体外检测近交系小鼠HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞方法的建立

通过磷酸钙法用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因—ｎｅｏｒ基因的质粒ｐＳＶ２ｎｅｏ对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株—Ｐ８１５细胞进行了质粒共转染，并经Ｇ４１８筛选得到了Ｇ４１８抗性细胞，即Ｐ８１５Ｓ细胞。斑点杂交和免疫组化实验分别证实Ｐ８１５Ｓ细胞内有ＨＢＶＳ基因的存在；Ｐ８１５Ｓ细胞浆内和膜上有ＨＢｓＡｇ的表达。表明了Ｐ８１５Ｓ细胞可作为体外检测ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠ＨＢｓＡｇ特异性ＣＴＬ的靶细胞。进一步对Ｐ８１５Ｓ细胞成功地进行５１Ｃｒ标记，以及标记靶细胞５１Ｃｒ最大释放值和自然释放值的测定表明：利用５１Ｃｒ释放法体外检测近交系小鼠（ＢＡＬＢ／Ｃ）ＨＢｓＡｇ特异性ＣＴＬ功能的方法被建立。     

HBsAg体外冲击的慢性乙肝患者树突状细胞对HBV特异性CTL的诱导作用

目的 :研究 HBs Ag冲击的慢性乙肝患者单核细胞来源的树突状细胞 (DCs)体外对 HBV特异性 CTL的诱导作用 ,初步探讨诱导特异性抗 HBV细胞免疫的途径。方法 :分离慢性乙肝患者外周血单核细胞 ,以 GM-CSF + IL -4 + TNF -α培养诱导DCs,加入 HBs Ag冲击以诱导 HBV特异性 DCs。采用 LDH法检测 DC诱导的患者外周血 T细胞对 Hep G2 2 .2 .15 (转染 HBVDNA)、Hep G2肝癌细胞株及 K5 62白血病细胞株的细胞毒作用。结果 :HBs Ag冲击的 DC可有效地诱导自体 CTL 对转 HBV基因的Hep G2 2 .2 .15细胞高效特异性杀伤作用 (P<0 .0 1)。结论 :慢性乙型肝炎患者单核细胞来源的 DCs经 HBs Ag抗原冲击后 ,可有效地诱导对 HBV特异性反应的 CTL     

树突状细胞体外刺激对HBV特异性细胞毒T细胞影响的研究

目的探讨通过聚肌胞体外作用树突状细胞后改善慢性乙型肝炎患者树突状细胞功能,并在体外活化自身T细胞获得高频数HBV特异性细胞毒性T细胞(CTL)的方法。方法分离慢性乙型肝炎病人外周血单个核细胞,在粒巨噬细胞集落刺激因子(GM CSF)和白细胞介素4(IL4)的诱导下培养树突状细胞。培养的第7天加入聚肌胞刺激获得成熟树突状细胞,经HBVcore1827肽负载后与自身T淋巴细胞共培养,通过酶联斑点计数法(Elispot)及MHC肽四聚体法(Tetramer)比较病人T细胞未经自身树突状细胞刺激组、经HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组、经聚肌胞促成熟的HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组中HBV特异性的CTL的功能和频数。结果慢性乙型肝炎病人外周血单核细胞体外经GM CSF和IL4诱导可转化为树突状细胞,树突状细胞转化过程中聚肌胞的刺激可显著上调树突状细胞表面分子CD80、CD83的表达(P<0.01),促进树突状细胞的成熟。Elispot法检测分泌IFNγ的CTL的频数病人T细胞未经自身树突状细胞刺激组分泌频数为(9～28)/1×105T细胞,均值16;经HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组频数为(30～67)/1×105T细胞,均值为46;经聚肌胞促成熟的HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组频数为(59～130)/1×105T细胞,均值为98。三组数据     

同种抗原特异性T淋巴细胞克隆方法的建立

目的 建立抗原特异性T淋巴细胞克隆的方法。方法 以供体脾细胞作同种抗原,刺激受体外周血单个核细胞,用有限稀释法进行T淋巴细胞克隆。结果 获得3个T淋巴细胞株。经免疫组化分析,有2个细胞株为CD3^ CD4^-CD8^ 。另一个细胞株为CD3^ CD4^-CD8^-。后者经流式细胞仪分析纯度为97％。抗原特异性检测表明：用供体细胞刺激,克隆T细胞发生增殖作用;用无关个体细胞刺激,无增殖作用。结论 成功地建立了抗原特异性T淋巴细胞克隆方法。     

细胞毒性T淋巴细胞活性的检测及应用

细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的测定是了解机体细胞免疫功能的重要方法,在表位鉴定、疫苗效果评价、预测移植排斥反应等研究中广泛应用,因此有效地检测其功能非常重要,本文综合叙述了主流的检测方法及其各自应用。     

EBV特异性细胞毒淋巴细胞的体外诱导和对鼻咽癌细胞的杀伤活性

目的 探索体外诱导和扩增EBV特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的方法,探讨其应用于鼻咽癌(NPC)治疗的可能性.方法 用EB病毒转化的B淋巴细胞系为抗原递呈细胞及抗原刺激剂,经照射灭活后刺激自体外周血单个核细胞(PBMC),产生EBV特异性CTL,以抗人CD3抗体OKT-3/同种异体PBMC法扩增.并检测其对NPC细胞的特异性杀伤.结果 在体外有效诱导和扩增了EBV特异性的CTL.扩增前CTL对自体BLCL的杀伤率为76%,对同种异体BLCL的杀伤率为13%,对自体肿瘤细胞的杀伤率为51%,对CNE鼻咽癌细胞的杀伤率为27%.扩增后的杀伤率分别为63%、25%、49%、33%.扩增后CTL对肿瘤杀伤力没有明显下降.结论 EBV特异性CTL能在体外有效地诱导,对NPC细胞有特异性的杀伤力,能在体外大量地扩增,且扩增后对肿瘤的杀伤力没有明显下降,有望成为NPC患者有效的过继免疫治疗方法.     

细胞毒性T淋巴细胞在乙型肝炎中的作用研究进展

乙型肝炎病毒(HBV)感染后，决定病情严重程度及病程转归的一个主要因素是机体的免疫反应能力。由于患者体内抗病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)在清除病毒方面发挥重要的功能，下面就CTL在乙型肝炎中作用研究近况综述如下。     

骨肉瘤特异杀伤性T淋巴细胞的体外扩增

目的 研究骨肉瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）体外扩增培养的方法，并进行细胞毒检测。方法 抽取骨肉瘤患自身的外周血，分离淋巴细胞，用IL-2体外短期刺激方法提高对骨肉瘤细胞的免疫性，再按一定比例体外与多西紫杉醇处理的骨肉瘤细胞及巨噬细胞混合培养（MTLC）可获得骨肉瘤的特异性CTL细胞，进行鉴定并观察其杀伤特性。结果 混合培养4d后，即可扩增出大量淋巴细胞，流式细胞仪证实主要是CD8^ 细胞，这些具有杀伤活性的CTL细胞体外对自身肿瘤细胞有很强的细胞毒作用。结论 在IL-2作用下，应用巨噬细胞、自体肿瘤细胞及淋巴细胞体外混合培养，是体外扩增特异性细胞毒性T淋巴细胞的较好方法，CTL作为新的特异性免疫治疗方法有望提高骨肉瘤的免疫治疗效果。     

特异性体外扩增人γδT淋巴细胞及其生物学特性的研究

探讨人γδＴ淋巴细胞体外特异性激发的方法，及其杀伤肿瘤细胞的分子机理。方法采用人多发性骨髓瘤细胞株ＸＧ－７细胞作为刺激细胞，与人外周血单个核细胞体外共同培养，激发和扩增人γδＴ淋巴细胞。以流式细胞仪或间接免疫荧光技术分析细胞表型；再以５１Ｃｒ４小时释放试验检测γδＴ淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。结果（１）采用本培养系统，可以使来自健康人或肿瘤患者的外周血γδＴ淋巴细胞得以选择性激发和扩增，由４．８％±３．４％增加至４６．０％±８．３％，在白细胞介素２（ＩＬ－２）的作用下，能迅速、大量地增殖，３周内可达１０１０以上数量级。（２）所扩增的γδＴ淋巴细胞，对肿瘤细胞株（天然杀伤细胞敏感株Ｋ５６２和淋巴因子激活的杀伤细胞敏感株Ｄａｕｄｉ）皆可介导高效杀伤活性，而对正常淋巴母细胞则无明显细胞毒作用。（３）抗热休克蛋白（ＨＳＰ）－７０单克隆抗体可阻断γδＴ淋巴细胞对ＸＧ－７细胞的反应。结论本室建立的人γδＴ淋巴细胞体外激发、扩增的方法，具有简便、迅速、重复性好的特点，对肿瘤细胞具有广谱的细胞毒活性，在肿瘤的过继免疫治疗中具有潜在的临床应用价值。     

细胞外尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸对小鼠细胞毒T细胞的影响

将小鼠细胞毒Ｔ细胞用含有不同浓度尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的ＲＰＭＩ１６４０液进行孵育，观察尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸对细胞毒Ｔ细胞的增殖及细胞毒性的影响。结果显示：尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸对细胞毒Ｔ细胞的增殖及细胞毒性均产生明显抑制作用，而且这种抑制作用在去除了尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸后仍持续存在。     

乙丙型肝炎重叠感染外周血T淋巴细胞亚群免疫球蛋白检测

对４６例乙、丙型肝炎重叠感染有关免疫功能进行检测，结果在重叠感染急肝，慢肝、肝硬化各组中免疫球蛋白呈多株式增高（Ｐ＜０．０１）。Ｃ３在慢肝、肝硬化组中下降（Ｐ＜０．０１）。ＣＤ在各组中均下降（Ｐ＜０．０１）。ＣＤ在各组中均上升（Ｐ＜０．０５）。并导致ＣＤ／ＣＤ在各组中下降（Ｐ＜０．０１）。病情越重其变化值越大。说明重叠感染者细胞免疫功能抑制，机体不能有效清除病毒，慢性化严重。     

抗原特异性细胞毒T细胞检测及其临床意义

抗原特异性细胞毒T细胞(CTL)在控制病毒感染和某些肿瘤中具有重要作用。用MHC-Ⅰ类分子的α链和β2-微球蛋白、抗原肽和有荧光染料标记的联接蛋白组成的四聚体试剂，可以检测相应的抗原特异性CTL。这项技术将对病毒性疾病和肿瘤的发病机制、患者体内细胞免疫功能的了解具有重要的意义，也为这些疾病的细胞免疫治疗提供新的方法。     

慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群检测

采用Ｗｕ单克隆抗体致敏的红细胞花环法和ＥＬＩＳＡ方法，对６８例慢性乙型肝炎患者的外周血Ｔ淋巴细胞亚群和血清乙肝病毒标志物（ＨＢＶＭ）进行了检测，选择３０例正常人做对照，同时常规检测ＡＬＴ、ＡＳＴ，对照分析ＨＢＶＭ或ＡＬＴ、ＡＳＴ与Ｔ淋巴细胞亚群的关系。结果：慢性乙肝患者ＷｕＴ８高于正常人，ＷｕＴ４、ＷｕＴ４／ＷｕＴ８比值低于正常人（Ｐ〈０．０５￣０．０１）；ＨＢｅＡｇ（＋）患者ＷｕＴ８高于ＨＢｅＡ     

细胞毒T淋巴细胞杀伤胃癌细胞的超微结构观察

目的 研究特异性细胞毒Ｔ淋巴细胞杀伤胃癌细胞ＢＧＣ－８２３的超微结构变化。方法 用２２例患者的胃腺癌细胞反复冻融后的滤液,抗ＣＤ３单克隆抗体、白细胞介素－２（ＩＬ－２）患者自体外周血淋巴细胞共同培养,体外诱导ＣＴＬ,然后将ＣＴＬ与ＢＧＣ－８２３共同孵育,用电子显微镜观察ＣＴＬ作用于ＢＧＣ－８２３后的超微结构改变。结果 电镜观察可见ＣＴＬ包围并破坏靶细胞,靶细胞凋亡的形态表现为异染色质浓缩呈特征性半     

NK、T混合淋巴细胞抑制肿瘤细胞的体外研究

目的:探讨人外周血淋巴细胞诱导扩增的NK、T混合淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤特性。方法:MTT法测定培养后NK、T混合淋巴细胞对PLA-801D、A549、LS-174 t及MDA-MB-231肿瘤细胞系的抑制率,对PLA-801D进行不同效靶比及不同作用时间抑制率的测定。结果:NK、T混合淋巴细胞对4种肿瘤细胞系均有明显抑制作用,且不同细胞系间抑制率具有显著差异(P<0.05)。结论:NK、T混合淋巴细胞对多种肿瘤细胞系具有强大的抑制作用,对PLA-801D抑制率与效靶比成正比,作用4 h有最大抑制率。     

慢性HBV感染者特异性细胞毒性T淋巴细胞及HLA-A2的变化研究

目的：探讨慢性HBV感染者特异性细胞毒性T淋巴细胞（specific cytotoxic T lymphocyte,CTL）及人类白细胞抗原一A2（human leucocyte antigen-A2,HLA-A2）的变化。并分析CTL与血清丙氨酸氨基转移酶（alanineaminotransferase,ALT）水平和病毒载量的关系,以了解慢性HBV感染者特异性细胞免疫功能的状态。方法：采用HLA-A2限制的HBVcore18-27抗原表位肽五聚体（MHC Pentamersl法结合流式细胞技术,分析CHB组慢性乙型肝炎46例、LC组乙型肝炎肝硬化29例和NC组23例正常对照健康体检者,外周血HBV特异性CTL及HLA-A2的变化,并分析CTL与ATL水平和病毒载量的关系。结果：CHB组、LC组HLA-A2检出率均明显高于NC组;ALT水平和病毒载量与HBV特异性的CTL有一定的关系。结论：采用HLA-A2限制的HBVcore18-27抗原表位肽五聚体（MHCPentamers）法结合流式细胞技术可以检测到低水平的HBV特异性CTL;HLA-A2是乙型肝炎肝硬化的易感基因之一;ALT水平和病毒载量与HBV特异性CTL有一定的关系。     

HCV特异性T淋巴细胞输注疗法治疗慢性丙型肝炎的临床研究

目的探讨HCV特异性T淋巴细胞疗法的抗病毒疗效。方法应用此疗法治疗慢性丙型肝炎30例,观察治疗后肝功能、HCV RNA、抗-HCV等的变化,并追踪随访半年。结果经该疗法治疗后患者肝功能明显改善,HCVRNA阴转率达56.67%,且进一步研究发现治疗前患者体内HCV RNA≤105copies/mL时病毒阴转率显著高于HCVRNA〉105copies/mL时（72.22%vs 33.33%）。结论 HCV特异性T淋巴细胞输注治疗慢性丙型肝炎是安全有效的。