转染Livin基因后骨肉瘤细胞系的多药耐药性研究

目的:探讨转染Livin基因后人骨肉瘤细胞的多药耐药变化.方法:采用基因重组技术构建Livin 基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Livin ,经酶切和基因测序分析对构建结果进行鉴定;通过脂质体将含Livin基因的表达载体转染人骨肉瘤细胞U-2OS,RT-PCR检测基因转录水平;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞在不同化疗药物作用下的细胞耐药性.结果:经酶切鉴定和基因测序分析证明真核表达载体pcDNA3.1(+)/Livin 构建成功.将该表达载体转染U-2OS细胞后,Livin基因的表达水平与野生型U-2OS细胞和转染空载体的U-2OS/neo细胞相比显著提高(P<0.01) .与U-2OS细胞和U-2OS/neo细胞相比,U-2OS/Livin细胞对ADM、CTX、MMC和DDP等化疗药物的耐药性也明显增强(P<0.01).结论:Livin基因高表达是人骨肉瘤多药耐药的原因之一.     

重组人GM-CSF逆转录病毒基因转移系统的建立及其在人肿瘤细胞中的稳定表达

目的　建立逆转录病毒介导的 GM- CSF基因转移系统 ,为 GM- CSF基因修饰的肿瘤细胞疫苗研究奠定实验基础。方法　应用基因重组技术将 GM- CSF c DNA克隆于逆转录病毒载体p DORneo,获得重组载体 p DORGM。经脂质体介导将其转染于病毒包装细胞系 PA317细胞 ,经NIH3T3细胞检测病毒滴度 ,NIH3T3放大实验检测辅助病毒 ,并用高滴度病毒感染人乳腺癌细胞系MCF- 7。结果　GM- CSF基因克隆入逆转录病毒载体 ,经 PA317细胞包装产生病毒 ,最高的病毒滴度为 1× 10 6CFU/ ml,且没有发现辅助病毒存在。重组病毒感染的人乳腺癌 MCF- 7细胞在体外长期培养中保持稳定分泌 GM- CSF,活性在 50 0～ 80 0 U/ 10 6细胞 / 2 4小时。结论　建立的逆转录病毒介导的GM- CSF基因转移系统安全、有效 ,为 GM- CSF应用于肿瘤基因治疗提供了实验基础。     

抗APO—1单抗诱导人膀胱癌多药耐药细胞凋亡的研究

目的：探讨人膀胱癌多药耐药细胞凋亡诱导途径。方法：应用免疫细胞化学、原位ＤＮＡ末端转移酶标记法、相差显微镜及电镜技术,观察ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ细胞表面Ｆａｓ抗原的表达和抗ＡＰＯ－１单抗对该细胞存活的影响及其特征。结果：Ｆａｓ抗原在ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ中有高表达,经抗ＡＰＯ－１单抗作用后,ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ细胞存活率明显降低,光镜及电镜下观察到凋亡细胞的形态学改变,原位ＤＮＡ末端转移酶标记阳性。结     

p53和c—myc异常表达与膀胱癌多药耐药性

为探讨ｐ５３和ｃ－ｍｙｃ基因异常表达与膀胱癌多药耐药性（ＭＤＲ）的关系，应用ＡＢＣ免疫组织化学方法检测６７例膀胱癌癌细胞中ｐ５３和ｃ－ｍｙｃ的表达产物及多药耐药基因（ｍｄｒ－１）产物Ｐ－ｇｐ。结果显示ｐ５３突变蛋白蓄积的膀胱癌中Ｐ－ｇｐ阳性表达率９２．３％；ｐ５３阴性者Ｐ－ｇｐ阳性率为３６．６％。Ｐ－ｇｐ表达与ｐ５３突变蛋白蓄积呈显著正相关（ｒ＝０．６４，Ｐ＜０．０５）；而ｃ－ｍｙｃ和ｍｄｒ－１的表达无明显相关。提示：ｐ５３异常表达可增加ｍｄｒ－１基因的表达，使膀胱癌细胞获得ＭＤＲ表型     

膀胱癌MRP亚克隆的建立及其MDR表型

目的 观察膀胱癌细胞多药耐受相关蛋白（ＭＢＰ）的表达情况及多药耐受（ＭＤＲ）表型。方法 将全长ＭＲＰ ｃＤＮＡ转染膀胱癌ＥＪ细胞,建立表达ＭＲＰ的亚克隆ＥＪ／ＭＲＰ,用ＲＴ－ＰＣＲ、免疫组织化学方法检测 ＭＲＰ和ｍｄｒｌ基因的表达,并检测了其对１１种化疗药物的敏感性。结果 利转染空载体的ＥＪ＝Ｖｅｃｔｘ细胞相比,ＥＪ／ＭＲＰ的ＭＲＰ ｍＲＮＡ水平提高了１４．３倍,ＭＲＰ表达部位主要位于细胞浆和细胞     

HSV-tk/GFP转基因系统的建立及转染细胞系的初步研究

HSV-tk/GCV是疾病基因治疗中常用的“自杀基因”系统.体内外的实验结果均表明:经HSV-tk转导的细胞对无毒原药丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)高度敏感,并被特异杀伤.该系统不仅可用于肿瘤基因治疗以特异杀伤肿瘤细胞,而且可在骨髓移植后选择性地清除HSV-tk转导阳性的异基因骨髓,从而降低GVHD的发生,避免由GMHD引发的一系列严重后果.能否控制GVHD,获得一定数量的HSV-tk转导阳性的骨髓细胞也很关键.由于转染效率的限制,必须经过筛选才能获得足够量的转导阳性细胞.以往采用新霉素抗性或潮霉素抗性基因进行筛选,通常需2～3周,细胞在体外长时间培养不仅浪费人力物力,而且增加了污染机会.我们采用     

TNF-α基因转染多药耐药性人乳腺癌细胞的基因表达与生物学效应

目的　探索TNF α基因能否成功导入耐药细胞并获得表达 ,发挥生物学效应。方法　以重组逆转录病毒为载体将TNF α基因导入具有多药耐药 (MDR )表型的人乳腺癌细胞系MCF7/ADR ,经G 418抗性筛选获 4株阳性克隆。PCR、Elisa法鉴定并检测TNF α基因的整合和表达。细胞计数法观察细胞生长速度的改变 ,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果　 4株阳性克隆整合了TNF α基因并获得表达 ,分泌TNF α量分别为 341pg/ml(10 6cell/48h)、5 40 pg/ml、1737pg/ml、2 875 pg/ml。与对照细胞相比 ,TNF α分泌量较低的 2株细胞克隆生长速度无明显减慢 ,而 2株高表达TNF α的细胞生长速度明显减慢 ,生长抑制率分别为 32 .4%、5 4.8% ,且细胞周期受阻于S G2 /M期。结论　TNF α基因能成功导入耐药细胞并获得表达。高表达TNF α的细胞克隆生长明显受抑。     

丝裂霉素C的给药间隔与膀胱癌细胞耐药性的研究

目的研究丝裂霉素C(MMC)的给药间隔与膀胱移行细胞癌多药耐药之间的关系及机制.方法分别间隔24、48、72和96小时,用MMC处理膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株2个小时,共5次,用MTT法检测细胞毒作用,Western blot分析p170和p53的表达.结果①MMC首次处理BIU-87、间隔24、48、72和96小时给药的IC50分别为4.41、0.71、2.83、4.51及6.16μg/ml;②间隔24小时给药,p53显著下调,未检测到p170表达,间隔48、72、96小时给药,p53持续表达,p170的表达逐渐增强.结论膀胱癌细胞的耐药性与丝裂霉素C的给药间隔密切相关,其机制可能与p53表达的变化有关.     

逆转录病毒载体介导MDR1基因转染人外周血造血干细胞的研究

目的：多药耐药基因（ＭＤＲ１）的异常扩增和过度表达是肿瘤细胞产生多药抗药性的重要原因之一。本研究试图将ＭＤＲ１导入骨髓或外周血造知干细胞并使入获得耐药表型,以用于减轻大剂量化疗对造血细胞的毒性。方法：应用反转录病毒载体ｐＨａＭＤＲ１／Ａ将ＭＤＲ１阳性。ＰＣＲ法检测转染细胞所 ＣＦＵ－ＧＭ落集中,外源ＭＤＲ１阳性比例为１／４;而未转染细胞所形成的ＣＦＵ－ＧＭ集匀为阴性。集落形成试验证明,转染和非转染     

逆转录病毒介导的IL6／IL2融合基因转导对小鼠B16细胞…

为探讨细胞因子之间对肿瘤细胞修饰的协同效果及融合基因用于肿瘤细胞转染的可行性，我们采用ＰＣＲ及柔性接头连接的方法。构建了含人ＩＬ６／ＩＬ２融合基因的逆转录病毒载体，将其转梁小鼠Ｂ１６黑色素瘤细胞，对基因转导后细胞的粘附及实验性肺转移能力进行了测定。     

多药耐药基因在白血病细胞的高效转移与表达研究

目的　研究逆转录病毒介导多药耐药基因 MDR1的转移与表达。方法　用 MDR病毒转导人类白血病细胞K5 6 2和 NB4,获得耐药细胞系 ;外源性 MDR1基因的转移和表达用聚合酶链反应 (PCR)、流式细胞术 (FCM)和半固体集落培养法分析。结果　 MDR病毒转导使白血病细胞获得经典多药耐药表型 ,78.0 %～ 98.7%的细胞表达 P-糖蛋白 ;PCR分析证实耐药细胞整合有 MDR原病毒 ,并共表达全长和异常剪切 MDR1转录本。以 K5 6 2细胞为模型 ,FCM和集落培养法发现共培养法的基因转导率 (6 7.9%～72 .5 % )明显高于上清法 (33.1%～ 46 .8% ) ,加入生长因子可提高基因转导率约 2 3%。结论　逆转录病毒可介导MDR1基因在髓系白血病细胞进行有效的转移与表达 ;MDR1基因可作为选择性标志用于基因治疗     

羟基喜树碱诱导人肺癌细胞SPC-A-1的凋亡

目的 研究羟基喜树碱体外诱导人肺癌细胞株ＳＰＣ－１凋亡的作用。方法 以不同浓度的羟基喜树碱处理在体外培养的肺癌细胞,以电子显微镜、流式细胞液和原位末端标记分析来检测细胞凋亡。结果 在０．０５mg/ml浓度下羟基喜树碱作用于体外培养的肺癌细胞２０h后,肿瘤细胞的凋亡率在８．７％～１０．４％之间,主要以早、中期的表现为主;在０．１mg/ml浓度下,作用２０h后,凋亡率为１８．６％,凋亡形态学表现主要以晚期为主。结     

野生型p53基因的导入对膀胱癌细胞抑制作用的观察

转染外源野生型ｐ５３基因对膀胱癌ＥＪ细胞的抑制作用。方法将含外源野生型ｐ５３基因的（ａｄ┐Ｗｔｐ５３）转染膀胱癌ＥＪ细胞,观察生长曲线,细胞周期变化及裸鼠体内抑瘤试验。结果转染了ａｄ┐Ｗｔｐ５３的ＥＪ细胞在体外生长速率下降,在裸鼠体内致瘤性丧失,流式细胞仪显示,ＤＮＡ合成前期或静止期的细胞比例增高。另外,ａｄ┐Ｗｔｐ５３直接注射到肿瘤组织内,可使外源野生型ｐ５３基因在肿瘤细胞内有效、稳定的表达,肿瘤表现为生长减缓,最后停止生长并有缩小。结论腺病毒载体介导基因转染效率高,速度快,安全,是很有前途的体内基因治疗载体。     

p53基因诱导胱癌细胞HTB9凋亡及相关基因的表达

目的 研究野生型p53基因诱导膀胱癌细胞凋亡的作用,及其对凋亡相关基因bcl-2、bax和ICE表达的调控。方法 将野生型p53基因重组腺病毒载体转染人膀胱癌细胞HTB9,应用RT－PCR检测bax的mRNA表达水平,应用免疫组化法检测bcl-2、bax和ICE蛋白表达水平,以DNA琼脂糖凝胶电泳、脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记技术（TUNEL）和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 野生型p53基因导入可诱导HTB9细胞凋亡,凋亡细胞百分率可达50．4％;bax mRNA和蛋白水平增高,ICE和Bcl-2蛋白水平分别增高和下降。结论 野生型p53基因很可能是通过调控凋亡相关基因ICE、Bax和Bcl-2的表达来诱导细胞凋亡。     

MDM2和p53蛋白在膀胱癌中过度表达的意义

目的 观察膀胱癌中ＭＤＭ２和ｐ５３蛋白的表达状况及意义。方法 用免疫组化检测７０例原发性膀胱移行细胞癌（ＴＣＣ）中ＭＤＭ２和ｐ５３蛋白的过度表达情况。结果 ＭＤＭ２核免疫阳笥４４．２９％（３１／７０）,３２例（４５．７１％）ｐ５３核染色体阳性,两者共同阳性９例。ＭＤＭ２表达是膀胱癌的早期表现,ｐ５３蛋白与ＭＤＭ２相反,两者呈负相关。结论 ＭＤＭ２和ｐ５３蛋白是膀胱癌发生发展的两个早晚基因事件。     

流式细胞术分析苦参碱诱导人肝癌细胞HepG2凋亡

目的 为探讨苦参碱抑制HepG2增殖的机制。方法 以不同浓度苦参碱作用于HepG2细胞不同时间用PI及AnnexinV-FTTC-PI双标记两法检测凋亡细胞,结果 0.8,1.5,2.0g/L苦参碱处理细胞72h,细胞均出现了凋亡峰,凋亡细胞分别为10.57,16.37,10.85%细胞早期凋亡检测;2.0,1.5,3.0g/L苦参碱分别作6h、12h、12h,凋亡细胞分别达7.7,8.6,15.7%;当3.0g/L苦参碱作用12h,坯 煞费苦心细胞达21.9%。结论 一定浓度苦参碱可诱导HepG2细胞凋亡,凋亡与坏死相伴存在并呈剂量和时间依赖性。     

番茄红素体外对人食管癌细胞SHEEC36的初探

目的：探讨番茄红素对体外培养的人禽管癌细胞的影响,方法：应用MTT法和流式细胞术手段,观察不同剂量的番茄红素对体外培养的人胚食管上皮癌细胞汕头株36代（SHEEC36）的增殖抑制及诱导凋亡作用。结果：MTT实验显示,番茄红素体外对SHEEC36细胞增殖有明显的抑制作用。结论：翻茄红素体外能抑制SHEEC36增殖,发挥抗肿瘤作用的机制可能与阻断S期以及诱导细胞凋亡有关。     

MTT比色法测定膀胱癌细胞的体外侵袭力

目的　用MTT比色法与Boyden小室侵袭试验相结合,测定膀胱癌细胞的体外侵袭力。方法　采用人工基质胶构建侵袭小室,将EJ、T24、BIU-87三个膀胱癌细胞株在装有趋化物的Boyden小室内培养12h,加入MTT,用自动酶标记数仪测定吸光度,根据光密度值确定侵袭指数。结果　三个膀胱癌细胞株的侵袭指数分别为EJ0.326%±0.046%、T240.569%±0.044%、BIU-871.256%±0.066%。癌细胞趋化移动性的移动率分别为EJ0.508%±0.037%、T240.672%±0.039%、BIU-871.524%±0.043%。结论　将MTT比色法与Boyden小室侵袭试验相结合,能较准确的测定出癌细胞的体外侵袭力,具有敏感准确、快速简便、无放射污染等优点。     

多药耐药基因在大肠癌中的检测及其临床意义

我们利用逆转录聚合酶链反应技术定量分析了５４例大肠癌患者多药耐药基因表达水平，探讨其与临床化疗的相关性。初步检测结果表明：大肠癌化疗疗效与ＭＤＲＩ的表达水平有关，未经化疗的患者ＭＤＲＩ呈低水平表达；化部后的患者ＭＤＲＩ均呈高水平表达，而且随着化疗疗程的增加ＭＤＲＩ的表达水平有增加的趋势。     

Fas配体在大肠癌细胞中的表达

目的 研究Fas配体在大肠癌细胞中的表达。方法 分别采用反转录－聚合酶链反应和流式细胞仪技术检测了大肠癌细胞株中Fas配体mRNA和细胞表面蛋白的表达。结果 在检测的六株大肠癌细胞中,全部表达Fas配体mRNA;部分表达Fas配体细胞蛋白。结论 至少部分大肠癌细胞表达Fas配体,并可能以此反击机体免疫系统,逃避免疫监督。