干扰HSP70-2的shRNA表达载体的构建及筛选

目的:利用pGenesil-1质粒构建针对热休克蛋白HSP70-2的短发夹RNA(shRNA)表达载体。方法:设计针对HSP70-2表达shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析。利用质粒转染大鼠精原细胞,用RT-PCR和Western blotting法检测转染后HSP70-2 mRNA和蛋白表达变化。结果:成功构建靶向HSP70-2的3个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-HSP70-21、pGenesil-1-HSP70-22和pGenesil-1-HSP70-23。酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。质粒筛选实验提示pGenesil-1-HSP70-23质粒对精原细胞HSP70-2基因的抑制作用最强,而pGenesil-1-HSP70-21的抑制作用最弱。结论:成功构建表达靶向HSP70-2的shRNA重组质粒载体。     

膜联蛋白Ⅱ基因短发夹RNA表达载体的构建和鉴定

目的:构建针对膜联蛋白(annexin)Ⅱ的短发夹RNA(shRNA)的表达载体,观察其对目的基因表达的影响.方法:根据GenBank中annexinⅡ基因已知序列设计了2条序列,即annexinⅡshRNA1、annexinⅡshRNA2,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照.据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接人pGenesil1载体,转化扩增后进行序列测定.3种重组表达载体均转染HEK293细胞,通过实时荧光定量RT-PCR和Western印迹法分别在基因和蛋白水平上检测各自annexinⅡ的表达,以未转染细胞作为空白对照.结果:3种重组表达载体(pGenesil1-annexinⅡshRNA1、pGenesil1-annexinⅡshRNA2和pGenesil1- negative shRNA)经限制性酶切及测序分析证明基因插入正确.转染HEK293细胞后,转染pGenesil1-annexinⅡshRNA2组细胞annexinⅡ基因和蛋白表达明显低于转染pGenesil1-annexinⅡshRNA1、pGenesil1-negative shRNA以及空转染细胞(P＜0.05),而后三者间没有明显差异.结论:成功构建了针对annexinⅡ的shRNA表达载体(pGenesil1-annexinⅡshRNA2),转染细胞后可抑制annexinⅡ基因表达.     

HBx-shRNA重组腺病毒的构建及功能鉴定

目的：构建携带绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）标签的乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X pro－tein,HBx）特异性shRNA重组腺病毒,并对其干扰效果进行鉴定。方法：将前期构建的真核表达载体pGenesil-1-HBx-shRNA和pGenesil-1-Scramble sequence的表达启动子U6连同shRNA 亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建pAdTrack-CMV-U6-HBx-shRNA和对照pAdTrack-CMV-U6-Scramble sequence穿梭质粒;酶切及DNA测序鉴定后,经PmeⅠ线性化后转化入感受态AdEasier细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramble sequence,PacⅠ酶切后转染AD293细胞获得重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA和Ad-U6-Scramble sequence;扩增病毒,测定滴度;以RT-PCR和real-time PCR鉴定重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA对HBx的干扰效果。结果：酶切鉴定得到阳性pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramble sequence重组质粒;转染到AD293细胞并包装成功;RT-PCR以及real-time PCR表明,重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA携带的干扰片段能够明显干扰HBx表达（P=0.01）。结论：成功构建了HBx特异性shRNA重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA,它能抑制HepG2.2.15细胞中的HBx的表达,为研究HBx作为肝癌基因治疗作用的一个靶点以及机制奠定基础。     

干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定

目的:利用含报告基因EGFP的pGenesil-1质粒构建干扰AFP蛋白表达的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达的载体,并进行活性鉴定.方法:设计表达短发夹RNA的互补DNA序列,经退火成双链,克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析.构建正确的重组质粒经脂质体转染HepG2细胞,检测转染率和培养细胞上清的AFP含量变化,确定重组质粒的活性.结果:构建了靶向AFP蛋白的2个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-siAFP1和pGenesil-1-siAFP2.酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功.重组质粒有效转染HepG2细胞并显著抑制AFP表达.结论:成功构建具有活性的、能够表达shRNA靶向干扰AFP蛋白的2个重组质粒载体.     

hBcl-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续基因转染和动物实验提供实验基础。方法通过RT-PCR从A549细胞中分别获得hBcl-2和hVEGF165基因片段,并克隆到pMD-19T载体。将目的基因hBcl-2、IRES元件和hVEGF165依次定向克隆到腺病毒穿梭载体质粒pAd-Track-CMV上。线性化重组穿梭质粒后通过电穿孔转化含有腺病毒骨架质粒pAd-easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。脂质体转染线性化的重组腺病毒载体质粒于HEK293细胞以包装制备重组腺病毒。重组腺病毒经PCR鉴定之后进一步扩增、纯化。通过荧光计数确定病毒感染滴度。结果克隆的hBcl-2和hVEGF165基因测序正确,酶切重组穿梭载体质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物,重组腺病毒载体质粒转染HEK293细胞3 d后观察到GFP的表达,重组腺病毒的PCR得到hBcl-2和hVEGF165基因的PCR产物,滴度测定为5×109pfu/mL。结论成功构建制备了高滴度的hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为联合基因治疗心肌梗死的研究提供实验基础。     

人FRNK重组腺病毒的构建

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建人FRNK基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法:把人FRNK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建腺病毒质粒pAdTrack-CMV-hFRNK,经PmeⅠ内切酶酶切成线性化后,采用电穿孔转化将其转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中,通过卡那霉素筛选获得阳性腺病毒重组质粒。再将获得的腺病毒重组质粒转染到HEK293细胞进行包装,获得人FRNK重组腺病毒pAdhFRNK。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果:经酶切和绿色荧光蛋白表达证明了hFRNK基因的重组腺病毒载体pAdhFRNK构建成功,并制备出高滴度的重组病毒。结论:成功构建携带人FRNK基因的重组腺病毒pAdhFRNK,为研究FRNK的基因治疗奠定了基础。     

pEGFP-N1-hIL-1Ra真核表达质粒的构建及其在兔软骨细胞中的稳定表达

目的构建含绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP—N1-hIL-1Ra,稳定转染兔软骨细胞后检测其表达。方法通过RT—PCR扩增hIL-1Ra基因,并在两端添加HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。将pEGFP—N1载体经BamHⅠ酶切后电泳鉴定,利用定向克隆技术将经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后的hIL-1Ra基因片段和pEGFP-N1载体经T4连接酶进行连接。重组的pEGFP—N1-hIL-1Ra在大肠杆菌DH5α感受态细胞内扩增,经过酶切电泳鉴定和DNA测序证明质粒构建是否成功。将构建正确的pEGFP—N1／hIL-1Ra重组质粒DNA由脂质体介导转染兔软骨细胞,RT—PCR检测基因的表达,western-blot检测蛋白的表达。结果通过对重组质粒pEGFP—N1-hlL-1Ra进行酶切鉴定以及DNA序列测定分析,证明真核表达质粒pEGFP—N1-hlL-1Ra构建成功,开放阅读框架正确。稳定转染兔软骨细胞后,RT-PCR得到目的基因片段,ELISA检测到目的蛋白的表达。结论利用DNA重组技术能成功将hIL-1Ra基因克隆入pEGFP—N1载体中,构建出真核表达质粒pEGFP-N1-hIL-1Ra,并获得了稳定表达目的IL-1Ra的兔软骨细胞系,为骨关节炎的基因治疗研究奠定了实验基础。     

人S100 A9重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的制备人S100A9(hS100A9)重组腺病毒载体,为进一步研究人S100A9蛋白的分子生物学作用奠定基础。方法从pHAHA-hS100A9中PCR扩增hS100A9片段,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-TOX,获得重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A9。酶切、聚合酶链反应(PCR)及测序鉴定正确后经PmeⅠ酶切电转入AdEasier感受态细胞,获得重组腺病毒质粒pAdhS100A9,该质粒经PacⅠ酶切后由脂质体转染至HEK293细胞中包装扩增重组腺病毒并进行滴度测定,最后通过PCR及蛋白印迹法(Western blot)鉴定重组腺病毒。结果正确扩增出hS100A9基因;重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A9均及重组腺病毒质粒pAdhS100A9构建成功,并在HEK293细胞中成功包装且扩增后滴度为1 010 I U/mL;重组腺病毒AdhS100A9在HEK293细胞中成功转录和表达。结论用pAdEasy系统成功构建hS100A9重组腺病毒载体,为探讨其生物学作用奠定了基础。     

小鼠树突状细胞相关C型凝集素-1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的树突状细胞相关C型凝集素-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1,Dectin-1)是介导抗真菌天然免疫的重要受体之一。文中旨在构建表达小鼠Dectin-1基因的重组腺病毒载体,扩增、纯化获得高浓度的重组腺病毒。方法将PCR扩增的目的片段CLEC7A-p IRES2-EGFP重组到中间载体p DONR221上,再与腺病毒骨架质粒p AD/CMV/V5-DEST重组,获得重组腺病毒质粒p AD-CLEC7A-p IRES2-EGFP,经Pac I线性化后转染人胚肾293(HEK293)细胞,收获重组腺病毒p AD-CLEC7A-p IRES2-EGFP;利用HEK293细胞大量扩增腺病毒;并进行重组腺病毒的滴度测定;用荧光显微镜和实时荧光定量PCR鉴定转染重组腺病毒组(Dectin-1基因重组腺病毒转染HEK293细胞)和转染空病毒组(空病毒转染HEK293细胞)中Dectin-1基因的表达。结果菌落PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果均显示重组腺病毒含有Dectin-1基因,腺病毒滴度为5×1011IU/m L,荧光显微镜下可见绿色荧光,PCR检测到转染重组腺病毒组Dectin-1表达量是转染空病毒组的8677.25倍。结论成功构建并获得了较高浓度的Dectin-1基因重组腺病毒载体,为下一步体内外研究Dectin-1高表达在宿主抗真菌天然免疫中的作用奠定基础。     

hLMO1编码基因重组质粒的构建及蛋白的表达和定位

目的 构建hLMO1真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO1基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞---HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO1在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO1基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为471 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为45 kDa.pEGFR-LMO1在人HEK293细胞核与细胞质均有表达.结论 成功构建了hLMO1基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO1蛋白定位于HEK293细胞的细胞质和细胞核内.