高糖对体外培养兔视网膜Müller细胞表达血管内皮生长因子的影响

目的探讨高糖对体外培养兔视网膜Müller细胞表达血管内皮生长因子（VEGF）的影响。方法体外培养兔视网膜Müller细胞，采用免疫细胞化学方法半定量检测不同浓度葡萄糖对视网膜Müller细胞表达VEGF的影响。结果高糖可以明显增加Müller细胞VEGF的表达，且具有一定的浓度依赖性。结论高糖促进体外培养兔视网膜Müller细胞VEGF的表达，提示高血糖作为糖尿病视网膜病变（DR）的始动因素，其可能机制之一为诱导Müller细胞VEGF的表达。     

大鼠视网膜Müller细胞的培养与鉴定

目的:仿照前人建立的方法,优化SD大鼠视网膜Müller细胞体外培养的技术和方法,为后续相关研究建立实验室条件.方法:使用胰蛋白酶消化的方法分离新生SD大鼠视网膜Müller细胞,以DMEM为培养基体外培养,光镜观察.采用电镜观察及荧光免疫组织化学染色的方法进行鉴定.结果:培养的细胞贴壁生长,原代细胞胞体狭长,细胞质丰富,折光性好.电镜下可见特征性的中间丝(直径8～10 nm),细胞器丰富;荧光免疫组织化学显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和谷氨酰胺合成酶(GS)阳性.结论:酶消化法培养SD大鼠视网膜Müller细胞是一种稳定、可靠的方法.     

羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞增殖影响的实验研究

目的观察羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞增殖能力的影响。方法（1）取第四代兔视网膜Müller细胞以3×10^4个／ml接种于96孔板，200μl／孔，24h后加入不同浓度羊膜匀浆条件培养基（800、400、200、100μg／ml），培养24、48、96h后，用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测Müller细胞增殖率。（2）第四代兔视网膜Müller细胞以4×10^4个／ml密度接种于预置有盖玻片的6孔板中，24h后加入不同浓度的羊膜条件培养基，继续培养48h后，免疫组化细胞核增殖抗原（PCNA）检测。（3）4代兔视网膜Müller细胞以4×10^4个／ml接种于6孔板中，24h后加入不同浓度的羊膜条件培养基，继续培养48h，流式细胞仪观察细胞周期变化。结果随着条件培养基中羊膜匀浆浓度的增加，对兔视网膜Müller细胞的增殖效应逐渐增强，800μg／ml时获得最大增殖效应，细胞增殖率为62．5％；细胞周期分析显示：进入S期的细胞数明显增加（56．49％）。在羊膜匀浆浓度恒定条件下，随着时间延长，其对视网膜Müller细胞的增殖效应逐渐加强，在48h即达到较高的增殖效应，96与48h相比差异无统计学意义（F=0．233、0．007，P=0．492、0．729）。800μg／ml组和400μg／ml组PCNA阳性表达率（0．84±0．07；0．79±0．06）与对照组（0．54±0．12）相比差异具有统计学意义（x^2=-0．182、-0．151，P=0．002、0．015）。结论羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞具有促进增殖作用，且呈浓度和时间依赖性。     

兔视网膜Müller细胞原代培养

目的 :建立兔视网膜 Müller细胞原代培养的方法。方法 :组织块悬浮法培养兔视网膜Müller细胞 ,用电镜和免疫组织化学法对细胞进行鉴定。结果 :培养的细胞贴壁生长 ,呈长梭形 ,胞体肥大 ,胞浆丰富。电镜下可见特征性的中间丝 (直径 8～ 1 0 nm) ;免疫组织化学显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白 ( GFAP)和 S- 1 0 0阳性 ,八因子相关抗原阴性。结论 :组织块悬浮法培养兔视网膜Müller细胞是一种稳定、可靠的方法     

人视网膜Müller细胞的培养

目的:研究人视网膜Müller细胞的简易酶消化培养法。方法:使用单一酶消化法培养人视网膜Müller细胞,运用免疫荧光法和透射电镜技术进行细胞鉴定。结果:培养的Müller细胞胞浆丰富,电镜下胞浆中可见大量线粒体,粗面内质网,糖原颗粒和直径为8～10 nm的微丝,免疫荧光显示95%以上细胞可见阳性谷氨酰胺合成酶、神经胶质纤维酸性蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、中间丝波形蛋白。结论:简易酶消化法可成功用于人视网膜Müller细胞的培养。     

反复胰蛋白酶消化法培养SD大鼠视网膜Muller细胞

目的：通过反复胰蛋白酶消化法，建立Muller细胞的培养和纯化方法。方法：采用新生7天的SD大鼠，解剖镜下取视网膜，反复胰蛋白酶消化法消化贴壁后的细胞，细胞形态一致后行免疫组织化学和形态学检查。结果：所得细胞的90％左右谷氨酰胺合成酶（GS）免疫组化染色阳性；荧光显微镜下可见细胞胞体巨大，足突明显，证明是Muller细胞。结论：反复胰蛋白酶消化法是一种简单、可靠的Muller细胞培养方法。     

新生大鼠视网膜神经元的改良培养及鉴定

目的探讨新生大鼠视网膜神经元获取和体外培养的方法,为视网膜神经细胞的基础研究提供合适的模型。方法采用酶消化法获取生后7—8天的SD（Sprague—Dawley）乳鼠的视网膜神经细胞,使用DMEM／F12培养液在体外培养,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学鉴定细胞类型。结果0．25％胰蛋白酶和0．02％EDTA联合消化能使视网膜神经细胞分散,获得单细胞悬液;多聚赖氨酸包被培养皿有助于神经细胞贴壁生长;体外培养第7天的视网膜神经细胞中,视网膜神经元占80％左右,其中50％以上为光感受器细胞。结论酶消化法原代培养视网膜混合神经细胞简单、可行,为视网膜神经细胞的基础研究提供良好的体外模型。     

两种大鼠视网膜Müller细胞培养方法比较

目的比较酶消化法与组织块法培养大鼠视网膜Müller细胞的效果。方法将新生3d的SD大鼠视网膜分离为小组织块,分别采用酶消化法与组织块法进行体外培养,采用换液时机械震荡等方法获得纯化的Müller细胞。从细胞形态学、细胞增殖及免疫细胞化学染色阳性率方面比较两种细胞培养方法的效果。结果酶消化法获得的Müller细胞数量多于组织块法(t=2.264,P<0.05),且用时短。两种方法培养的纯化Müller细胞增殖速度及免疫细胞化学染色阳性率比较差异无显著意义(P>0.05)。结论酶消化法是一种高效的大鼠视网膜Müller细胞培养方法。     

一种改良的Sprague Dawley新生大鼠视网膜Müller细胞培养方法

目的改良Sprague Dawley(SD)新生大鼠视网膜Müller细胞培养方法。方法取新生1～2 d的SD,分2 d完成视网膜Müller细胞的提取,第1天将眼球浸泡于含体积分数1%双抗的无血清高糖达尔伯克改良伊戈尔培养基(DMEM)中,置于37℃、含体积分数5%CO2的培养箱内过夜;第2天,去培养基,以2. 5 g·L-1胰蛋白酶消化眼球1 h,分离视网膜组织,加入含体积分数1%双抗和体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基,制备细胞悬液接种培养; 24 h后换液,6～8 d后传代,传至第4代,细胞免疫荧光染色法鉴定Müller细胞纯度。结果 Müller细胞贴壁生长良好,细胞体宽大,细胞质丰富,细胞核呈圆形或椭圆形,无神经元共生长,Müller细胞纯度> 95%。结论改良的SD新生大鼠视网膜Müller细胞培养方法操作简单,细胞纯度高。     

高糖对视网膜Müller细胞碱性成纤维细胞生长因子表达及钙离子通道的影响

目的：观察在高浓度葡萄糖条件下体外培养兔视网膜Müller细胞碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）的表达及其钙（Ca2+）通道的变化。方法：采用免疫细胞化学及透射电镜方法鉴定体外培养的兔视网膜Müller细胞;应用免疫细胞化学方法定性观察高糖条件下视网膜Müller细胞bFGF表达的变化;利用膜片钳技术观察高糖条件下Müller细胞Ca²⁺通道的变化。结果：高糖可以刺激视网膜Müller细胞表达bFGF,对Ca²⁺通道无明显影响。 结论：高糖刺激Müller细胞bFGF的表达,而发挥促血管生成的作用,在此过程中Ca²⁺通道无明显变化。     

羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞增殖影响的实验研究

目的观察羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞增殖能力的影响。方法（1）取第四代兔视网膜Müller细胞以3×10^4个／ml接种于96孔板,200μl／孔,24h后加入不同浓度羊膜匀浆条件培养基（800、400、200、100μg／ml）,培养24、48、96h后,用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测Müller细胞增殖率。（2）第四代兔视网膜Müller细胞以4×10^4个／ml密度接种于预置有盖玻片的6孔板中,24h后加入不同浓度的羊膜条件培养基,继续培养48h后,免疫组化细胞核增殖抗原（PCNA）检测。（3）4代兔视网膜Müller细胞以4×10^4个／ml接种于6孔板中,24h后加入不同浓度的羊膜条件培养基,继续培养48h,流式细胞仪观察细胞周期变化。结果随着条件培养基中羊膜匀浆浓度的增加,对兔视网膜Müller细胞的增殖效应逐渐增强,800μg／ml时获得最大增殖效应,细胞增殖率为62．5％;细胞周期分析显示：进入S期的细胞数明显增加（56．49％）。在羊膜匀浆浓度恒定条件下,随着时间延长,其对视网膜Müller细胞的增殖效应逐渐加强,在48h即达到较高的增殖效应,96与48h相比差异无统计学意义（F=0．233、0．007,P=0．492、0．729）。800μg／ml组和400μg／ml组PCNA阳性表达率（0．84±0．07;0．79±0．06）与对照组（0．54±0．12）相比差异具有统计学意义（x^2=-0．182、-0．151,P=0．002、0．015）。结论羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞具有促进增殖作用,且呈浓度和时间依赖性。     

缺氧对Müller细胞水通道蛋白4及血管内皮生长因子的影响

目的:观察缺氧条件下,体外培养的人视网膜Müller细胞上水通道蛋白4(AQP4)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。方法:酶消化法培养人视网膜Müller细胞,免疫荧光和透射电镜进行细胞鉴定,CoCl2诱导细胞缺氧,RT-PCR测定视网膜Müller细胞AQP4和VEGF基因的表达。结果:免疫荧光显示95%以上细胞谷氨酰胺合成酶、神经胶质纤维酸性蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、中间丝波形蛋白呈阳性。Müller细胞AQP4 mRNA和VEGFmRNA的表达在缺氧条件下均升高,VEGF更明显,且呈部分浓度和时间相关性。缺氧12 h时VEGF mRNA表达达高峰,24 h时AQP4 mRNA达高峰。结论:AQP4和VEGF均与缺氧时的细胞水肿有关,二者关系密切,VEGF的作用较早且强。     

高糖和缺氧对体外培养视网膜M üller细胞VEGF表达的影响

目的 :观察体外培养兔视网膜 Müller细胞在高糖和缺氧条件下血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的变化。方法 :采用免疫细胞化学、原位杂交和ELISA方法对高糖和缺氧条件下体外培养兔视网膜 Müller细胞 VEGF的表达进行定性定量测定。结果 :高糖能刺激 VEGF表达 ,且通过转录水平调节 ,这种调节呈时间和剂量依赖性。 Co Cl2 能造成 Müller细胞不完全缺氧 ,刺激 VEGF的分泌。结论 :Müller细胞在高糖、缺氧条件下 VEGF表达增强 ,VEGF表达水平的升高可能是高糖及缺氧条件下促进糖尿病视网膜病变的因素之一。     

高糖对体外培养兔视网膜Müller细胞AQP4表达的影响

目的：观察体外培养兔视网膜Müller细胞在高糖条件下水通道蛋白-4（AQP4）表达的变化。方法：采用体外培养的兔视网膜Müller 细胞，分为正常对照组及高糖组（葡萄糖浓度：30、40和50 mmol•L^-1），分别培养1、3和5 d；采用免疫细胞化学、流式细胞术及RT-PCR方法对Müller 细胞AQP4的表达情况进行检测。结果：高糖组Müller 细胞AQP4表达的绿色荧光明显弱于正常对照组（P<0.01）；流式细胞仪检测中波峰位置明显提前，AQP4表达强度较对照组明显减弱（P<0.01），且随着葡萄糖浓度的增高和作用时间的延长，AQP4表达强度逐渐减弱；血糖浓度50 mmol•L^-1培养3 d时，RT-PCR半定量分析显示，AQP4 mRNA的表达比对照组明显降低（P<0.01）。结论：高糖能降低视网膜Müller细胞AQP4的表达，且随着葡萄糖浓度的增高和作用时间的延长，AQP4的表达强度也逐渐减弱；高糖时AQP4的表达下降可能是机体对糖尿病视网膜病变的一种保护性反应。     

缺氧对视网膜Mller细胞超微结构及GFAP表达的影响

目的　探讨持续低流量缺氧条件下视网膜 Müller细胞超微结构的改变及缺氧对神经胶质酸性蛋白 (GFAP)表达的影响 .方法　采用透射电镜、western blot方法对缺氧条件下培养的视网膜 Müller细胞进行观察 .结果　缺氧 4 8h后 ,视网膜 Müller细胞的超微结构发生改变 ,细胞内 GFAP表达较对照组增高 .结论　持续低流量缺氧 4 8h,即可对视网膜Müller细胞造成一定的损伤     

缺氧对视网膜Müller细胞超微结构及GFAP表达的影响

目的探讨持续低流量缺氧条件下视网膜Müller细胞超微结构的改变及缺氧对神经胶质酸性蛋白(GFAP)表达的影响. 方法采用透射电镜、western blot方法对缺氧条件下培养的视网膜Müller细胞进行观察. 结果缺氧48 h后,视网膜Müller细胞的超微结构发生改变,细胞内GFAP表达较对照组增高. 结论持续低流量缺氧48 h,即可对视网膜Müller细胞造成一定的损伤.     

高糖对体外培养兔视网膜Müller细胞AQP4表达的影响

目的：观察体外培养兔视网膜Müller细胞在高糖条件下水通道蛋白-4（AQP4）表达的变化。方法：采用体外培养的兔视网膜Müller 细胞,分为正常对照组及高糖组（葡萄糖浓度：30、40和50 mmol•L^-1）,分别培养1、3和5 d;采用免疫细胞化学、流式细胞术及RT-PCR方法对Müller 细胞AQP4的表达情况进行检测。结果：高糖组Müller 细胞AQP4表达的绿色荧光明显弱于正常对照组（P<0.01）;流式细胞仪检测中波峰位置明显提前,AQP4表达强度较对照组明显减弱（P<0.01）,且随着葡萄糖浓度的增高和作用时间的延长,AQP4表达强度逐渐减弱;血糖浓度50 mmol•L^-1培养3 d时,RT-PCR半定量分析显示,AQP4 mRNA的表达比对照组明显降低（P<0.01）。结论：高糖能降低视网膜Müller细胞AQP4的表达,且随着葡萄糖浓度的增高和作用时间的延长,AQP4的表达强度也逐渐减弱;高糖时AQP4的表达下降可能是机体对糖尿病视网膜病变的一种保护性反应。     

肺泡Ⅱ型细胞培养方法的改良及其应用

目的：研究不同方法对体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞纯度、活力、产量、存活时间的影响。方法：采用不同浓度胰蛋白酶消化法和胰蛋白酶加胶原酶消化法消化、分离组织，低密度接种，常规浓度含血清培养和无血清培养，抗大鼠IgG包被与不包被，倒置显微镜观察细胞生长，检测细胞活力，免疫组织化学方法鉴定细胞纯度和电镜检测鉴定细胞。结果：两种方法消化、分离组织，肺泡Ⅱ型上皮细胞纯度、活力、产量、存活时间经统计学分析无显著性差异。结论：不同浓度胰蛋白酶消化分离肺组织程序相对简单、低密度接种、无血清培养所得细胞纯度能够满足体外研究肺泡Ⅱ型上皮细胞功能的需要，从而简化了体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞的程序。     

新生大鼠视网膜干细胞分离培养及其生物学特性

目的：探讨新生大鼠视网膜干细胞的分离培养及其生物学特性。方法：采用机械酶-分离法体外扩增培养SD大鼠视网膜干细胞,观测细胞增殖能力,绘制CCK-8检测生长曲线;诱导细胞分化,免疫组织化学检测细胞巢蛋白、溴脱氧尿核苷、微管缔合蛋白-2、神经胶质原纤维酸性蛋白、胸腺糖蛋白1．1的表达。结果：原代视网膜干细胞形成大量的细胞球悬浮生长,传代后的细胞也可以形成细胞球,呈线性生长,巢蛋白和溴脱氧尿核苷表达阳性;诱导分化后的细胞部分原纤维酸性蛋白、微管缔合蛋白-2、胸腺糖蛋白1．1表达阳性。结论：新生SD大鼠视网膜干细胞可在体外分离培养和扩增,表达干细胞特性,并可向视网膜节细胞分化。     

藏红花素对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用

目的:研究藏红花素对视网膜缺血再灌注损伤的保护作用。方法:将SD大鼠随机分为四组:正常对照组、缺血再灌注模型组,藏红花素给药高剂量和低剂量组。造模前3 d藏红花素给药组动物给予藏红花素腹腔注射,1次/d。通过提高眼内压复制视网膜缺血再灌注模型。再灌注后24 h处死动物,迅速摘除眼球并固定视网膜。免疫组织化学染色法观察胶质细胞酸性蛋白(GFAP)在视网膜的表达量,使用电镜观察视网膜细胞结构。结果:模型组大鼠视网膜GFAP表达量显著增加,该组大鼠视网膜超微结构为Müller细胞突起增多,电子密度增加以及中间丝蛋白成束排列。藏红花素给药高剂量组[50 mg/(kg·d)]GFAP表达量较模型组显著降低。结论:藏红花素能通过阻止Müller活化有效保护视网膜免受缺血再灌注损伤。