人类鼻咽癌端粒酶活性的研究及其临床意义

目的 探讨端粒酶在鼻咽癌中的表达及其临床意义。方法 采用ＴＲＡＲ－银染法对４２例鼻咽部低分化鳞状细胞癌、１０例鼻咽部正常粘膜和８例鼻咽纤维血管瘤进行端粒酶活性检测及血清ＶＣＡ／ＩｇＡ检测,并分析其与临床病理的关系。结果 鼻咽部正常粘膜和鼻咽癌端粒酶阳性率分别为２０％和８８．１％,８例鼻咽纤维血管瘤均未检测到端粒酶活性。鼻咽癌伴颈部淋巴结转移者端粒酶阳性率高于无颈部淋巴结转移者（Ｐ＝０．０３５）,临     

多基因共沉默对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤影响的研究

目的 应用基因克隆技术构建一个载体同时编码四个不同基因的真核表达质粒,并与单基因质粒作对比,通过裸鼠成瘤实验研究其对体内鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响.方法 构建同时表达血管内皮生长因子(VEGF)、致癌基因蛋白(c-myc)、存活素(survivin)和端粒酶反转录酶(hTERT)并含荧光素标记的短发夹RNA质粒(命名为P-1),并构建单独表达VEGF、c-myc、survivin 和hTERT的质粒(分别命名为P-2、P-3、P-4和P-5),建立人鼻咽癌细胞CNE-2Z细胞株裸鼠皮下接种模型,分别将其转染于荷瘤裸鼠瘤体内,以激光共聚焦显微镜观察质粒在瘤体内的转染及表达情况.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)在mRNA水平上检测对目的基因表达的抑制作用,免疫印迹法在蛋白水平上检测对目的基因的封闭效果.脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL法)检测各组移植瘤细胞凋亡率.结果 所有裸鼠均接种成功,l周左右可见皮下肿瘤形成,并随时间延长不断增大.各质粒组载体转入瘤体后,共聚焦显微镜下见癌组织中有绿色荧光表达,而空白对照组未见绿色表达荧光.肿瘤体积生长曲线表明,单基因组和多基因组肿瘤生长明显受到抑制,以多基因组肿瘤体积抑制最为明显.肿瘤抑制率在Pl～5组分别为82.4%、46.2%、48.5%、51.9%和46.8%.RT-PCR和免疫印迹法在体内实验证实单基因质粒组主要引起单个基因mRNA和蛋白的表达下降,而多基因质粒组可以同时下调四个不同基因mRNA和蛋白的表达,TUNEL实验表明多基因质粒能更有效地促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤的生长.结论 多基因共沉默对鼻咽癌基因治疗有着潜在的应用前景,同时阻断多个基因可能是恶性肿瘤基因治疗的一个希望所在.     

维甲酸抑制鼻咽癌端粒酶和hTR表达及诱导凋亡的研究

目的:探讨维甲酸(RA)诱导鼻咽癌端粒酶及hTR表达下降和凋亡改变。方法:10-5mol/L维甲酸处理HNE1细胞后,采用TRAP PCR ELISA、逆转录巢式PCR、凋亡指数及透射电镜检测端粒酶、hTR表达及凋亡改变。结果:加入维甲酸6 d后,HN E1细胞形态不规则,细胞悬浮,细胞数减少,端粒酶及hTR表达受抑制,间接定量显示端粒酶活性(0.68±0.14)U只及对照组(1.16±0.46)U的1/2,凋亡指数及细胞明显高于对照组(P<0.05)。结论:维甲酸能明显抑制鼻咽癌细胞中端粒酶及hTR表达,并诱导该类肿瘤细胞增殖受阻及发生凋亡改变。     

EGCG联合放疗治疗鼻咽癌裸鼠移植瘤模型

目的 研究表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对鼻咽癌裸鼠移植瘤放疗的增敏效应及survivin和VEGF的表达及意义.方法 体外培养低分化鼻咽癌CNE-2细胞,接种于20只雄性裸鼠皮下,待肿瘤结节约4～6 mm时,随机分为生理盐水组、EGCG组(30 mg/kg)...     

田基黄对人鼻咽癌细胞CNE-2生长和凋亡的影响

目的探讨田基黄对人鼻咽癌细胞CNE-2的抑制和凋亡作用,为其临床应用提供实验依据。方法SRB法检测田基黄对CNE-2细胞生长的抑制作用,PI分析细胞周期的变化、Annexin V检测细胞凋亡的发生。结果田基黄抑制CNE-2细胞的生长,引起细胞死亡;田基黄诱导CNE-2细胞发生凋亡和坏死;田基黄作用人鼻咽癌细胞后S期细胞的比例增加,G2/M期细胞的比例减少。结论一定浓度的田基黄可明显抑制人鼻咽癌细胞CNE-2生长,并诱导其凋亡,机制可能与阻滞细胞停留在S期有关。     

短发夹RNA抑制hTERT基因对鼻咽癌细胞端粒酶活性及PCNA和Caspase-3蛋白表达的影响

目的:研究靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)的短发夹RNA(shRNA)对鼻咽癌细胞系(CNE)端粒酶活性及PCNA、Caspase-3蛋白表达的影响.方法:构建表达靶向hTERT mRNA特异的shRNA的质粒pEGFP-shTERT.将pEGFP-shTERT转染CNE细胞,TRAP PCR-ELISA法检测端粒酶活性,MTT法测定细胞增殖活性,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blotting检测蛋白表达.结果:pEGFP-shTERT成功转染入CNE细胞后, 端粒酶活性显著下降;细胞增殖活性明显受抑制;大量细胞凋亡;处理后24及48 h,PCNA蛋白下调至64.41%、58.67%(P<0.05),Caspase-3上调到1.55、1.60倍(P<0.05).结论:shRNA靶向抑制hTERT基因在鼻咽癌CNE细胞系中的表达,能显著地抑制细胞的端粒酶活性,调节PCNA和Caspase-3蛋白表达,从而抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡.端粒酶、PCNA和Caspase-3共同参与了鼻咽癌的发生、发展过程.     

紫杉醇对鼻咽癌上皮细胞株HNE-1生长抑制和凋亡的影响

目的探讨紫杉醇对鼻咽癌上皮细胞株HNE1生长抑制和诱导凋亡作用。方法应用噻唑蓝(MTT)法、集落形成能力测定、细胞形态学观察及电镜等方法,对不同浓度紫杉醇作用不同时间后HNE1细胞进行检测和比较。结果紫杉醇浓度为1×10-8mol/L时,对HNE1细胞生长具有明显的抑制作用,并且存在时间和一定范围内的剂量依赖关系。光镜和电镜下观察,可见细胞逐渐变圆、皱缩。细胞表面微绒毛消失,核染色质致密、浓缩呈块,胞质中可见空泡形成,细胞表面脱落形成膜包裹的凋亡小体。结论鼻咽癌上皮细胞株HNE1对紫杉醇有高度的敏感,一定浓度的紫杉醇能使HNE1细胞生长受到明显抑制,并诱导其凋亡,这种诱导凋亡的能力是紫杉醇疗效的基础,本研究为紫杉醇治疗鼻咽癌提供可靠的实验依据。     

HNP1基因转染对裸鼠鼻咽癌移植瘤生长影响的实验研究

目的:观察人α-防御紊HNP1基因对人鼻咽癌细胞株HNE-1生长的影响,探讨其在裸鼠鼻咽癌移植瘤生长中的作用.方法:HNP1基因通过脂质体介导转染人鼻咽癌HNE1细胞株,四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验观察对HNE-1细胞的细胞毒性作用,将筛选的含pcDNA3.1( )-HNP1质粒的HNE-1细胞和空pcDNA3.1( )质粒的HNE-1细胞以及单纯的HNE-1细胞培养、收集后分别注射于8周龄雌性BALB/c裸鼠的右侧腹壁皮下,观察肿瘤生长速度,免疫组织化学检测α-防御素1在肿瘤组织中的表达.结果:HNP1基因转入鼻咽癌HNE-1细胞后能成功地表达有活性的α-防御素1,MTT实验证实有细胞毒作用,转染HNP1基因组裸鼠较对照组肿瘤生长速度慢,体积小.结论:通过转基因方法能表达有活性的α-防御素1并能抑制裸鼠鼻咽癌移植瘤的生长.     

鼻咽癌细胞中增强型表达载体调控TK基因与端粒酶活性关系的研究

目的:探讨人端粒酶催化亚单位(hTERT)基因核心启动子和原核增强子CMV联合调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦系统对TK基因的活性改变及与鼻咽癌细胞中端粒酶活性的关系。方法:将改良构建后的增强型载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp-CMV enhancer及单启动子载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp(作为对照组)分别转染端粒酶阳性的人鼻咽癌5-8F细胞株及对照组细胞人乳腺癌MCF-7细胞(端粒酶阳性)及正常人血管内皮ECV细胞(端粒酶阴性),采用荧光显微镜下观察其TK基因绿色荧光蛋白表达,实时荧光定量PCR方法检测转染细胞中TK基因mRNA定量表达差异,TRAP银染法检测肿瘤细胞转染前后端粒酶活性改变并分析TK基因表达与端粒酶活性之间的关系。结果:①增强型表达载体转染鼻咽癌5-8F细胞及乳腺癌MCF-7细胞均有很强的荧光表达及TK基因的mRNA表达,比单启动子pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp及ECV细胞绿色荧光要强。实时荧光定量PCR显示,增强型载体组A值亦较对照组明显增高。②转染增强型载体(加GCV)后TRAP银染法检测鼻咽癌5-8F细胞端粒酶活...     

鼻咽癌组织细胞凋亡的检测

目的 :探讨鼻咽癌组织放疗后病理改变及其临床意义。方法 :采用TdT酶介导的生物素化dutp缺口末端标记技术和HE染色 ,检测 30例鼻咽癌组织放疗前后的细胞凋亡率 ,并比较放疗前后的组织病理改变。结果 :鼻咽癌组织放疗后的细胞凋亡率明显高于放疗前 ;放疗后的癌细胞分化趋好 ,但到放疗中期时凋亡率有所下降。结论 :鼻咽癌放疗一方面可加速癌细胞的凋亡 ,另一方面可能促使增殖的癌细胞朝分化好的方向发展 ,从而达到治疗目的     

人类鼻咽癌端粒酶活性的研究及其临床意义

目的　探讨端粒酶在鼻咽癌中的表达及其临床意义。方法　采用TRAP 银染法对 42例鼻咽部低分化鳞状细胞癌、10例鼻咽部正常粘膜和 8例鼻咽纤维血管瘤进行端粒酶活性检测及血清VCA/IgA检测 ,并分析其与临床病理的关系。结果　鼻咽部正常粘膜和鼻咽癌端粒酶阳性率分别为 2 0 %和 88.1% ,8例鼻咽纤维血管瘤均未检测到端粒酶活性。鼻咽癌伴颈部淋巴结转移者端粒酶阳性率高于无颈部淋巴结转移者 (P =0 .0 35 ) ,临床晚期 (III、IV)端粒酶阳性率高于临床早期 (I、II) (P=0 .0 48) ,而端粒酶与鼻咽癌患者的年龄、性别及远处转移均无明显相关性 (P >0 .0 5 )。鼻咽癌患者血清EB病毒VCA/IgA阳性率明显高于鼻咽粘膜正常者 (P <0 .0 0 1)。结论　端粒酶活性表达在鼻咽癌发病机制中起着重要作用。端粒酶活性结合血清EB病毒抗体的检测有利于鼻咽癌的早期诊断。     

姜黄素抗鼻咽癌细胞增殖效应研究

目的 研究姜黄素体外抗鼻咽癌NCE细胞增殖效应.方法 以浓度为25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的姜黄素处理NCE细胞48h,以MTT法、集落形成法检测姜黄素的细胞毒作用,以AO/EB复合染色、TUNEL检测、电镜和DNA片段化分析等方法分析姜黄素对细胞凋亡的影响.结果 25μmol/L～200μmol/L的姜黄素对NCE细胞增殖的抑制率分别为39.1%、60.9 %、78.3 %与91.3%,对集落形成的抑制率分别为47.0%、72.0%、85.0%与100%;并且可诱导NCE细胞凋亡.结论 姜黄素以剂量依赖性方式抑制鼻咽癌细胞增殖活性,可能是通过细胞凋亡诱导效应而发挥作用.     

姜黄素诱导鼻咽癌NCE细胞凋亡机制的研究

目的探讨姜黄素诱导人鼻咽癌NCE细胞凋亡的分子机制。方法通过吖啶橙-嗅化乙锭复合染色、原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶分析法检测、电镜和DNA片段化分析法分析姜黄素对NCE细胞凋亡的影响，并应用流式细胞术、Western Blot、RT—PCR方法探讨姜黄素对细胞线粒体膜电位、半胱氨酸蛋白酶-3（cysteine proteases-3，caspase-3）酶活性、胞质CytC、Fas mRNA及蛋白表达的影响。结果终浓度100μmol／L的姜黄素可诱导NCE细胞凋亡；与姜黄素共孵育12、24、48h，凋亡细胞的阳性率分别为25．6％、40．3％、54．5％。姜黄素处理后NCE细胞线粒体膜电位下降，12、24、48h的线粒体膜电位下降的阳性率分别是26．8％、42．3％、68．2％。caspase-3酶活性增强，12、24、48h表达caspase-3酶活性细胞的阳性率分别是80．5％、100％、100％。胞质CytC含量显著增强，Fas mRNA及蛋白表达水平上升，Fas蛋白阳性率由33．6％上升到89．9％。结论姜黄素可能通过线粒体途径与死亡受体途径诱导鼻咽癌NCE细胞凋亡。     

端粒酶抑制因子PinX1基因在鼻咽癌细胞中的表达及作用效应分析

目的 探讨PinX 1基因在鼻咽癌细胞中的表达及其作用效应分析.方法 构建包含全长人PinX 1基因序列的质粒载体pEGFP-C 3-PinX 1及Pinx 1的小干扰RNA,PinX1-FAMsiRNA.脂质体法转染人鼻咽癌5～8F细胞,采用RT-PCR检测PinX 1基因和端粒酶催化亚单位( hTERT) mRNA...     

水疱口炎病毒诱导人类鼻咽癌凋亡和抗肿瘤作用的体外研究

目的:通过体外培养,探讨水疱口炎病毒(VSV)对人类鼻咽癌HNE-1细胞株的抗肿瘤作用和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。方法:体外培养HNE-1细胞,实验组分别给予浓度梯度不同的VSV(以感染复数moi为单位),即0.1moi、1.0moi、10.0moi、100.0moi组和空白对照组。分别在24h和48h于倒置显微镜下观察各组肿瘤细胞出现的细胞病变,MTT实验分析VSV处理导致的肿瘤细胞杀伤作用,HO33258染色荧光显微镜检测VSV诱导体外培养的肿瘤细胞凋亡。结果:不同浓度的VSV实验组与空白对照比较,实验组肿瘤细胞出现了细胞病变,MTT实验证实VSV杀伤肿瘤细胞的作用随VSV感染复数增加、作用时间延长而增强。HO 33258染色荧光显微镜检测发现VSV能诱导体外培养的肿瘤细胞凋亡,并且凋亡率随VSV的增加而增加。结论:体外实验的结果表明VSV具有杀伤肿瘤细胞的能力,能够一定程度地诱导人鼻咽癌HNE-1细胞凋亡。     

新型重组人肿瘤坏死因子抗荷鼻咽癌裸鼠的实验研究

目的寻找理想的鼻咽癌生物治疗及联合治疗的新方法。方法利用国内建株的鼻咽癌细胞株（ＣＮＥ－２）制造了裸鼠鼻咽癌模型，用新型重组人肿瘤坏死因子（ＮｒｈＴＮＦ－α），通过不同的用药途径（局部、全身）和模式（单独、联合）观察治疗荷鼻咽癌裸鼠的疗效。并在光镜和透射电镜下观察ＮｒｈＴＮＦ－α作用后肿瘤组织细胞组织病理学及超微结构，探讨其作用机理。结果和结论①荷鼻咽癌裸鼠经ＮｒｈＴＮＦ－α治疗后可出现肿瘤出血、坏死，肿瘤缩小、消失、生存期延长。②ＮｒｈＴＮＦ－α局部使用的抗瘤效果优于全身用药。③ＮｒｈＴＮＦ－α与Ｃａｂ联合使用具有协同作用，增强抗瘤效果。④组织病理学及超微结构观察发现ＮｒｈＴＮＦ－α首先引起细胞质内线粒体、内质网肿胀、整个细胞空泡样变性，逐步导致核浓缩，崩解，最终导致细胞死亡。该研究为临床上鼻咽癌生物治疗及联合治疗提供实验基础。     

重组人内皮抑素对鼻咽癌细胞CNE2增殖及凋亡的影响

目的探讨重组人内皮抑素(rh-endostatin,rh-ES)对鼻咽癌CNE2细胞增殖、凋亡的影响。方法分别以25、50、100、200、400μg/ml的rh-ES体外处理人鼻咽癌细胞株CNE2,同时设空白对照组和细胞对照组。利用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测不同浓度和时间rh-ES作用下的细胞增殖状态;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;透射电镜观察CNE2细胞超微结构的变化。结果①MTT检测显示rh-ES(25～400μg/ml)能抑制CNE2细胞的增殖,不同浓度的rh-ES对人鼻咽癌细胞株CNE2具有不同程度的生长抑制作用,且存在时间剂量效应,以400μg/ml rh-ES作用72 h后抑制效果最为显著,各浓度组相比差异具有统计学意义。②流式细胞仪检测结果发现与CNE2细胞对照组相比,rh-ES实验组处于细胞周期G0/G1期的细胞明显增多,细胞凋亡率增加(P<0.05)。③电镜观察,rh-ES实验组CNE2细胞出现凋亡特征,细胞和细胞器皱缩,核染色质边集碎裂,核膜消失。结论 rh-ES能显著抑制鼻咽癌细胞CNE2细胞的增殖,并具有时间-剂量依赖性,其主要机制可能为诱导细胞凋亡,调整细胞周期分布。