汉滩病毒76-118株G2S0.7嵌合基因重组腺病毒的构建及表达产物鉴定

目的：在本室前期工作的基础上构建汉滩病毒M基因G2片段与S基因0．7kb片段嵌合基因的重组腺病毒．方法：构建含有汉滩病毒G2S0．7嵌合基因的转移载体pShuttle-G2S0．7，然后通过特异性的酶切将嵌合基因与腺病毒DNA相连，电转化E．coli JM109并用PCR方法进行筛选和鉴定，获得重组腺病毒Adeno-G2S0．7DNA，转染HEK293细胞得到重组腺病毒．进一步对重组腺病毒滴度和表达产物进行鉴定．结果：构建了含G2S0．7嵌合基因重组腺病毒，滴度可达10^13～10^15pfu／L；该重组腺病毒感染HEK293细胞后，表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单抗(mAb)所识别的融合蛋白．结论：利用腺病毒表达系统，成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G2生物学活性的融合蛋白G2S0．7，为进一步研究其免疫学特性奠定了基础．     

联合应用抗原递呈分子HSP70C基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建含有抗原加工递呈分子基因HSP70C的HTNV嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒。方法通过PCR扩增获得HSP70C基因,分别克隆入本室已构建的重组腺病毒转移载体pShuttle-pCAG-GnS0.7及pShuttle-pCAGGcS0.7中,进而构建新的重组腺病毒转移载体pShuttle-pCAG-GnS0.7-HSP70C及pShuttle-pCAG-GcS0.7-HSP70C。进一步通过双酶切将转移载体中的目的嵌合基因再分别克隆入腺病毒载体,得到重组腺病毒载体rAd-pCAG-GnS0.7-HSP70C、rAd-pCAG-GcS0.7-HSP70C,使用Pac I线性化后转染HEK293细胞,包装后获得重组腺病毒,感染HEK293细胞后用免疫荧光法检测表达产物。结果经过酶切、PCR扩增和测序结果显示,各重组腺病毒转移载体及重组腺病毒载体构建正确。免疫荧光实验检测到各重组腺病毒中目的蛋白的表达。结论成功制备了含抗原递呈分子HSP70C基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒,为进一步研究构建的汉滩病毒重组腺病毒的免疫学特性奠定了实验基础。     

汉坦病毒S基因0.7 kb片段真核载体的构建、表达及基因免疫

目的 在本室前期工作的基础上,进一步进行汉坦病毒S基因0．7kb片段的真核表达及基因免疫的研究。方法 构建汉坦病毒76－118株S基因5'端700bp片段的真核表达载体pcDNA3.1-S0.7,脂质体转染COS－7细胞,免疫荧光检测表达结果;用该质粒免疫BALB／c小鼠,并用免疫荧光法及ELISA法检测免疫的体液免疫应答效果。结果 免疫荧光检测结果表明,目的基因在COS－7细胞中获得瞬时表达;用pcDNA3.1-S0.7基因免疫小鼠可引起抗汉坦病毒核蛋白（NP）特异性的抗体应答。结论 汉坦病毒S基因0．7kb片段可刺激机体产生特异的抗汉坦病毒体液免疫应答。为进一步进行细胞免疫反应的检测及基因疫苗的研究提供实验基础。     

人类疱疹病毒8型肿瘤转化基因K12的分离及在昆虫细胞中的表达

目的：分离人类疱疹病毒8型(HHV-8)肿瘤转化基因K12，克隆至杆状病毒载体并在昆虫细胞中作尝试性表达。方法：设计一对引物，在引物的5’端分别引入。BamH1、EcoRI酶切位点，以佛波脂刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板，PCR扩增HHV～8肿瘤转化基因K12。将经序列测定后的PCR产物克隆进杆状病毒转移载体pVLl393中，构建成重组K12杆状病毒转移载体pVL-K12，并与线性：BaculoGold病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9，获得重组病毒。RT-PCR检测K12 mRNA转录水平；间接免疫荧光染色(IFA)检测K12编码蛋白在Sf9细胞中的表达状况。结果：含HHV-K12基因重组杆状病毒在昆虫细胞Sf9中获得表达，经IFA证实该重组蛋白为HHV-8特异性蛋白。结论：杆状病毒载体能够介导HHV-8肿瘤转化基因K12编码的蛋白在昆虫细胞中表达。     

戊型肝炎病毒ORF3基因在杆状病毒系统中的表达与免疫学性质

目的 利用杆状病毒系统表达戊型肝炎病毒（HEV）ORF3,为进一步研究免疫学性质与功能提供基础。方法 通过RT－PCR方法获得HEV ORF3基因的目的基础片段,插入中间转染载体质粒pVL1393,构建重组质粒,再与杆状病毒线性DNA（BaculoGold^TM）共转染Sf9昆虫细胞,通过同源重组得到重组杆状病毒,以此重组杆状病毒感染昆虫细胞后,对表达的重组蛋白进行免疫学检测并免疫小鼠。结果 表达的重组蛋白约占昆虫细胞总蛋白的2％,可被戊型肝炎患者与实验猴阳性抗血清有效识别,并能诱导小鼠产生对HEV特异性免疫应答。结论 重组杆状病毒可高效表达HEV ORF3基因片段,表达产物具有HEV特异的免疫原性。     

GDNF和EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的重组杆状病毒载体。方法 将目的基因（EGFP和GDNF）克隆入杆状病毒表达载体pFastBacDual中,构建重组质粒pFB-EGFP-GDNF并予酶切鉴定;将pFB-EGFP-GDNF转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,获得重组杆状病毒载体Bacmid-EGFP-GDNF,抽提质粒并行PCR鉴定;脂质体转染法将Bacmid-EGFP-GDNF转染Sf9细胞包装病毒;免疫荧光法检测Sf9细胞EGFP和GDNF蛋白表达。结果 目的基因片段正确插入pFastBacDual载体中;重组Bacmid正确;Bacmid-EGFP-GDNF包装转染成功,获得较高病毒滴度;免疫荧光检测表明,Sf9细胞中GDNF和EGFP蛋白共表达。结论 成功构建重组杆状病毒Bacmid-EGFP-GDNF,转染Sf9细胞共表达GDNF和EGFP蛋白,为进一步研究GDNF蛋白对内耳的保护作用奠定了实验基础。     

小鼠肝炎病毒N蛋白基因在杆状病毒中的表达

目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小鼠肝炎病毒N基因. 方法 根据GenBank发表的小鼠肝炎病毒A59株N基因序列（AY700211）,设计一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增出N基因的ORF,将目的 片段克隆入pFastBacHTa中,构建重组转移载体pFastBHa-N.将重组质粒转化DH10Bac感受态细菌,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组穿梭载体Bacmid-N.通过脂质体将其转染昆虫细胞Sf9. 结果 获得了重组杆状病毒rBN,并通过Westernblot和IFA分析表明证实N蛋白在昆虫细胞中获得正确表达,且表达产物具有抗原性. 结论 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了小鼠肝炎病毒N蛋白,为进一步进行建立诊断学方法的研究奠定了基础.     

HSV-2糖蛋白D在昆虫-杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性分析

目的：在昆虫细胞中表达2型单纯疱疹病毒（HSV-2）糖蛋白D（gD2）胞外区基因,检测其免疫原性。方法：以HSV-2病毒基因组为模板,PCR扩增得到gD2片段,构建至杆状病毒质粒Bacmind中,转染sf9细胞,包装重组杆状病毒,收集后连续感染sf9细胞,收获第4代重组杆状病毒（P4）,通过Western blotting法鉴定蛋白表达情况,采用空斑实验检测重组病毒滴度,将P4代重组病毒作为种子大量感染sf9细胞,上清经镍柱亲和层析进行纯化,将纯化后的蛋白在第0、2和4周免疫BALB/c小鼠（gD2组）,以PBS作为阴性对照（PBS组）,ELISA检测小鼠血清中gD2特异性IgG滴度。结果：PCR鉴定和DNA测序,重组表达质粒gD2-Bacmind构建正确,空斑实验检测重组病毒滴度为2.0×10⁹ pfu·mL^-1,纯化的gD2重组蛋白在相对分子质量37000处出现目标条带,纯度达90%以上。第6周gD2组小鼠免疫血清中gD2特异性IgG抗体滴度Log10平均值达到4.34,与PBS组比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论：利用昆虫-杆状病毒表达系统表达的gD2胞外区蛋白具有良好的免疫原性,可作为HSV-2疫苗的候选。     

人可溶性白细胞介素—6受体基因在昆虫细胞内的克隆与表达

目的：在昆虫细胞中表达人可溶性白细胞介素－6受体（sIL-6R)基因。方法：将人sIL-6R cDNA克隆至杆状病毒转移载体pAcGP67B中,再将重 组转移载体质粒与野生病毒AcNPV DNA共转染昆虫细胞sf9;经同源重组后,以终点稀释和斑点杂交法筛选重组杆状病毒;采用空斑分析法纯化重组的病毒,然后以纯化的重组病毒感染昆虫细胞Sf9。结果：斑点杂交实验证实,纯化得到的重组病毒含有人sIL-6R基因,SDS－PAGE结果显示,表达产物sIL-6R相对分子质量为47000左右,Western blot和受体配基结合实验表明,表达产物具有与其配基特异性地结合的能力,结论,杆状病毒－昆虫细胞能分泌表达sIL-6R,表达产物具有免疫活性和生物活性。     

HCV核心和截短的包膜蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达及其抗原性

目的:构建含HCV全长核心基因和截短的包膜蛋白E2基因的重组杆状病毒表达载体,研究其表达和抗原性.方法:以含HCV全长cDNA克隆的pGEM-HCJ4质粒为模板,PCR扩增全长的HCV核心抗原基因和截短的E2基因片段,插入转座载体pFastBacHTa构建重组转座质粒pFB-CE2t,转化DH10Bac大肠杆菌,获得重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-CE2t,以之转染昆虫Sf 9细胞进行外源基因的表达,并对其抗原性进行ELISA检测.结果:SDS-PAGE和Western blot分析表明Bacmid-CE2t在Sf 9细胞表达了HCV C-E2蛋白,并能利用细胞内蛋白酶将其裂解为单独的C蛋白和截短的E2蛋白.纯化后的蛋白能分别与HCV C蛋白、E2蛋白单抗以及慢性丙型肝炎患者血清反应.结论:HCV核心蛋白和截短的E2蛋白在昆虫细胞中成功表达并具有抗原性.     

利用昆虫杆状病毒载体表达人碱性成纤维细胞生长因子

目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growth factor,hbFGF)基因进行表达,并检测重组蛋白的特异性及生物学活性。方法将人bFGF的cDNA克隆至杆状病毒转座载体pFastBacHTb中,并转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细菌DH10Bac中,获得重组Bacmid/bFGF;纯化DNA后,转染昆虫细胞Sf21,PCR鉴定重组病毒;进一步将重组病毒感染Sf21细胞,在Sf21细胞中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western bloting分析;MTT法检测表达产物的生物活性。结果重组Bacmid/bFGFDNA直接转染昆虫细胞得到重组病毒rAcV-Bac-bFGF,病毒滴度MOI值≈8。重组病毒在感染后48h开始出现一相对分子质量为23000大小的特异带,感染后72h蛋白量明显增加,96h蛋白量达到最大,120h蛋白量开始减少。在正常昆虫Sf21细胞的对照中未见该蛋白带。Western bloting显示目的蛋白条带与人bFGF抗体发生特异反应。MTT结果显示重组蛋白能明显促进3T3细胞的分裂增殖。结论利用杆状病毒表达系统可成功表达具有生物学活性的bFGF蛋白。     

禽流感病毒H5N1血凝素基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

目的 应用杆状病毒-昆虫细胞表达体系克隆及表达禽流感病毒H5Nl血凝素H5抗原,鉴定其抗原性和生物活性.方法 PCR扩增禽流感病毒H5全长基因序列,克隆、转化制备重组杆状病毒Bacmid质粒,通过转染昆虫细胞制备重组杆状病毒进行蛋白表达.采用细胞免疫荧光、Western blotting和血凝试验分别对表达的蛋白进行抗原性和生物活性分析.结果 在昆虫细胞中成功表达禽流感病毒重组his-H5蛋白,其相对分子质量约为64 000,与豚鼠红细胞能够发生凝集反应,免疫荧光与Western blotting结果提示该重组蛋白能够与禽流感病毒H5标准血清中的抗体特异性结合.结论 经杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得的重组his-H5抗原具备天然的生物活性和抗原性,该方法为进一步研究禽流感病毒血凝素抗原生物学特性以及制备亚单位疫苗、相关抗体奠定了基础.     

以杆状病毒作为基因治疗载体的一种新方法

目的：报道一种新的基因治疗方法。方法：将人全长血小板生成素（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ,ＴＰＯ）基因克隆至ｐＢａｃＭａｍ２载体,与ＢａｃＶｅｃｔｏｒ３０００病毒ＤＮＡ共转染昆虫ｓｆ９细胞,经筛选后获得可在哺乳类动物细胞高效表达的昆虫病毒,以此为载体,将人ＴＰＯ基因导入小鼠体内。结果：获得可在哺乳类动物细胞高效表达的昆虫病毒株,动物实验外周血小板计数升高至正常的２～３倍,ＲＴＰＣＲ结果显示ＴＰＯ在小鼠组织中得到表达。结论：重组ｒｈＴＰＯ昆虫病毒是一种有效的基因治疗载体。     

利用家蚕病毒颗粒表达和纯化抗肿瘤药物天冬酰胺酶

目的：通过家蚕病毒颗粒简化抗肿瘤药物L-天冬酰胺酶的生产纯化过程,为抗肿瘤的药物生产提供依据。方法：利用基因重组技术构建pFastdual-polh-da26-asp融合蛋白真核表达载体,利用杆状病毒表达系统在家蚕细胞中表达融合蛋白,奈氏试剂法检测L-天冬酰胺酶活性。结果： 成功构建了重组表达载体,融合蛋白在家蚕细胞中顺利表达,并检测到L-天冬酰胺酶在家蚕细胞中表达,活性为2 113.52 U/mg。结论：重组病毒颗粒成功表达,且L-天冬酰胺酶具有一定的活性;可以利用家蚕颗粒病毒简化纯化抗肿瘤药物L-天冬酰胺酶。     

昆虫杆状病毒表达系统中人骨形成蛋白3的表达及鉴定

探索人骨形成蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达规律。方法将ｈＢＭＰ３全长ｃＤＮＡ克隆入转移载体ＢａｃＰＫ８中,酶切鉴定后,将此载体与病毒ＤＮＡ经脂质体包裹转染昆虫细胞,重组病毒经蓝白选后,提取其ＤＮＡ进行ＰＣＲ反应,鉴定目的基因。收集重组病毒感染５ｄ的细胞进行免疫荧光及电子显微镜观察。结果克隆了目的基因的重组载体经内切酶消化后,琼脂糖电泳示有相应大小的目的基因片段切下,ＰＣＲ电泳结果见有目的基因片段的     

HFRS患者汉滩病毒特异性CTL克隆靶细胞的建立及意义

目的:建立肾综合征出血热(HFRS)患者汉滩病毒(HTNV)核衣壳蛋白(NP)特异性CTL克隆的靶细胞.方法:采用Ficoll密度梯度离心法分离HFRS患者外周血单个核细胞(PBMC),并用EB病毒(EBV)转化B淋巴细胞,建立B淋巴母细胞样细胞系(B-LCL).然后,用含HTNVS基因的重组痘苗病毒(rVV)转染B-LCL,间接免疫荧光(IFA)检测NP的表达,并用HTNV特异性T细胞克隆对转染rVV的B-LCL进行细胞毒杀伤实验.结果:B淋巴细胞经EBV感染4wk左右,可形成B-LCL.HTNV-S基因在B-LCL中能有效表达NP,且能被HTNV特异性T细胞克隆识别.结论:成功建立了HFRS患者永生化B-LCL.含HTNVS的基因重组痘苗病毒转染的B-LCL可用作HTNV特异性CTL克隆的靶细胞.     

人IL-12在昆虫细胞中的表达及其体外生物活性的检测

目的：建立表达具有生物活性的人IL-12 的杆状病毒/昆虫细胞表达系统。方法：将p40和p35 cDNA一起构建入杆状病毒转移载体pAcUW42,然后与杆状病毒AcUW1.lacZ DNA共同转染昆虫细胞Sf9,使两者产生同源重组;随后利用病毒空斑实验筛选重组的杆状病毒,再由ELISA筛选及鉴定表达IL-12的重组病毒,并进行Western Blotting和体外生物活性的检测。结果：经病毒空斑试验、ELISA和Western Blotting逐步阳性选择的IL-12重组杆状病毒,其感染Sf9细胞的上清与IL-12标准品一样具备刺激正常人外周血T淋巴细胞增生的生物活性。结论：本研究建立了能表达具有体外生物活性的人重组IL-12的杆状病毒/昆虫表达系统。     

HIV-1 gag-gp120嵌合基因重组杆状病毒载体的构建

目的 :构建含有 HIV- 1(中国株 ) gag- gp12 0嵌合基因的重组杆状病毒表达载体。方法 :利用基因重组技术将 B亚型中国株 HIV- 1的结构基因 gag与 gp12 0嵌合后再通过大肠杆菌 /杆状病毒系统构建重组杆状病毒载体。结果 :酶切电泳显示基因重组正确 ,电镜显示重组杆状病毒大量扩增。结论 :含有B亚型 HIV- 1(中国株 ) gag- gp12 0嵌合基因的重组杆状病毒表达载体构建成功 ,为进一步研究Gag- gp12 0嵌合蛋白的表达及其生物学活性奠定了基础。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在昆虫细胞中表达产物的鉴定

目的 :在昆虫细胞中表达乙型肝炎病毒 ( HBV)的表面抗原。方法 :利用已构建的含有 HBV S基因的重组杆状病毒 Bac- S,在昆虫细胞中进行表达 ,并用间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹对表达产物进行检测。结果 :重组杆状病毒感染昆虫细胞后 ,可表达相应大小的 S蛋白 ,且该蛋白可被 HBs Ag特异性单抗 ( m Ab)所识别。结论 :利用杆状病毒表达系统 ,成功地表达了具有生物学活性的 HBV S蛋白。     

狂犬病病毒糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫学特性分析

目的:利用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统对狂犬病病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein,RVG)基因进行克隆?表达?纯化,并对重组 RVG 进行免疫学特性鉴定?方法:参照 GenBank 收录的狂犬病病毒 CVS-11 株RVG基因序列,设计特异性引物,扩增目的基因?RVG 基因经BamHⅠ/KpnⅠ 双酶切后定向克隆到 pFastBac-GP67B 载体上,阳性重组转座质粒进一步转化E.Coli DH10Bac 感受态细胞,经蓝白斑筛选及 PCR 鉴定后获得重组穿梭载体 rBacmid-RVG,将其转染至对数生长期的Sf-9昆虫细胞,进行重组RVG的真核表达?His-TrapHP 纯化目的蛋白,SDS-PAGE 和 Western blot 进行鉴定?重组RVG免疫小鼠,检测其免疫原性和血清中和活性?结果:用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统表达并纯化了重组RVG,分子量约58 000?经重组RVG免疫后的小鼠血清具有中和活性?结论:重组RVG具有天然RVG的活性,为进一步研制亚单位疫苗及制备筛选中和抗体奠定了基础?