人乳头瘤病毒16型致瘤基因E6在昆虫细胞中表达及其 …

目的 研究人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）相关肿瘤患者的ＨＰＶ１６ Ｅ６抗体水平及其流行病学意义；探讨用杆状病毒－昆虫细胞表达载体系统表达的ＨＰＶ１６ Ｅ６蛋白的抗原性；方法 用ＰＣＲ从ＨＰＶ１６基因组中扩增出ＨＰＶ１６ Ｅ６完整基因，克隆至转移载体ｐＶＬ１３９３中，重组质粒ＤＮＡ与线性杆状病毒ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ－９，经噬斑筛选获得带有编码Ｅ６基因的重组杆状病毒株，并在昆虫细胞中表达。结果 Ｗｅｓｔｅ     

人乳头瘤病毒16型结构基因L1在昆虫细胞中的表达及其生物学活性

目的 研究与宫颈癌及人类其它多种组织癌症密切相关的人乳头瘤病毒16型（HPV16）的晚期基因L1的表达及其生物学活性。方法 采用PCR法从pBSSK-B/16L1扩增了来自中国妇女鲍温病组织标本的HPV16晚期基因L1,装入杆状病毒转移载体;在DH10Bac内通过转座子Tn7的介导,使携带有杆状病毒多角体蛋白基因启动子Ppolh的HPV16 L1基因整合入杆状病毒,形成重组杆状病毒;转染昆虫细胞Sf9进行表达;将感染72h的Sf9细胞包埋、切片、染色后,电镜观察。提取L1蛋白,免疫BALB／ c小鼠。结果 重组杆状病毒在Sf9细胞内高效表达出L1蛋白,经Western blot发现能与L1抗体特异地结合;薄层扫描显示所表达的L1蛋白占Sf9细胞总蛋白的比例高达31％。经透射电镜观察表明,在细胞核里有大量的重组杆状病毒形成;并且产生了大量的由HPV16 L1蛋白单体自组装的病毒样颗粒（virus-like particles,VLP)。小鼠免疫实验结果表明,所表达的HPV16 L1蛋白单体自组装的病毒样颗粒（virus-like particles,VLP)。小鼠免疫实验结果表明,所表达的HPV16 L1蛋白具有强免疫原性。结论 此研究为今后L1基因分子流行病学检查、L1蛋白的结构生物学研究、疫苗研制以及HPV相关基础性研究提供了有用的资料。     

人乳头瘤病毒16型修饰后E6E7基因免疫原性增强

利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type 16,HPVl6)E6E7融合基因(fmE6E7)，研制治疗HPVl6相关疾病的DNA疫苗。用PCR扩增fmE6E7基因后，插人真核表达质粒获得pVRl012-fmE6E7，瞬时转染Cos-7细胞，免疫荧光法检测证实其表达后，在C57BL／6小鼠后腿肌肉进行裸DNA免疫，5lCr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性Cytotoxic T lymphocyte，CTL)，间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体。研究表明修饰后的中国地方株E6E7融合基因可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应，与单独野生型E7基因免疫相比，E6E7融和基因可更好的活化CTT反应。表明修饰后消除转化活性的中国地方株E6E7融合基因可作为HPVl6治疗性DNA疫苗的靶基因。     

人乳头瘤病毒16型转换基因的序列分析

为了解中国地区宫颈癌病人中人乳头瘤病毒１６型Ｅ６Ｅ７基因结构特点,从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取组织ＤＮＡ,经ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ法鉴定标本中感染ＨＰＶ型别,选单纯感染ＨＰＶ１６两例标本ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,获得ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因后,重组入ｐＡＬＴＥＲ－１载体,进行双向测序、分析。ＤＮＡ序列分析表明：两例标本的ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７序列全长均为７７６ｂｐ,与已发表的德国标准株长度相等,两     

利用昆虫-杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒16型L1蛋白

目的 获得人乳头瘤病毒16型（Human papillomavirus type 16,HPV16)L1蛋白。方法 以pFB1为载体构建HPV16L1杆状病毒表达质 ,并感染昆虫细胞Sf9结果 收集27℃,培养72h的感染重组病毒的Sf9,提取细胞蛋白。经SDS－PAGE蛋白电泳分析,发现有一相对分子质量为56000的蛋白表达,Western blot证实所表达的蛋白为HPV16L1。结论 昆虫一杆状病毒表达系统可有效地表达HPV16L1蛋白。     

稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合基因的B16细胞系的建立

目的:构建pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,建立稳定表达HPV58E6E7基因的B16细胞系。方法:采用PCR方法扩增出HPV58E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,构建重组真核表达质粒pIRES-neo-HPV58E6E7。利用阳离子脂质体介导法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出稳定转染的阳性克隆。利用Western blot、流式细胞术、免疫荧光等检测方法验证HPV58E6E7融合基因在稳定转染的B16细胞株中的表达。结果:经PCR、限制性内切酶鉴定及测序分析,pIRES-neo-HPV58E6E7重组质粒构建正确,转染B16细胞株后,经过Western blot、流式细胞术和免疫荧光等检测显示B16细胞株能够稳定、高效表达HPV58E6E7融合基因,表明B16-HPV58E6E7稳定转染细胞系构建成功。结论:成功构建了pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,建立了可以高效、稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16细胞系。该稳定转染细胞系的建立为进一步研究HPV58治疗性基因疫苗的功能提供了良好的靶细胞,为其在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。     

重组人乳头瘤病毒16型E6蛋白的表达、纯化和动物免疫效果分析

目的 诱导表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6蛋白,制备可溶性蛋白,并通过动物免疫进行免疫效果评估.方法 采用IPTG诱导pQE30-HPV16E6/BL21(DE3)重组菌株,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定.提取包涵体进行变性处理,变性蛋白经Ni2+金属螯合层析纯化,将纯化产物用复性透析方法处理以获取可溶性蛋白.免疫Bal B/c小鼠,检测血清抗体、CD4+/CD8+和IFN-γ.结果 诱导后重组菌有相对分子量18 000蛋白质表达,以不溶性包涵体为主要表达方式.目的蛋白可与HPV16E6多克隆抗体识别,纯化和透析处理后得到可溶性的蛋白.小鼠免疫后血清抗体滴度升高,淋巴细胞CD4+/CD8+升高,IFN-γ未见升高.结论 成功表达了HPV16E6蛋白,同时处理包涵体并制备了可溶性目的蛋白.目的蛋白可刺激小鼠体内产生有效的免疫反应,该蛋白的成功制备为患者血清抗体的检测和肿瘤细胞杀伤的免疫研究奠定了坚实基础.     

人乳头瘤病毒16E6蛋白单克隆抗体的研制

运用杂交瘤技术，我们成功地建立了两株能稳定分泌小鼠抗人乳头瘤病毒１６Ｅ６蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，经鉴定单克隆抗体属ＩｇＧ１ｋ。试验结果表明，所得单克隆抗体仅１与ＰＶ１６Ｅ６融合蛋白反应。不与ＨＰＶ１６Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２融合蛋白以及Ｌ１－Ｌ２真核表达蛋白反尖，也只与Ｃａｓｋｉ细胞反应，不与Ｈｅｌａ细胞反应，初步结果说明，该抗体是ＨＰＶ１６Ｅ１６蛋白特异性的ＭｃＡｂ。     

人乳头瘤病毒16型结构蛋白在昆虫细胞中的表达

目的 在昆虫细胞中表达人乳头瘤病毒16型（HPV16）结构蛋白,为HPV16型预防性基因工程亚单位疫苗的研究以及诊断试剂的研制遵基础。方法 将目的基因克隆至杆状病毒转移载体,该重组质粒DNA与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9,通过同源重组获得重组杆状病毒,用SDS－PAGE凝胶电泳和Western blot法检测重组子在昆虫细胞中表达的目的蛋白。结果 获得了稳定高效表达HPV16结构蛋白的重组杆状病毒,L1和L2蛋白的相对分子质量分别为57000和97000,L1蛋白的表达产量约占昆虫细胞总体蛋白的25％－30％。结论 人乳头瘤病毒16型结构蛋白可在昆虫细胞内高效表达。     

人乳头瘤病毒16型E4蛋白表达、纯化及抗血清制备

目的 表达人乳头瘤病毒16型(HPV16) E4蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E4血清.方法 将HPV16 E4基因克隆入pQE30,重组质粒pQE30-HPV 16E4经鉴定后转化大肠埃希菌M15(PREP4),诱导表达并鉴定表达产物.因纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E4蛋白.免疫Bal B/C小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ水平、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 酶切和测序结果表明pQE30-HPV16F4构建成功.表达分子相对分子量(Mr)为10 000,Western blot法证明具有较高特异性.小鼠抗血清效价升高,CD4/CD8无升高,小鼠γ干扰素(IFN-γ)无升高.结论 成功制备可溶性HPV16 E4蛋白和小鼠抗HPV16 E4高效价的抗血清.     

人乳头瘤病毒16型中国株L1基因的体外真核表达

目的 构建人类乳头瘤病毒16型(HPV16)中国株晚期基因L1的真核表达系统.方法 将HPV16中国株L1基因从pCR2.1/HPV16L1定向亚克隆至pTacer-CMV载体,构建重组质粒pTaeer-CMV/HPV16L1,将重组质粒用脂质体转染N1H3T3、HeLa细胞,用透射电镜、SDS-PAGE、蛋白印迹等方法观察HPV16 L1蛋白的表达.结果 NIH3T3、HeLa细胞经pTacer-CMV/HPV16L1转染后,SDS-PAGE、蛋白印迹等实验显示可表达HPV16 L1蛋白,电镜下可见病毒样颗粒(VLP).结论 pTacer-CMV/HPV16L1构建成功,可在体外表达HPV16中国株L1蛋白.     

Human papillomavirus 16 E6 variants differ in their dysregulation of human keratinocyte differentiation and apoptosis

L83V-related variants of human papillomavirus (HPV) 16 E6, exemplified by the Asian-American variant Q14H/H78Y/L83V, were shown to be more prevalent than E6 prototype in progressing lesions and cervical cancer. We evaluated functions relevant to carcinogenesis for the E6 variants L83V, R10/L83V and Q14H/H78Y/L83V as well as the prototype in a model of human normal immortalized keratinocytes (NIKS). All E6 expressing NIKS equally abrogated growth arrest and DNA damage responses. Organotypic cultures derived from these keratinocytes demonstrated hyperplasia and aberrantly expressed keratin 5 in the suprabasal compartment. In contrast, differentiation and induction of apoptosis varied. The E6 variant rafts expressed keratin 10 in nearly all suprabasal cells while the prototype raft showed keratin 10 staining in a subset of suprabasal cells only. In addition, E6 variant NIKS expressing R10G/L83V and Q14H/H78Y/L83V were more prone to undergo cell-detachment-induced apoptosis (anoikis) than NIKS expressing E6 prototype. The combined differentiation and apoptosis pattern of high-risk E6 variants, especially of Q14H/H78Y/L83V, may reflect a phenotype beneficial to carcinogenesis and viral life cycle.     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白表达、纯化及抗血清制备

目的 表达人乳头瘤病毒16型(HPV16) E2蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E2血清.方法 采用PCR技术扩增HPV16E2基因,构建入pET21b载体,重组表达载体pET21 b-HPV16E2经鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达并鉴定表达产物.经纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E2蛋白.免疫BALB/c小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 酶切和测序结果表明pET21b-HPV16 E2构建成功.表达蛋白相对分子质量(Mr)为42 000,Western blot法证明具有较高特异性.小鼠抗血清效价升高,CD4+T细胞数量和CD4/CD8比值升高,小鼠IFN-γ无升高.结论 成功制备可溶性HPV16 E2蛋白和小鼠抗HPV16 E2高效价的抗血清.     

Identification of a naturally processed HLA A0201-restricted viral peptide from cells expressing human papillomavirus type 16 E6 oncoprotein

Human papillomavirus (HPV) DNA encoding the oncogenic proteins E6 and E7 is usually retained in cervical carcinomas, implicating these proteins as potential target antigens for immune recognition in this virally associated tumor. We have characterized endogenously processed peptides eluted from major histocompatibility complex class I molecules in cells infected with a recombinant vaccinia expressing the HPV-16 E6 oncoprotein. The reverse-phase chromatography profile of peptides eluted from isolated HLA-A0201 molecules in cells expressing the E6 oncoprotein differs from that of cells not expressing E6. Sequential Edman degradation of novel peaks found in the peptide profiles from cells expressing HPV-16 E6 led to the identification of a naturally processed HLA-A0201-restricted E6 peptide of sequence KLPQLCTEL. This approach has allowed the identification of a viral peptide which is processed and presented by cells expressing the E6 oncoprotein and is a likely target for cytotoxic T lymphocyte recognition in HLA-A0201-positive patients.     

Oncogenic potential diverge among human papillomavirus type 16 natural variants

We compared E6/E7 protein properties of three different HPV-16 variants: AA, E-P and E-350G. Primary human foreskin keratinocytes (PHFK) were transduced with HPV-16 E6 and E7 and evaluated for proliferation and ability to grow in soft agar. E-P infected keratinocytes presented the lowest efficiency in colony formation. AA and E-350G keratinocytes attained higher capacity for in vitro transformation. We observed similar degradation of TP53 among HPV-16 variants. Furthermore, we accessed the expression profile in early (p5) and late passage (p30) transduced cells of 84 genes commonly involved in carcinogenesis. Most differences could be attributed to HPV-16 E6/E7 expression. In particular, we detected different expression of ITGA2 and CHEK2 in keratinocytes infected with AA and AA/E-350G late passage cells, respectively, and higher expression of MAP2K1 in E-350G transduced keratinocytes. Our results indicate differences among HPV-16 variants that could explain, at least in part, differences in oncogenic potential attributed to these variants.