幽门螺杆菌外膜36kDa蛋白重组表纯化及初步鉴定

[目的]构建幽门螺杆菌(H. pylori) NCTC11637菌株36kDa (OMP36)外膜蛋白基因原核表达系统,探索研制H. pylori疫苗的新途径.[方法]培养和收集H. pylori NCTC11637菌株,提取基因组DNA, PCR扩增目的基因片断.将其克隆到T载体并测序,再将目的基因克隆入PET32a( ),构建重组表达载体PET32a-OMP36.转化E.coliBL21后IPTG诱导表达,经SDS-PAGE鉴定、镍亲和层析纯化、Western blot检测表达蛋白.(结果)测序分析表明,插入的基因片断为987bp,表达的蛋白的相对分子质量(Mr)约为36kDa,并显示具有良好的抗原性.SDS-PAGE检测表明,表达量占细菌总蛋白的37%,镍亲和层析纯化率约92%.Western blot检测表达蛋白具有良好的抗原活性.[结论]成功克隆了外膜蛋白OMP 36kDa的编码基因,其表达产物OMP 36有望成为新的Hp疫苗候选分子,为H. pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了良好的基础.     

幽门螺杆菌omp22基因工程菌蛋白表达条件优化、纯化及活性鉴定

[目的]优化幽门螺杆菌omp22基因工程菌(pMAL-c2X-omp22-TB1)的表达条件,并对目的蛋白进行纯化和免疫活性鉴定. [方法]在不同诱导时机、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间下诱导pMAL-c2X-omp22-TB1的表达,测定目的蛋白的表达量.在优化条件下诱导工程菌表达,采用SDS-PAGE方法对表达产物分析;Amyloss树脂预装柱对可溶性OMP22蛋白进行分离、纯化,对纯化蛋白做Westem blot分析. [结果]工程菌培养2 h时加入IPTG(终浓度为0.3mmol/L)诱导4 h,目的蛋白表达量达到菌体总蛋白的25%以上;经纯化得到了较高纯度(>90%)的目的蛋白,并具有良好的免疫原性. [结论]建立了从TB1(pMAL-c2X-omp22)可溶性表达产物中纯化较高纯度OMP22融合蛋白的方法,为进一步的动物实验和诊断性抗原的研制以及工程菌高效表达生产工艺的研究打下了基础.     

胃癌相关幽门螺杆菌蛋白图谱特征初步分析

目的：寻找幽门螺杆菌(Hp)与胃癌相关蛋白。方法：利用双向电泳分离Hp的全菌蛋白，应用ImageMaster2Dv3．1软件对3株分离自胃癌患者的Hp菌株、1株胃癌动物模型菌株及9株分离自非胃癌患者的Hp菌株的蛋白图谱进行比较，对目的蛋白进行基质辅助激光解析及电离飞行时间质谱分析，应用Mascot软件进行蛋白搜库。结果：发现3种蛋白可能与胃癌相关，经肽指纹图谱鉴定，一种为配基神经氨酸胞苷酰基转移酶，其Mowse分值为79，序列覆盖率为32％，另两种蛋白在现有的质谱库中无明确匹配蛋白存在。结论：配基神经氨酸胞苷酰基转移酶可能为与胃癌相关的Hp特异蛋白，另两种为新发现的可能与胃癌相关的Hp特异蛋白，其相关机制尚待进一步阐明。     

幽门螺杆菌超氧化物歧化酶基因克隆及表达

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种可长期定植于人类胃粘膜的革兰阴性螺旋形微需氧菌,是慢性活动性胃炎的病原体。Hp感染是消化性溃疡、胃癌和胃粘膜相关淋巴组织瘤的重要危险因素^〔1〕。研究发现,Hp中超氧化物歧化酶(SOD)基因可能与细胞毒素相关基因A蛋白(Cytotoxin-associated gene A,CagA)存在着密切关系^〔2〕,而CagA是Hp重要的毒力因子之一^〔3-5〕。因此,本实验进行体外扩增sod基因并诱导表达、纯化SOD蛋白,为进一步研究sod基因、SOD蛋白在Hp致病中的作用提供参考依据。     

幽门螺杆菌对胃黏膜上皮细胞作用后的差异蛋白鉴定

目的:鉴定幽门螺杆菌(Hp)与宿主细胞(AGS)作用后的差异蛋白。方法:应用双向电泳分离TN2株与AGS细胞相互作用前后的蛋白,应用ImageMaster 2Dv3.1软件对蛋白图谱进行比较,对目的蛋白进行基质辅助激光解析及电离飞行时间质谱分析,应用Mascot软件进行蛋白搜库。结果:共监测到2个差异蛋白斑点,经质谱分析鉴定为2种蛋白,分别是热休克蛋白60和烷基过氧化还原酶。结论:对热休克蛋白60深入研究表明,热休克蛋白60可能进入AGS细胞或结合于AGS细胞膜上,相关幽门螺杆菌感染宿主细胞后续致病过程尚待进一步研究。     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组载体的构建及鉴定

目的以幽门螺杆菌外膜脂蛋白Lpp20为目的基因,构建H.pylori Lpp20基因的真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20,为H.pylori核酸疫苗的研制奠定实验基础。方法用Pri mer5.0软件分析GenBank中H.pylori外膜脂蛋白Lpp20基因序列,设计合成相应特异性引物,引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,以H.pylori26695株基因组为模板,PCR扩增Lpp20目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1( )-Lpp20;通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体。结果以H.pylori26695株基因组DNA为模板扩增出特异的Lpp20基因片段,大小约为528bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20。结论PCR扩增得到了大小约为528bp的H.pylori Lpp20目的基因片段;并成功构建了pcD-NA3.1( )-Lpp20真核表达重组载体。     

幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定

目的 构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据.方法 提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒;采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定.结果 扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp;pcDNA3.0-GroEL重组质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中.结论 成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL.     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的构建含幽门螺杆菌（Hp）Lpp20基因的真核表达重组体,并鉴定其在Hela细胞中能否有效表达,为进一步开展Lpp20核酸疫苗与该蛋白的生物学功能的研究打下基础。方法抽提Hp标准菌株26695基因组DNA,应用聚合酶链式反应（PCR）技术从基因组DNA扩增Lpp20基因,经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pcD-NA3.1（＋）,转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定;用脂质体法将构建好的重组载体pcDNA3.1（＋）-Lpp20转染Hela细胞,通过免疫细胞化学法及Western印迹法检测其在Hela细胞中表达的Lpp20蛋白。结果成功扩增出长约528 bp的Lpp20基因,测序结果表明扩增出的Lpp20基因与Hp Lpp20序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实Lpp20基因正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,并经免疫细胞化学法和Western印迹法检测到重组体可在Hela细胞中有效表达。结论成功构建了Lpp20基因的Hp真核表达重组体,并检测到其在Hela细胞中可表达出免疫反应性良好的蛋白,为进一步探索其免疫作用及生物学功能奠定了基础。     

空肠弯曲菌28KD～31KD外膜蛋白的初步提取及鉴定

目的：探讨空肠弯曲菌28KD-31KD外膜蛋白的提取方法及其鉴定。方法：采用改良布氏肉汤培养基培养空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni，CJ)，用0．2mol／L、pH2．2甘氨酸-HCl缓冲液提取CJ外膜蛋白，Sephadex G-75分子筛层析法纯化28KD-31KD分子，SDS—PAGE分子量鉴定，Western blotting印迹法鉴定CJ甘氨酸提取物中外膜蛋白及纯化的28KD-31KD分子抗原性。结果：以甘氨酸提取CJ的外膜蛋白，Sephadex G-75层析纯化能够提取出CJ 28KD-31KD外膜蛋白，该蛋白分子能够与CJ兔抗血清发生特异性反应。结论：采用甘氨酸提取、Sephadex G-75纯化CJ 28KD-31KD外膜蛋白系一种稳定可靠的分离层析方法，提取的CJ28KD-31KD外膜蛋白具有良好的抗原性，为特异性的CJ 28KD-31KD外膜蛋白的多克隆抗体制备、CJ感染的血清学特异性诊断、CJ亚单位疫苗的研制打下基础。     

幽门螺杆菌感染与C反应蛋白水平的相关性研究

目的:幽门螺杆菌感染可能引起全身炎症反应,本研究旨在探讨慢性胃炎、胃溃疡、胃癌患者中HP感染与血清C反应蛋白(CRP)水平的相关性。方法:选取行胃镜检查及碳-14呼气试验检查的慢性胃炎患者70例,胃溃疡患者64例,胃癌患者62例,并行血清CRP水平检测。结果:慢性胃炎HP阳性组的CRP水平为(11.28±2.12)mg/L,阴性组为(8.09±1.26)mg/L,两者比较差异有统计学意义(P0.05)。胃溃疡组HP阳性组的CRP水平为(16.32±3.62)mg/L,阴性组为(13.21±2.08)mg/L,两者比较差异有统计学意义(P0.01)。恶性胃溃疡HP阳性组的CRP水平为(20.65±6.58)mg/L,阴性组为(16.12±5.86)mg/L,两者比较差异有统计学意义(P0.05)。胃溃疡组血清CRP浓度高于慢性胃炎组,差异有统计学意义(P0.05),胃癌组血清CRP水平高于慢性胃炎及胃溃疡组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:血清CRP水平在幽门螺杆菌感染的患者中增高,表明HP感染可以影响血清CRP水平,同时CRP可以作为判断HP相关性胃疾病患者病情严重程度指标之一。     

柱上切除GST标签制备幽门螺杆菌Lpp20蛋白

目的 表达幽门螺杆菌Lpp20-GST融合蛋白,获取切除GST标签的重组蛋白。方法 采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组表达质粒Lpp20/pGEX-4T-1在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,收集菌体并采用反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌3种细胞破碎方法,表达产物在谷胱甘肽琼脂糖树脂4B柱上纯化,利用凝血酶切除GST标签,用鼠抗Lpp20单克隆抗体进行纯化产物western blot鉴定。结果 高效表达出Lpp20-GST融合蛋白,相对分子质量约为4.5 kDa,产物以部分可溶性形式表达,凝血酶成功切除GST标签,纯化产物能被鼠抗Lpp20单克隆抗体识别。结论 凝血酶柱上切除GST标签获得目的蛋白。     

布氏菌外膜蛋白bp26的表达和鉴定

[目的]研究布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的克隆、表达与测序，并对其进行初步的血清学鉴定。[方法]从布鲁氏菌基因组中获得bp26基因连接入PMD18-T克隆质粒并测序，目的基因与融合表达载体PGEX-4T-1连接。构建重组质粒PGEX-4T-1／bp26，在大肠杆菌中表达该蛋白。用western—blot鉴定重组表达的GST—bp26蛋白。[结果]成功构建了PGEX-4T-1／bp26原核表达载体，并在大肠杆菌中成功表达了bp26基因，布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白。[结论]布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的成功表达，它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应，为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的物质基础。     

胃癌组织Fascin蛋白和趋化因子L20表达与幽门螺杆菌感染相关性研究

目的近年来,胃癌在我国部分地区已经呈高发趋势,对人民群众的生命健康造成严重威胁。本研究旨在探讨胃癌组织中Fascin蛋白和趋化因子L20(chemokine L20,CCL20)表达与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)感染的相关性。方法选取2015-02-04-2018-01-09阳谷县人民医院病理科收集的90例胃癌组织标本及其癌旁组织标本,采用免疫组化染色技术检测Fascin和CCL20蛋白表达,分析不同TNM分期、肿瘤病灶大小、淋巴结转移、不同分化程度和是否发生HP感染的胃癌组织中Fascin与CCL20蛋白表达差异。结果胃癌组织CCL20蛋白阳性表达率为68.89%,高于癌旁组织的26.67%,差异有统计学意义,χ2=32.152,P0.001;Fasci蛋白阳性表达率为73.33%,高于癌旁组织的33.33%,差异有统计学意义,χ2=28.929,P0.001。不同TNM分期(χ2=6.192,P=0.013)Fasci蛋白阳性表达率差异有统计学意义;不同TNM分期(χ2=5.637,P=0.018)和是否发生淋巴结转移(χ2=7.677,P=0.006)胃癌组织CCL20蛋白阳性表达率差异有统计学意义;胃癌组织中CCL20蛋白表达(r=0.450,P0.05)和Fasci蛋白表达(r=0.600,P0.05)与HP感染呈正相关。结论胃癌组织中的Fascin、CCL20蛋白表达上调,并且与HP感染有相关性。     

幽门螺杆菌感染胃癌组织nm23表达及其临床意义

为探讨胃癌组织幽门螺杆菌（Ｈｐ）感染和ｎｍ２３表达及胃癌根治术后再发癌之间的关系,用Ｗａｒｒｔｈｉｎ－Ｓｔａｒｒｙ方法法检测胃组织Ｈｐ感染,采用免疫组化Ｓ－Ｐ法检测６４例胃癌组织ｎｍ２３表达,并结合内镜及随访资料进行分析。胃癌Ｈｐ感染率、ｎｍ２３低表达率在淋巴结转移组及术后３年内有再发癌组明显增高。而且ｎｍ２３低表达与肿瘤浸润程度有关,浸及浆膜及周围脏器组ｎｍ２３低表达率为７８．６％,浸及粘膜及粘     

穿透支原体主要外膜蛋白pET20b（＋）／p35重组载体的构建、表达及鉴定

目的构建高表达且稳定的pET20b( )/p35重载体,能在其中进行诱导高表达并得到纯化的p35蛋白.方法运用Blast、Pfam等生物信息学手段对穿透支原体(Mpe)p35基因序列结构与功能预测,将p35基因全长插入原核表达载体pET20b( )中,在BL21Star^TM(DE3)进行诱导表达、用Ni柱纯化,在GSH-GSSH体系中逐渐降低其变性剂的方法复性蛋白,Western-blot进行鉴定.结果成功的构建了pET20b( )/p35重组载体,并能在宿主菌中较高表达;此蛋白以包涵体的形式进行表达.结论得到了纯化的p35蛋白,为进一步研究其生物学功能及其空间结构奠定了基础.     

恙虫病东方体蛋白基因的原核表达及活性鉴定

目的 对恙虫病东方体Gilliam株56kDa外膜蛋白基因进行原核表达，并对表达产物进行纯化，以获得有生物活性的重组蛋白，用于恙虫病诊断试剂的研制。方法 根据GiUiam株东方体56kDa蛋白基因序列设计特定引物。用PCR法扩增出编码56kDa抗原长约1320bp的DNA，克隆至原核载体PET28a，构建了表达载体PET-OTG，并获表达。表达产物经镍(Ni2 )柱亲和层析纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白印迹(Western—blot)分析鉴定。并用间接ELISA进行抗原性分析。结果SDS—PAGE检测表明重组蛋白分别以可溶性蛋白和包涵体两种方式表达，在相对分子质量约52kDa处有表达目的条带。经 Ni^2 层析柱纯化得到目的蛋白，包涵体蛋白纯化后纯度大于可溶性蛋白，达电泳纯。Western-blot证实该蛋白能被患者阳性血清所识别，用阴性血清则未出现相应印迹。间接ELISA结果表明重组蛋白具有良好的抗原性，能有效区分恙虫病阳性和阴性血清。结论 重组蛋白具有免疫反应活性。有望作为诊断抗原用于恙虫病的诊断。     

幽门螺杆菌感染对胃癌组织中Fas基因蛋白表达的影响

目的研究幽门螺杆菌(Hp)感染对胃癌组织细胞凋亡的影响,探讨Hp在胃癌发生、发展中的作用.方法用Warrthin-Starry染色法检测胃癌组织中Hp,以流式细胞学方法测定胃癌组织Fas基因蛋白的表达.结果正常胃组织中Fas表达阳性率为12.05%±3.59%,胃癌组织中Fas表达明显低于正常胃粘膜,Hp阳性癌组织低于阴性癌组织;Fas基因表达不与肿瘤的分化程度有关.结论Hp在胃癌的发生发展过程中对细胞的增殖影响较小,主要通过减弱细胞凋亡而起作用.     

幽门螺杆菌ureI和lpp20乳酸乳球菌表达载体的构建及鉴定

目的 以幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI和外膜脂蛋白lpp20为目的 基因.分别构建乳酸乳球菌表达重组载体pNZS112/ureI和pNZ8112/lpp20,为H.pylori乳酸乳球菌活菌口服疫苗的研制奠定实验基础. 方法 根据幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI和脂蛋白Lpp20的全基因序列,利用PRIMER5.0各设计一对引物,进行PCR扩增,获得ureI和lpp20目的 基因片段,将其与分泌表达载体pNZ8112进行连接,通过电击转化进入宿主菌乳酸乳球菌NZ9000细胞内,通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体,并进行重组疫苗菌稳定性检测. 结果以H.pylori标准株基因组DNA为模板分别扩增出特异的ureI和lpp20基因片段,大小分别为588 bp和528 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori乳酸乳球菌表达重组载体pNZ8112/ureI和pNZ8112/lpp20. 结论 PCR扩增得到了大小约为588 bp和528 bp的H.pylori ureI和lpp20目的 基因片段;并成功构建了幽门螺杆菌ureI及lpp20基因乳酸乳球菌表达重组载体.     

应用纯化抗原检测唾液抗幽门螺杆菌抗体的研究

[目的 ]探讨唾液相关抗体检测的临床意义。 [方法 ]以多株Hp超声上清、重组Hp热休克蛋白A亚单位(rHspA)纯品和重组Hp热休克蛋白尿素酶B亚单位 (rUreB)纯品混合物为抗原 ,采用ELISA方法对 98例患者的唾液和血清同时进行检测。 [结果 ]使用rHspA和rUreB混合纯品进行检测 ,特异性和敏感性明显优于Hp超声上清。诊断Hp感染的优劣顺序为血清IgG、唾液IgG、血清IgA、唾液IgA。[结论 ]唾液的抗体检测可用于Hp感染诊断 ,尤其是唾液IgG抗体。