人骨髓间充质干细胞联合单倍体造血干细胞移植治疗急性放射病小鼠的实验研究

目的 观察人骨髓间充质干细胞（BMSC）联合单倍体相合造血干细胞（HSC）移植治疗辐射重度造血损伤小鼠的效果。方法 60只C57BL/6（H-2b）与BALB/c（H-2d）杂交第1代[CB6F1（H-2b×d）]小鼠用⁶⁰Co γ射线8.0 Gy全身照射后,按照完全随机设计分为照射对照、HSC单移植和BMSC+HSC共移植3组,每组20只。检测移植后各组小鼠存活率、外周血象、骨髓病理、骨髓细胞集落形成以及移植物抗宿主病（GVHD）评分等指标。结果 照射对照组小鼠辐照后第10天全部死于造血衰竭,平均活存时间为（7.13±0.31） d。与单移植组相比,共移植组小鼠的移植物抗宿主病（GVHD）表现和病理改变均明显减轻,GVHD评分明显降低（t=3.677、4.330、5.303、3.578,P<0.05）;共移植组的生存率和生存时间明显高于单移植组（t=3.317、5.183,P<0.05）。单移植组小鼠移植后第28天WBC（6.51±1.38）×10⁹/L、PLT（749.56±190.72）×10⁹/L、RBC（8.15±0.74）×10¹²/L、Hb（115±10.44） g/L,回升程度低于正常水平。共移植组小鼠移植后第28天WBC（12.50±2.07）×10⁹/L、PLT（968.25±216.62）×10⁹/L、RBC（9.22±1.04）×10¹²/L、Hb（137.57±14.89） g/L,回升程度接近正常水平。单移植组小鼠外周血象的回升速度和恢复水平明显低于共移植组小鼠（t=6.665、3.164、3.011、2.520,P<0.05）。移植后第7天共移植组小鼠骨髓抑制程度较单移植组轻,第28天共移植组小鼠骨髓新生造血灶多于单移植组。共移植组小鼠骨髓CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM集落计数在辐照后第7和28天均明显多于单移植组（t=3.625、2.966、3.020、3.536,P<0.05;t=4.369、4.849、5.044、4.243,P<0.05）。结论 BMSC联合单倍体造血干细胞移植能促进急性骨髓型放射病造血重建及植入,降低GVHD的发生,提高移植成功率。     

不同浓度地塞米松对人骨髓间充质干细胞体外增殖及凋亡的影响

目的观察地塞米松对体外培养人骨髓间充质干细胞增殖及凋亡的影响。方法利用1.073g/mLPercoll分离液以梯度密度分离法获取人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,进行体外培养。成骨诱导组细胞用地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠处理,分别进行ALP染色和矿化结节染色。实验组细胞分别以10^-9mol/L、10^-8mol/L、10^-7mol/L和10^-6mol/L地塞米松加以干预,MTT法检测各组细胞的增殖率;流式细胞仪定量分析hMSCs的凋亡率。结果成骨诱导组细胞ALP染色和矿化结节染色均为阳性,对照组为阴性;低浓度（10^-9mol/L）地塞米松对细胞的体外增殖无明显影响（P〉0.05）,10^-8mol/L及以上浓度地塞米松可明显抑制细胞的增殖（P〈0.01）;hMSCs凋亡率随地塞米松浓度的增加而升高（P〈0.01）。结论地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠可促使hMSCs成骨分化,10^-8mol/L及以上浓度的地塞米松可明显抑制细胞的增殖,地塞米松能促进体外培养的人骨髓间充质干细胞凋亡。     

造血干细胞联合AGM基质细胞移植对骨髓移植小鼠造血重建的影响

目的探讨造血干细胞与主动脉-性腺-中肾（aorta—gonad—mesonephros，AGM）区来源的基质细胞联合移植对同基因骨髓移植（bone marrow transplantation，BMT）小鼠BMT后骨髓造血的影响。方法建立同基因骨髓移植小鼠模型，随机分成4组：空白对照组、BMT组、BMT联合AGM基质细胞移植组（联合移植组）及川芎嗪组，另设正常组。分别于BMT后7、14、21和28d检测外周血细胞、骨髓单个核细胞（bone marrow mono—nuclear cells，BMMNC），3、7、10、14、21和28d检测骨髓组织学变化。结臬联合移植组骨髓单个核细胞较川芎嗪组恢复快，联合移植组及川芎嗪组外周血血细胞、骨髓单个核细胞、骨髓组织恢复均较单纯BMT组快，差异有统计学意义。结论BMT联合AGM基质细胞移植对骨髓移植造血重建具有促进作用。     

去舒地尔对人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的影响

目的 探讨HA-1077（fasuclil，法舒地尔）对人骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为表皮细胞的影响。方法 采用直接贴壁法培养并扩增人胚胎股骨骨髓干细胞，免疫细胞化学及流式细胞仪进行表面标志的检测。设对照组、诱导组、HA-1077诱导组1、HA-1077诱导组2，采用免疫细胞化学及流式细胞仪对各组细胞角质蛋白表达变化进行检测，观察其对MSCs分化为表皮细胞的影响。结果 采用直接贴壁法可以获得大量高纯度的人骨髓MSCs，分组培养后第2天开始出现少量细胞角质蛋白阳性表达细胞，随着时间延长，阳性率逐渐提高。7天后流式细胞仪显示单纯诱导组及HA-1077诱导组CK5／8、CKl0／13、CK19阳性率均远高于诱导组（P〈0．01）。结论 HA-1077可能通过抑制Rho-ROCK途径的激活从而促进MSCs体外培养中角蛋白表达的显著提升，Rho-ROCK途径可能在促进MSCs分化为表皮细胞过程中起着重要调控作用。     

法舒地尔对人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的影响

 目的探讨HA-1077(fasudil,法舒地尔)对人骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为表皮细胞的影响.方法采用直接贴壁法培养并扩增人胚胎股骨骨髓干细胞,免疫细胞化学及流式细胞仪进行表面标志的检测.设对照组、诱导组、HA-1077诱导组1、HA-1077诱导组2,采用免疫细胞化学及流式细胞仪对各组细胞角质蛋白表达变化进行检测,观察其对MSCs分化为表皮细胞的影响.结果采用直接贴壁法可以获得大量高纯度的人骨髓MSCs,分组培养后第2天开始出现少量细胞角质蛋白阳性表达细胞,随着时间延长,阳性率逐渐提高.7天后流式细胞仪显示单纯诱导组及HA-1077诱导组CK5/8、CK10/13、CK19阳性率均远高于诱导组(P＜0.01).结论HA-1077可能通过抑制Rho-ROCK途径的激活从而促进MSCs体外培养中角蛋白表达的显著提升,Rho-ROCK途径可能在促进MSCs分化为表皮细胞过程中起着重要调控作用.     

兔骨髓间充质干细胞获取与特性的实验研究

目的：完善兔骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）体外扩增培养体系并观测其特性。方法：兔骨髓经密度梯度离心获得单核细胞后贴壁培养，光镜、透射电镜观察所获细胞形态，流式细胞术检测细胞周期，体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果：原代及传代MSCs为漩涡状贴壁生长的长梭形成纤维细胞样细胞，传代细胞具有类似的生长规律；透射电镜示所获细胞具有较强的自我更新能力；细胞周期分析显示87％以上细胞处于G0／G1期；MSCs经体外诱导可向成骨细胞、成脂肪细胞分化。结论：利用密度梯度离心联合贴壁培养法可分离、纯化MSCs，所获细胞具备成体干细胞特性，于体外可大量扩增，做为种子细胞和载体细胞满足实验需要。     

自体骨髓间充质干细胞联合自体外周血造血干细胞移植治疗恶性血液病

目的:观察自体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)联合自体外周血造血干细胞(autologous peripheral blood stem cells,APBSCs)移植治疗恶性血液病的可行性、有效性和相关并发症发生情况。方法:采用无血清培养体系体外培养MSCs,将自体骨髓MSCs与APBSCs共移植治疗12例恶性血液病患者,并与同期进行的12例未联合MSCs的自体外周血造血干细胞移植(peripheral blood stem cells transplantation,APBSCT)的恶性血液病患者进行造血恢复及并发症比较。结果:MSCs输注无明显不良反应;联合移植的患者,造血恢复中性粒细胞(ANC)≥0.5×109/L平均9.52 d,血小板(PBC)≥20×109/L平均9.05 d,较对照组恢复快(P<0.05);血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)较对照组低(P<0.05);口腔溃疡和感染发生率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:MSCs与APBSCs联合移植治疗恶性血液病安全可行,移植后造血重建快,并发症少。     

骨髓间充质干细胞体外培养和成骨诱导

目的：观察骨髓问充质干细胞（MSC）体外培养及诱导成骨分化的特征。方法：采用密度梯度离心和体外扩增培养人骨髓MSC,并进行成骨诱导。应用茜素红染色法和钙钴法分别进行成骨诱导的MSC钙化结节检测和碱性磷酸酶（ALP）检测。结果：MSC成骨细胞诱导培养第l～3天的细胞增殖旺盛,3～5d即融合成单层。随着诱导培养时间的延长,细胞逐渐堆积并矿盐沉积,形成矿化结节。培养14d和21d后,矿化结节形成率分别为（70．5±3．5）％和（87．5±3．5）%,ALP染色阳性率分别为（41．5±1．5）％和（85．2±1．7）％。结论：在体外培养条件下,骨髓MSC可诱导分化为具有含矿化结节及ALP阳性特征的骨样细胞。     

活性氧介导的铁过载对小鼠骨髓间充质干细胞的影响及其机制探讨

目的建立小鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)铁过载(IO)模型,并对铁过载模型小鼠进行去铁及抗氧化治疗,探讨铁过载对小鼠BM-MSCs的损伤作用及活性氧(ROS)在该损伤中的作用机制。方法采用随机区组设计,将40只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、铁剂(右旋糖酐铁,25mg/ml)组(IO组)、铁剂+去铁治疗(DFX,125mg/kg)组(Fe+DFX组)、铁剂+抗氧化治疗(NAC,40mmol/L)组(Fe+NAC组),每组10只。从小鼠密质骨中分离BM-MSCs培养至P1代,检测BM-MSCs内铁颗粒、不稳定铁(LIP)及ROS水平;利用倍增时间及CCK-8试剂盒检测BM-MSCs增殖情况;采用碱性磷酸酶染色(ALP)、茜素红染色、成骨分化基因检测等方法评估BM-MSCs成骨分化能力;采用油红O染色检测BM-MSCs成脂定向分化能力。结果与对照组相比,铁剂组BM-MSCs内存在明显铁颗粒,LIP及ROS水平明显增高(P<0.05),倍增时间明显延长(2.07±0.14d vs 1.03±0.07d,P<0.01)。DFX组及NAC组倍增时间较铁剂组有所缩短,分别为1.52±0.07d与1.68±0.03d(P<0.05)。与对照组比较,铁剂组BM-MSCs矿化能力及向成骨细胞分化能力下降,成骨基因ALP、RUNX2、OSN表达增强,而成脂定向分化能力增强。在去铁及抗氧化治疗后,上述改变发生部分逆转。结论铁过载可影响小鼠骨髓MSCs的增殖及定向分化能力,其机制可能与铁过载所致ROS升高有关。     

间充质干细胞联合骨髓细胞输注诱导胰岛移植免疫耐受的研究

目的观察间充质干细胞(MSC)联合骨髓细胞(BMC)输注对同种异体小鼠胰岛移植嵌合状态及胰岛移植物存活时间的影响。方法C57BL/6小鼠和BALB/C小鼠分别作为供、受体。应用链脲佐菌素制备BALB/C小鼠糖尿病模型,将分离纯化的C57BL/6小鼠胰岛移植到上述糖尿病模型小鼠的肾包囊下,用抗CD154单抗进行受体预处理。将接受胰岛移植的25只BALB/C受体鼠随机分为A组(单纯胰岛移植);B组(供体MSC悬液0.5ml输注);C组(供体BMC悬液0.5ml输注);D组(供体BMC和MSC各0.5ml输注);E组(供体BMC和第三品系的KM小鼠MSC各0.5ml输注),每组5只,所有细胞在胰岛移植后经尾静脉输注。比较以上各组供体细胞嵌合率(DC)和胰岛移植物存活时间的差异。结果在胰岛移植后第30天,MSC联合BMC输注的D、E两组与单纯BMC输注的C组比较,其DC显著升高(P<0.01);胰岛存活时间亦显著延长[(77.0±7.7d)和(61.0±2.2d)vs(53.0±16.4d)(P<0.01)]。胰岛移植后第60天,D组与E组比较,DC维持在更高水平,且胰岛移植物存活时间更长(P<0.05)。结论MSC联合BMC输注比单纯BMC输注能够维持更长时间的混合嵌合状态,并延长胰岛移植物存活时间;供体来源的MSC输注比非供体来源的MSC输注更有效。