肺癌细胞凋亡与β1整合素受体有密切关系，且β1整台素受体与其特异配体纤维粘连蛋白的相互作用能促进细胞生存，当二者作用阴断导致肺癌细胞凋亡。     

肺癌细胞凋亡与β1整合素关系的实验研究

目的：研究β1整合素及纤维粘连蛋白与人肺癌细胞凋亡之间的关系。方法：体外无血清培养条件下，以培养在包被纤维粘连蛋白底物上的人肺腺癌SPC-A-1细胞为靶细胞，用不同浓度抗β1整合素单克隆抗体阻断β1整合素与纤维粘连蛋白相互作用，采用噻唑蓝比色法检测细胞存活情况，计算肿瘤细胞存活率；以TUNEL和流式细胞术检测细胞凋亡情况，并计算凋亡指数。结果：抗β1整合素单克隆抗体对SPC-A-1细胞凋亡有明显的促进作用，对细胞存活有抑制作用，在一定范围内，呈时间、剂量依赖性。结论：肺癌细胞凋亡与β1整合素有密切关系，β1整合素与其特异配体纤维粘连蛋白的相互作用能促进细胞生存，当二者作用被阻断导致肺癌细胞凋亡。     

BQ＿（123）－多聚赖氨酸携载β－半乳糖苷酶基因向血管平滑肌细胞的靶向导入

本研究连接合成了ＢＱ１２３－多聚赖氨酸（ＢＰ）利用ＢＱ１２３对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）膜表面内皮素Ａ型受体（ＥＴＡ）的高度选择性和多聚赖氨酸对ＤＮＡ的强吸附作用，以ＢＰ携载含有β－半乳糖苷酶（β－ＬａｃＺ）基因的表达质粒ｐＳＶ－β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ｐＳＶ－β－ＬａｃＺ）对培养的ＶＳＭＣ和内皮细胞（ＥＣ）转移基因。结果表明，ＢＰ具有向ＶＳＭＣ转基因性能，且依赖与靶细胞表面ＥＴＡ的结合。     

整合素β1对顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡的影响研究

目的 探讨整合素β1介导的细胞与细胞外基质(extraceUular matrix,ECM)的黏附,及其黏附对顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡抑制作用即耐药性的影响研究.方法 利用酶联免疫吸附实验(ELISA)及吖啶橙-溴化乙锭(AO-EB)双荧光染色法分析卵巢癌株型SKOV3、3AO、8910细胞由顺铂诱导的细胞凋亡情况,并采用分组对照的方法检测整合素β1及整合素β1与特异性配体的黏附作用在细胞凋亡中的作用.结果 卵巢癌3株细胞均可由顺铂诱导凋亡(P<0.01).经顺铂(10 μg/mL)作用48 h后,生长于整合素β1的配体-纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)上的3株细胞的富集系数(enrichmentfactor,EF)明显低于生长于非整合素配体一多聚赖氨酸上的细胞EF值;吖啶橙-溴化乙锭双荧光染色法结果显示生长于FN上的细胞凋亡率明显低于生长于多聚赖氨酸上的细胞凋亡率,用整合素β1的特异性阻断抗体封闭过的细胞再次生长于FN上,EF又明显提高(P<0.01).结论 整合素β1介导的细胞与FN的黏附对顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡有抑制作用,提示细胞黏附可能通过抑制细胞凋亡而促使细胞产生耐药性.     

重组人转化生长因子β1诱导人肝癌细胞SMMC—7721凋亡

用不同剂量的rhTGF－β1与人肝癌细胞SMMC－7721共同繁育不同时间后，用荧光显微镜进行形态学观察；提取细胞DNA经琼脂糖凝胶电泳分析电泳条带；用流式细胞仪分析细胞周期变化；用免疫组化法检测bcl－2、c－myc基因表达的变化。结果显示：细胞经rhTGF－β1作用后体积缩小、核染色质固缩或成碎片状；细胞DNA电泳呈典型的“阶梯状”条带；细胞周期分析显示rhTGF－β1先使SMMC－7721细胞停滞在G0／G1期，继而诱发细胞产生凋亡；免疫组化检测发现rhTGF－β1可下调bcl－2和c－myc蛋白的表达。研究表明：rhTGF－β1诱导人肝癌细胞凋亡与G0／G1期阻滞密切相关；bcl－2、c－myc基因产物的下调在rhTGF－β1诱导的细胞凋亡过程中可能起重要的调控作用。     

β1整合素与卵巢癌细胞凋亡关系的实验研究

目的 研究β1整合素及纤维黏连蛋白在人卵巢癌HO-8910细胞增殖、凋亡中的作用及其意义.方法 以培养在包被纤雏黏连蛋白底物上的人卵巢癌HO-8910细胞为靶细胞,用不同浓度抗β1整合素单克隆抗体阻断β1整合素与纤维黏连蛋白的相互作用.用MTT法测定细胞增殖抑制率;吖啶橙(acridine orange,AO)染色观察细胞凋亡的形态学变化;流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡率.结果 抗β1整合素单克隆抗体能抑制人卵巢癌HO-8910细胞的增殖,并有明显的时间和剂量依赖性(P＜0.05).荧光显微镜观察到细胞凋亡的形态学改变;流式细胞术检测结果显示实验组S期上升,细胞凋亡率上升.结论 抗β1整合素单克隆抗体可抑制卵巢癌细胞的增殖,β1整合素抗体与卵巢癌细胞凋亡密切相关,阻断β1整合素与其特意配体纤维黏连蛋白的相互作用可诱导卵巢癌细胞凋亡.     

MPTP诱发C57—BL小鼠黑质细胞凋亡

目的对神经毒素1－甲基－4苯基－1，2，3，6－四氢吡啶（MPTP）引起的中脑黑质细胞死亡本质进行研究。方法应用MPTP腹腔注射C_57－BL小鼠，分别用DNA末端转移酶介导的dUTP－x缺口末端标记法（TUNEL）和流式细胞术法（FACS）定性和定量检测黑质细胞凋亡。结果制备C_57－BL小鼠帕金森病（PD）模型的MPTP常规剂量（30mg／kg）连续注射7d明显地导致黑质细胞凋亡，连续注射3d轻度引起黑质细胞凋亡。低剂量MPTP（10mg／kg）连续注射7d未能引起黑质细胞凋亡，此剂量不能制备PD小鼠模型。结论由MPTP制备的PD小鼠模型，导致中脑黑质多巴胺能神经元毁损的本质可能是细胞凋亡。     

粒-巨噬细胞集落刺激因子对Vp16诱导白血病细胞凋亡的调控作用

探讨粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）对鬼臼乙叉甙（Vp16）诱导白血病细胞凋亡的调控作用。结果：未转GM－CSF基因及转空载体N2A的HL－60细胞经Vp16处理后均出现凋亡的特征性表现：DNA电泳呈梯状；流式细胞仪DNA直方图上呈现特征性的亚二倍体（亚G1）峰；透射电镜观察细胞形态可见凋亡的特征性改变。而转染GM－CSF基因的HL－60／GM细胞，经VP16处理后未观察到凋亡的特征性改变。表明Vp16具有诱导白血病细胞发生凋亡的作用，而GM－CSF能抑制Vp16诱导的细胞凋亡。粒-巨噬细胞集落刺激因子对Vp16诱导白血病细胞凋亡的调控…     

人天冬氨酸-β-羟化酶树突状细胞疫苗对肝癌细胞系的体外作用研究

目的：通过对携带人天冬氨酸-β-羟化酶（aspartate-β-hydroxylase,AAH）基因的树突状细胞杀伤肝癌细胞系的研究,探索可用于防治肝癌的树突状细胞疫苗。方法：重组腺病毒（Ad-AAH-IRES2-EGFP）感染C57BL/6小鼠骨髓未成熟树突状细胞（dendritic cells,DCs）制备携带AAH基因的DCs（AAH-DCs）,与同体小鼠脾脏T淋巴细胞共培养后作为效应细胞,以肝癌细胞株HepG2和Huh7分别作为靶细胞,效应细胞分别和靶细胞共培养24 h,CCK-8法检测效应细胞对靶细胞增殖的影响;流式细胞术检测效应细胞对靶细胞凋亡的影响。将AAH-DCs连续3次皮下注射免疫C57BL/6小鼠,乳酸脱氢酶释放法检测免疫后小鼠脾脏T淋巴细胞对靶细胞的裂解效应。结果：AAH-DCs与T淋巴细胞共培养组靶细胞的增殖能力明显低于对照组（P=0.000）,凋亡率明显高于对照组（P=0.000）;实验组靶细胞的裂解率明显高于对照组（P=0.000）。结论：荷载AAH基因的树突状细胞疫苗能够诱导产生细胞毒性T淋巴细胞从而杀伤表达AAH的肝癌细胞。     

整合素β-1对实体瘤细胞耐药的影响研究

目的：初步探讨附分子β－1整合素对肿瘤耐药的影响。方法：采用人肺腺癌细胞株A549，分别以不同浓度阿霉素诱导建立耐药细胞株，采用MTT法检测肿瘤细胞结合纤维粘连蛋白（FN）及阻断β－1整合素后对肿瘤细胞耐药的影响。结果：经致死剂量的阿霉素作用，MTT法检测药物敏感的肿瘤细胞抑制率为97．1％，耐药细胞株为45．2％，与纤维粘连蛋白结合后，药物敏感细胞株抑制率为68．5％，耐药细胞株为56．4％，阻断β－1整合素后与纤维粘连蛋白结合，药物敏感细胞株抑制率达到94％，耐药细胞株为49．4％，与纤维粘连蛋白结合后，肿瘤细胞抑制率明显下降（P＜0．05）；阻断β－1整合素功能后，肿瘤细胞抑制率显著上升，结论：肿瘤细胞与细胞外基质作用是造成肿瘤耐药的原因之一，阻断肿瘤细胞与细胞外基质的作用可以逆转肿瘤耐药。     

β1整合素过表达抑制顺铂诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨β1整合素过表达对顺铂诱导肝癌细胞凋亡的影响及其机制。方法功能性β1整合素稳定过表达Hep3B细胞系用于实验。采用WST-1细胞增殖实验试剂盒检测细胞增殖,DNA梯形条带和Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡。结果与亲株、空载体转染Hep3B细胞相比,β1整合素过表达明显抑制顺铂诱导的肝癌细胞凋亡。细胞外信号调节激酶(ERK)抑制物PD98059和p38促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制物SB203580能够明显减弱β1整合素对细胞凋亡的保护作用,但Jun激酶抑制物SP600125不能减弱β1整合素的保护作用。结论β1整合素能够通过ERK和p38MAPK信号通路抵抗顺铂诱导的肝癌细胞凋亡。β1整合素介导的细胞外基质信号与肝细胞肝癌化疗耐药有关。     

整合素αⅡbβ3缺陷对血小板由内到外信号传导的影响

目的：探讨整合素αⅡbβ3缺陷对血小板由内到外信号传导的影响。方法：采用DNA序列分析、流式细胞术、RT－PCR和Western blotting等检测细胞中转染cDNA的存在、表达及细胞结合PAC－1、纤维蛋白原（fibrinogen,Fb)的能力。结果：血小板无力症（GT）患者整合素αⅡbβ3明显低下，且血小板在ADP激活后不能结合PAC－1，转染β3和αⅡb（突变αⅡb^R995A或正常αⅡb）cDNA的CHO细胞株分别表达αⅡb^R995Aβ3和αⅡbβ3，并且突变株中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary,CHO)细胞αⅡb基因30外显子上第3077和3078位碱基由CG突变为GC，导致第995位精氨酸被替换为丙氨酸；在未活化的情况下，αⅡbβ3 CHO细胞几乎不结合PAC－1，但能结合Fb，而αⅡb^R995Aβ3 CHO细胞能结合PAC－1，且Fb明显增加。结论：αⅡb^R995A突变能诱导血小板内到外信号传导，使αⅡb^R995Aβ3表现为激活型受体；而GT患者却因整合素αⅡbβ3缺陷使αⅡbβ3介导的血小板由内到外信号传导受阻，使该GT患者表现出血小板聚集异常。     

应用细胞删减筛选法筛选整合素αvβ3结合肽

目的：应用新的噬菌体删减筛选技术筛选能与整合素αvβ3具特异性结合功能的小肽分子,并简单分析其生物学功能。方法：以商表达整合素αvβ3分子的M2黑色素瘤细胞株为靶细胞,以低／不表达整合素αvβ3分子的C23黑色素癌细胞株为吸附细胞,对噬菌体随机七肽库进行消减筛选,ELISA鉴定阳性克隆,DNA测序和分析。结果：经过4轮亲和筛选,3轮删减筛选,经固定ELISA鉴定,随机选取50个克隆得到2个能特异性与M2细胞结合而不与C23细胞结合的阳性克隆,进行DNA测序后,其多肽序列如下：HTPPYIL;MNFNAML。结论：通过噬菌体噬菌体删减筛选技术获得与整合素alpha v beta 3具特异性结合能力的小肽分子,为基于整合素alpha v beta3的肿瘤血管生成的早期诊断及治疗的多肽药物前体设计提供实验依据。     

过氧化物酶体增殖物激活受体β在肿瘤坏死因子α介导HaCaT角质细胞凋亡中的作用

目的：探讨肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）导致HaCaT角质细胞凋亡中,TNF-α对过氧化物酶体增殖物激活受体β（peroxisome proliferator activated receptor-β,PPARβ）表达时空和转录活性的影响。方法：采用Hoechst 33258染色后观察凋亡细胞的形态学改变,并计算凋亡细胞百分率,Caspase活性定量检测试剂盒分析Caspase-3的活性变化,RT—PCR和Western印迹观察TNF-α致PPARβmRNA及蛋白的表达,应用凝胶迁移滞留实验及荧光素酶报道基因分析TNF-α介导PPARβ的DNA结合活性及转录活性的改变。结果：HaCaT角质细胞经5、10、20ns／ml TNF-α处理24h后,Hoechst 33258染色示随着TNF-α剂量的增加,凋亡细胞增多,凋亡细胞核百分率分别为12％±3％、32％±4％、57％±5％;HaCaT角质细胞经TNF-α（10、20ns／ml）处理不同时间后,Caspase-3的活性增强（P〈0．01）。继而Western印迹显示,HaCaT角质细胞经10as／ml TNF-α处理12、24h后PPARβ的蛋白表达显著增加,HaCaT角质细胞经不同浓度的TNF-α处理24h后PPARβ蛋白表达水平亦增加;RT-PCR检测示TNF-α（10、20ns／ml）处理3、6h后PPAR[3mRNA的表达增强,说明TNF-α可诱导PPARβ的表达。进而凝胶迁移滞留实验及荧光素酶报道基因分析表明TNF-α可以增强PPARβ的DNA的结合活性和转录活性。结论：在TNF-α介导HaCaT角质细胞凋亡中,TNF-α可增强PPARβmRNA、蛋白水平的表达以及DNA结合活性和转录活性。     

马桑内酯致大鼠癫痫持续状态后海马神经细胞凋亡的观察

为观察马桑内酯诱导鼠癫痫持续状态（SE）时海马细胞中DNA损伤及凋亡现象，用流式细胞术检测雄性SD大鼠海马细胞中DNA状态，用免疫组织化学法显示海马谷氨酸阳性细胞，并用流式细胞术免疫荧光法测定海马细胞中BCI－2样蛋白含量。结果发现，致痫大鼠SE后海马神经细胞存在DNA断裂和凋亡现象；海马CA3区谷氨酸阳性细胞较对照组着色变淡，细胞之间界限模糊，细胞内部结构也不清晰；细胞内BCI－2样蛋白增加。由此可见，SE可诱导海马细胞DNA损伤甚至凋亡；SE时谷氨酸过量释放可造成突触后靶细胞损伤。BCI－2样蛋白增加可能是BCI－2…     

牛磺酸对细胞因子诱导的胰岛细胞凋亡的影响

目的：观察牛磺酸对白细胞介素－1β（IL-β）、肿瘤坏死因子（TNF）和γ－干扰素（IFN－γ）诱导的胰岛细胞凋亡的影响。方法：应用体外单层培养的Wistar大鼠胰岛细胞,分别检测IL－1β、TNF和IFN－以及牛磺酸对胰岛细胞凋亡细胞百分率,培养液中NO含量及NOS活性以及DNA片段的影响。结果：IL－1β、TNF和IFN－γ联合可诱导胰岛细胞凋亡率及DNA片段明显增加,同时NO含量和NOS活性亦明显升高（P＜0．01）;牛磺酸能阻断上述细胞因子的作用（P＜0．01）,且有剂量依赖性。结论：NO可能是介导上述细胞因子引起胰岛细胞凋亡的重要途径之一。牛磺酸能够改善细胞因子诱导的胰岛细胞凋亡,其机制可能与抑制NOS活性从而减少NO的生成有关。     

卵巢癌UT—OC—3细胞增殖与细胞因子TGF—β1和TNF—α的关系

目的：观察在离体情况下转生长因子TGF－β1transforming growth factor1)和肿瘤坏死因子TNF－α（tumor necrosis factor)在不同时间对卵巢癌UT－OC－3细胞系增的影响，并探讨其可能的调控机制。方法：常规培养卵巢癌UT－OC－3细胞系，加入细胞因子TGF-β1和TNF－α处理肿瘤细胞48及72h后收集细胞，细胞增殖以^125I脱氧尿嘧核苷掺合（^125IUdR)标记计数细胞，选用转录因子AP－1和NF－kB，采用电泳转化移动测定法（EMSA）分别肿瘤细胞核心DNA蛋白。结果：TGF-β1和TNF－α在孵化细胞48及72h后均可明显抑制卵巢癌UT-OC－3细胞的增殖，P＜0．05，有显著性统计学意义。经细胞因子处理后提取的肿瘤细胞核DNA结合蛋白与转录因子AT－1和NF－kB结合增多。结论：经细胞因TGF-β1和TNF－α处理后的卵巢癌UT－OC－3细胞，其增殖明显受到抑制，抑制机理与转录因子AP－1及NF－kB的激活有关，激活改变了细胞内控制生长的信号，从而使肿瘤细胞细胞的生长得到抑制。     

人卵巢癌细胞特异CTL系的免疫学特性初步研究

目的 探讨人卵巢癌细胞体外刺激、诱导的肿瘤特异细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对靶细胞的杀伤活性。方法 应用建株的人卵巢癌细胞（OVA－319），在体外定期刺激、诱导肿瘤患者外周血淋巴细胞，经微量淋巴细胞毒试验和流式细胞术分别测定扩增的淋巴细胞组织相容性白细胞抗原（HLA）Ⅰ类分子表型和膜表面免疫标志物，并通过4－甲基偶氮唑盐（MTT）法分析其对肿瘤细胞的杀伤活性。结果 经卵巢癌细胞刺激、诱导3周后扩增的淋巴细胞主要为T细胞抗原受体（TCR）－α、β及CD8阳性的CTL，具有明显特异性杀伤肿瘤细胞的作用，并发现经OVA－319细胞刺激、诱导后不同个体的卵巢癌患者CTL的杀伤活性与效靶细胞的HLA－A、B位点相同数成正比。结论 肿瘤细胞体外激活的CTL具有特异杀伤靶细胞作用，提示CTL特异杀伤作用与刺激细胞、靶细胞及本身CTL表型的HLA－A、B位点密切联系。     

水杨酸钠对人早幼粒细胞白血病HL-60细胞的影响

目的：研究水杨酸钠对HL－60细胞的影响。方法，用MTT法检测水杨酸钠对HL－60细胞存活率的影响，光镜、电镜观察细胞形态学变化；流式细胞术分析DNA含量；Annexin-V结合分析检测靶细胞磷脂酰丝氨酸外化。结果：水杨酸钠明显抑制HL－60细胞生长，并呈时间，剂量信号性；5mmol.L^-1(IC50)的水杨酸钠作用后，HL－60细胞出现典型的凋亡形态特征，并检测到亚二倍体峰；同时，靶细胞磷脂酰丝氨酸外化率显著高于阴性对照组（0．24vs0.03)。结论：水杨酸钠能抑制HL－60细胞生长并促进其凋亡。