白纹伊蚊对登革病毒垂直传递能力研究

目的利用细胞及分子生物学技术，研究白纹伊蚊贵州省贵阳、兴义、毕节株对1—4型登革病毒（DEN1—4）的垂直传递能力。方法采集贵州省贵阳、兴义、毕节市市郊自然界白纹伊蚊，驯化3代。分别取羽化后3～5d龄成蚊为实验组，白纹伊蚊海南株为对照组；用DEN1—4国际参考株分别感染各组蚊虫，将感染后亲代及子1～3代成蚊制备蚊悬液，接种C6／36进行病毒分离并鉴定；间接免疫荧光法检测DEN抗原；常规方法提取总RNA。利用DENNS1基因区通用引物经逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测DEN核酸，限制性内切酶酶切分型。结果白纹伊蚊贵阳、兴义、毕节、海南株亲代蚊虫均对DEN易感；白纹伊蚊兴义株与海南株均能垂直传递DEN-1、4到子3代。传递DEN-3到子2代，白纹伊蚊兴义株能垂直传递DEN-2到子3代，白纹伊蚊贵阳．株能垂直传递DEN-1到子3代，传递DEN-2、3、4到子2代，白纹伊蚊毕节株能垂直传递DEN-1到子2代，DEN-4至子3代，未发现能垂直传递DEN-2、3。结论对DEN1—4易感的白纹伊蚊贵阳、兴义、毕节株能垂直传递DEN，且对DEN的垂直传递能力与其地理来源有关；贵州省3个地方株的白纹伊蚊卵可在干燥室温条件下越冬保存DEN。     

我国不同地理株白纹伊蚊对登革病毒的易感性

本文用棉球病毒悬液法感染白纹伊蚊,比较了我国9个不同地理株白纹伊蚊对经口感染登革病毒Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ型的易感性。实验结果表明,我国不同地理株白纹伊蚊对经口感染登革病毒的易感性有差别。海口株对三个血清型登革病毒均较易感,北京株和成都株分别对登革病毒Ⅰ型和Ⅱ型较易感,各地理株白纹伊蚊对登革病毒Ⅱ型的易感性普遍较高。本文还用蚊胸内病毒接种技术,比较了我国9个不同地理株白纹伊蚊对胸内接种感染登革病毒Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ型的易感性,结果胸内接种各型登革病毒的易感性未见明显差异,提示经口感染易感性的差别是中肠屏障的作用。本文所采用的蚊脑涂片间接免疫荧光技术检测蚊脑内登革病毒抗原的方法,蚊脑组织在玻片上分布较均匀,可避免蚊头外骨骼对脑组织的遮盖,似比蚊头压片法易于观察结果,有利于提高检出率。     

2000-2004年广州市登革热血清学和病原学分析

目的 对2000-2004年广州市登革热（DEN）病原体分离鉴定及流行特点分析，为该病的诊断、预防和治疗提供依据。方法 采用间接酶联免疫（ELISA）法、免疫斑点法、免疫层析法、对疑似患者的血清特异性抗体IgM、IgG进行检测。用C6／36细胞对早期病例血清进行病毒分离，以间接免疫荧光（McAb-IFA）、RT-PCR方法鉴定。RT-PCR法检测成蚊、蚊幼。结果 病毒分离株经用单克隆抗体间接免疫荧光（McAb-IFA）、RT-PCR检测鉴定为Ⅰ级登革病毒。检出幼蚊有登革病毒Ⅰ型。结论2001-2004年广州市的登革热流行是由Ⅰ型登革病毒感染所致，2002年出现暴发与流行并延伸到2003年。     

福建株白纹伊蚊经口感染登革2型病毒研究

目的 探讨福建株白纹伊蚊对登革2型病毒的易感性。方法 用C6/36细胞培养登革2型病毒,白纹伊蚊人工经口感染病毒混合液,14 d后分别用间接免疫荧光和RT PCR检测蚊体内的登革2型病毒。结果 用间接免疫荧光检测感染登革2型病毒的白纹伊蚊,福建株白纹伊蚊感染率为44.6%（25/56）,头部感染率为32.1%（18/56）;用RT-PCR方法扩增出511 bp片段,感染率为53.9%（14/26）。结论 福建株白纹伊蚊对登革2型病毒易感。     

广州市登革热媒介的监测分析

目的总结、评价广州市近年来登革热媒介的监测情况。方法采用布雷图指数、标准间指数、诱蚊诱卵器指数等方法监测和调查白纹伊蚊密度,同时对监测和调查所采集的白纹伊蚊样本用实时荧光逆转录聚合酶链反应进行病毒核酸检测,并对阳性结果反应产物进行序列测定。结果白纹伊蚊幼虫密度呈下降趋势。布雷图指数从2002年的11.99降到2008年的4.59,标准间指数从2003年的4.45降到2008年的0.73。但在登革热高发季节,白纹伊蚊幼虫的密度指数仍处于危险的阈值范围;流行年份白纹伊蚊密度高于非流行年份,且密度高峰提前。从采自多个地点的白纹伊蚊体内检测出登革病毒核酸,经分型鉴定为登革病毒1型。结论采用多种方法和密度指标,有利于客观地评估白纹伊蚊的密度及其防治效果,而白纹伊蚊携带登革病毒的监测则有助于对登革热流行趋势的评估和防控策略的调整。     

致倦库蚊传播登革病毒可能性的实验研究

目的：在实验室通过病毒分离和传播试验,确定致倦库蚊是否能传播登革病毒。方法：１．用大剂量登革Ⅱ型病毒（病毒滴度为１０＾－９～１０＾－１０ＴＣＩＤ５０）同时喂食致倦库蚊和白纹伊蚊,不同时间后用Ｃ６／３６细胞从蚊体内分离登革病毒。２．用吸食病毒７ｄ后的致倦库蚊和白纹伊蚊攻击小白鼠１ｄ龄乳鼠,两周后取鼠血清进行免疫荧光试验。结果：１３ｄ内不同时间均能从白纹伊蚊体内分离出登革病毒,而致倦库蚊在４８ｈ以后不     

白纹伊蚊经交配传递登革1型病毒的实验研究

目的 验证登革病毒在传播媒介白纹伊蚊间经交配传递的可能性。方法 用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测与携带登革病毒蚊虫交配后的异性不带病毒蚊虫及其子代，观察它们是否获得病毒。结果 与垂直感染获得病毒的雄蚊交配后的不带病毒雌蚊及其子代检测结果出现阳性，而与垂直感染获得病毒的雌蚊交配后的不带病毒雄蚊检测结果均为阴性。结论 雌性白纹伊蚊能够通过交配获得病毒，并传给子代；而雄性白纹伊蚊通过交配没有获得病毒。     

TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测白纹伊蚊体内登革病毒

目的初步研究TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应（TaqMan MGB Real-time PCR）检测白纹伊蚊登革病毒的敏感性，建立一种敏感、特异、重复性好的登革病毒（Dengue virus，DV）鉴定方法。方法在实验室使雌性白纹伊蚊人工感染Den-2型病毒，设不同的感染蚊虫浓度（只／500μl或只／1000μ1）和不同的分组方法（不加未染毒的蚊虫、分别用未染毒的实验室饲养的雌性白纹伊蚊补加到每份标本10、25、50只／组），利用一步法和二步法TaqMan MGB PCR检测，根据荧光信号判断结果。结果二步法TaqMan MGB PCR可检测到标本中感染蚊虫的最低浓度为2只／500μl和3只／1000μl，一步法TaqMan MGB PCR可检测到标本中感染蚊虫的最低浓度为5只／500μl，蚊自身的RNA对登革病毒RNA的检测敏感性并无明显的影响。结论TaqMan MGB探针检测白纹伊蚊体内的DV敏感度高，特异性好，是白纹伊蚊携带登革病毒指数较理想的监测方法，标本较好的处理方法为500μl标本处理液研磨20～30只／组，TaqMan MGB Real-time PCR最好采用二步法。     

PCR－RFLP技术在检测登革病毒中的应用

从登革病毒感染的C₆/36蚊细胞培养液,感染的白纹伊蚊及患者血清中提取病毒RNA,用合成的一对引物通过逆转录一聚合醉链反应(RT-PCR)扩增.取产物用Hse Ⅲ醉切,琼脂精凝胶电泳,紫外透射观寮。结果,扩增的产物及阵切片段均与预期的靶序列长度和限制醉谱分析相一致。故应用PCR-RFLP(聚合醉链反应一限制醉醉切片段长度多态性分析)技术是诊断登革病毒感染的一种简易快速的新方法。     

广州市自然界白纹伊蚊携带登革热病毒情况分析

目的通过对广州地区登革热媒介白纹伊蚊进行携带登革热病毒情况的调查，从传播媒介的角度探索该地区登革热流行的来源和特点。方法采集广州市各区新旧疫点附近的白纹伊蚊幼虫标本，饲养为成蚊后提取蚊虫总RNA，用登革热病毒特异引物经实时荧光逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）进行病毒核酸检测，并对阳性结果反应产物进行序列测定。结果在荔湾区逢源街（2006年8月）、从化市邓村（2007年4月）和白云区云溪（2007年5月）各检出1宗登革热病毒核酸阳性蚊虫标本。其中荔湾区逢源街和从化邓村标本的RT—PCR产物经过序列测定证实为登革热病毒I型。结论广州地区登革热病毒可能在自然界白纹伊蚊种群中长期存在。     

中缅边境地区孟连和澜沧县登革热媒介蚊虫调查

目的了解中缅边境地区孟连和澜沧县登革热媒介种类、生态习性和登革热病毒自然感染状况,为登革热预防控制提供科学依据。方法在孟连和澜沧县选择3个自然村作为监测点,采用人工诱捕法白天诱捕成蚊,并在房屋内外积水容器捕捞幼虫,采用RTPCR方法对现场捕获的成蚊进行登革热病毒检测。结果 2010年6-10月在孟连和澜沧县监测点共捕获蚊虫6属8亚属22种3436只,其中白纹伊蚊为优势蚊种,占捕蚊总数的33.82%;未捕到埃及伊蚊。3个观察点白纹伊蚊平均房屋指数19.3,容器指数5.84,布雷图指数30.3,千人指数68.5;白纹伊蚊孳生环境类型以竹筒、土罐类和旧轮胎等临时积水容器为主,分别占阳性积水容器数的34.1%、27.5%和17.6%;白纹伊蚊成蚊平均密度为8.98只/人工小时;成蚊密度高峰出现在7-8月;对捕获的29批白纹伊蚊(1162只)进行RTPCR检测,未发现登革热病毒感染。结论白纹伊蚊密度较高且分布广泛,应加强当地登革热监测工作。     

珠海登革病毒分离株的型别鉴定与序列分析研究

[目的]了解珠海市部分人群和入境船员中登革热的流行情况和珠海市流行的登革病毒株的型别和序列特征。[方法]分别采用胶体金快速法、酶联免疫吸附试验(ELISA)对登革热抗体进行检测；采用细胞培养和逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行病毒鉴定,并对其结构蛋白基因序列进行克隆、测序及同源性分析。[结果]来自东南亚国家船舶的船员血清中登革病毒IgM抗体检出率为4．40％,IgG抗体为20．33％,其阳性样本经RT-PCR扩增,结果为阴性。而对本室保存的2001年珠海散发的登革热患者阳性血清,经用C6/36细胞培养分离出1株登革病毒,用登革病毒通用引物和Ⅱ型特异性引物,扩增出相应的片段,证实为登革Ⅱ型病毒；该分离株(DV2-1)的基因序列与其他9株登革Ⅱ型病毒进行系统发育关系的分析,结果显示分离株(DV2-1)与GD08/98株、FJ11/99株、16681株位于相近的分支,其中与1998年广东流行株GD08/98株系统进化关系最近。[结论]2001年珠海地区登革热的散发流行为登革Ⅱ型病毒所致,推测其可能是输入性传染。     

中国2005-2007年登革热流行现状与监测分析

目的 分析2005-2007年中国登革热监测资料,描述中国登革热流行现状、疾病分布和特征.方法 对2005-2007年全国疾病监测信息报告管理系统网络直报的登革热病例资料及国家登革热监测点的监测资料,用描述性流行病学方法进行统计分析.结果 3年全国共报告登革热病例1623例,死亡1例.其中,实验室诊断1356例,临床诊断267例.输入性病例151例,占报告病例总数的9.3%;本地感染病例1472例.全国仅广东和福建省的9个地市报告本地感染疫情,其他省区均为输入性病例,输入地区主要为东南亚国家.夏季南方省份的蚊媒密度仍然较高,有84.6%的布雷图指数(BI)>5,约72.2% BI≥10.监测点未从蚊媒中分离到登革病毒,但广东省曾检测到病毒核酸.结论 国内本土持续性登革热流行尚未有效建立,但输入病例的威胁逐年增加.媒介伊蚊的广泛分布和较高的伊蚊密度、健康人群较低的抗体阳性率以及难以避免的登革热输入威胁使中国南方部分地区具备了发生登革热本地爆发性流行的潜在条件,有必要在重点地区建立蚊媒综合监测和控制系统.     

媒介动物(蚊、猪)体内黄病毒分子流行病学调查研究

〔目的〕通过对珠海注册养猪场及珠海口岸地区的蚊虫体内黄病毒的带毒率、宿主动物(猪群)及其人群进行血清黄病毒类(日本脑炎、登革热等)抗体水平的调查研究,为控制黄病毒在人群中的流行提供科学依据。〔方法〕采集养猪场猪血清、养猪场和口岸蚊标本、养猪场从业人员、入境的东南亚船员和城区部分发热病人血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法分别检测猪群和人群血清中的日本脑炎、登革热抗体;使用紫外灯诱蚊法在养猪场和口岸捕捉蚊类,经鉴定种类后,按20只蚊一组制成蚊悬液后,采用细胞培养、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以及荧光定量PCR技术检测蚊体内日本脑炎病毒、登革和西尼罗病毒等黄病毒的携带情况。〔结果〕1.猪血清日本脑炎病毒IgG抗体:结果已发表于《中国国境卫生检疫杂志》2007年第3期《珠海市部分注册猪场日本脑炎调查研究》。2.蚊媒带毒情况检测:2005年1月～2006年12月共捕获的2763只成蚊,经鉴定隶属4属8种,其中白纹伊蚊所占比例最高(32.75%),其次为致倦库蚊(26.06%)、三带喙库蚊(25.30%)、海滨库蚊(7.75%)、中华按蚊(3.84%)、骚扰阿蚊(3.18%),其他(常型曼蚊和巨型阿蚊等)(1.12%);在132组蚊研磨液的病毒细胞培养中,有7份标本出现CPE病变,使用黄病毒通用引物,RT-PCR反应能扩增出相应的阳性条带,其中白纹伊蚊组阳性3份,致倦库蚊组阳性3份,三带喙库蚊组阳性1份,但用日本脑炎病毒、登革病毒Ⅰ～Ⅳ型和西尼罗病毒等特异性引物,未能扩增出相应的阳性条带,说明可能存在着其它黄病毒类的病毒感染;采用荧光定量PCR法,对蚊悬液和细胞培养液日本脑炎、登革和西尼罗病毒进行检测,从1组海滨库蚊标本中检出日本脑炎病毒核酸阳性,但强度较弱,这与珠海地区是乙脑低发地区相一致。3.人群登革热和日本脑炎血清抗体检测:从东南亚的入境船员、本地发热病人和养猪场从业人员等血清标本511份中,登革病毒抗体IgG总阳性率为7.24%,其中以东南亚的入境船员的阳性率最高,为12.76%,没有检出登革病毒抗体IgM和日本脑炎IgM抗体。〔结论〕珠海地区存在日本脑炎的主要传播媒介,并且在蚊媒中携带有日本脑炎病毒;蚊标本细胞培养出现细胞病变和RT-PCR扩增出黄病毒基因的特异性片段,提示在捕获蚊标本中可能存在着其他病毒感染的可能;虽然养猪场猪群日本脑炎感染率不高,但存在着日本脑炎病毒的隐性感染或曾经感染过,提示不能够放松对乙型脑炎的预防控制工作,应采取积极的预防措施,防止人群和猪场日本脑炎的发生与流行。此外,研究结果表明东南亚船员有较高的登革热感染率,因此,在登革热流行期间,我国口岸应加强对来自东南亚国家交通工具员工和旅客的登革热的监测,以及有可能藏带、孳生蚊虫的废旧物品、集装箱等的检验检疫工作,以防止登革热的传入与流行。     

登革2型病毒浙江分离株的鉴定与分子流行病学研究

目的 为了对2004年浙江省报告的输入性疑似登革热病例查明病因，从分子水平分析流行毒株的生物学特征，追踪传染源，为疾病的预防控制提供实验室依据。方法 对疑似患者血清标本采用ELISA、IFA和荧光RT—PCR方法分别检测登革病毒IgM、IgG抗体和病毒核酸，并用C6／36和BHK-21细胞分离登革病毒。采用RT—PCR方法扩增病毒E基因和NS1基因后分别进行序列测定，并与不同国家和地区的登革热毒株进行同源性和进化树分析。结果 从患者血清中检测到登革病毒IgM、IgG抗体和登革2型病毒核酸，并分离到登革2型病毒；浙江省登革2型病毒分离株（ZJ／01／04）与登革2型国际标准株Jamaica、国内Fujian／10／99株和Saudi／92株在E基因上氨基酸的同源性分别为97．1％、99．2％和99．6％，而与登革1、3、4型毒株相同区域氨基酸同源性分别为68．7％、66．9％和63．6％。基因进化树显示ZJ／OI／04分离株与Saudi／92株亲缘关系最近，在进化树的同一分支上。结论 从病原学、血清学和分子生物学特征上均证实该输入病例是由登革2型病毒引起，该毒株最有可能来源于沙特阿拉伯。     

Occurrence of Aedes albopictus in the state of Pará, Brazil

It is first reported the detection of Aedes (Stg) albopictus mosquitoes in state of Par , Brazil, in the urban area of Medicil ndia, a municipality far 90 km from Altamira, where 42 adult mosquitoes were baited using human attraction. All mosquitoes were pooled and inoculated into C6/36 and suckling mice in attempts for virus isolation. No virus was isolated. The occurrence of Aedes albopictus in urban areas of the Amazon region is of concern since dengue and yellow fever viruses are endemic in the Amazon and thus there is a potential risk for this mosquito species to become infected with both viruses.