人外周血NKT细胞体外扩增及其分泌细胞因子的研究

目的　建立人外周血自然杀伤T细胞 (NKT)体外扩增及检测NKT细胞所分泌的细胞因子的方法。方法　分别采用单加α 半乳糖神经酰胺 (α Galcer组 ) ,单加树突状细胞 (DC组 )以及同时加α Galcer、DC(α Galcer、DC组 )的方法从人外周血单个核细胞 (PBMC)和纯化T淋巴细胞中扩增TCRVα2 4+ /TCRVβ1 1 + NKT细胞。采用细胞内细胞因子流式细胞术检测手段测定NKT细胞中IL 4 ,IFN γ、TNF α阳性细胞比例。结果　PBMC中的α Galcer组 ,DC、α Galcer组和纯化T淋巴细胞中的DC、α Galcer组 ,NKT细胞扩增 1 9d后分别占淋巴细胞的 (2 5 .5± 7.2 ) %、(1 8.2± 8.2 ) %和 (2 4 .8± 5 .5 ) % ,NKT细胞分别扩增了 (1 5 .1± 9.1 )× 1 0 3 倍、(2 1 .8± 1 7.3)× 1 0 3 倍和 (2 3.0± 1 6 .7)× 1 0 3 倍 ,与其它各组差异有显著性意义 (P <0 .0 1 )。扩增过程TCRVβ1 1+ NKT细胞中分泌IL 4 ,IFN γ和TNF α的细胞比例均高于TCRVβ1 1 T淋巴细胞 (P <0 .0 5 )。结论　α Galcer具有体外大量扩增NKT细胞的能力 ,同时α Galcer的激活能力受CD1d分子的限制。由于PBMC中的单核系细胞也表达CD1d分子 ,因此直接从PBMC扩增NKT也能获得良好的效果     

人外周血Vα24 NKT细胞和CD3+CD56+CIK 细胞生物学特性的比较研究

目的进一步认识Vα24 NKT细胞和CIK细胞在生物学特性的差异。方法从人外周血单个核细胞扩增NKT细胞和CIK细胞;经免疫磁珠纯化获得高纯度的TCRVα24 NKT细胞和CD3 CD56 CIK细胞。运用流式细胞术测定纯化后的NKT细胞和CIK细胞的表型、细胞因子和细胞坏死相关因子的表达情况,并用DIOC18染色及流式细胞术测定纯化后的NKT细胞和CIK细胞的细胞杀伤活性。结果经纯化TCRVα24 Vβ11 NKT细胞和CD3 CD56 CIK细胞的纯度均达到>90%;纯化后的Vα24 NKT细胞多数为CD4 和DN NKT细胞,高表达TCRVα24、Vβ11、CD3、CD161,低表达CD56;而纯化后的CIK细胞则以CD8 T细胞为主,高表达CD3、CD56,低表达CD161,几乎不表达TCRVα24和Vβ11。在抗原刺激下,CD3 CD56 CIK细胞的IFN-γ、TNF-α、Perforin、FasL、TRAIL表达水平均高于NKT细胞,但CD3 CD56 CIK细胞几乎不分泌IL-4,而NKT细胞则分泌高水平的IL-4;CD3 CD56 CIK细胞对肿瘤细胞株K562、U937、Jurkat的杀伤率均远远高于NKT细胞。结论TCRVα24 NKT细胞和CD3 CD56 CIK细胞是两类完全不同的细胞群,在抗肿瘤免疫和免疫调节中可能起着不同的作用。     

人外周血Vα24 NKT细胞和CD3~+CD56~+CIK细胞生物学特性的比较研究

目的进一步认识Vα24 NKT细胞和CIK细胞在生物学特性的差异。方法从人外周血单个核细胞扩增NKT细胞和CIK细胞;经免疫磁珠纯化获得高纯度的TCRVα24+NKT细胞和CD3+CD56+CIK细胞。运用流式细胞术测定纯化后的NKT细胞和CIK细胞的表型、细胞因子和细胞坏死相关因子的表达情况,并用DIOC18染色及流式细胞术测定纯化后的NKT细胞和CIK细胞的细胞杀伤活性。结果经纯化TCRVα24+Vβ11+NKT细胞和CD3+CD56+CIK细胞的纯度均达到>90%;纯化后的Vα24 NKT细胞多数为CD4+和DN NKT细胞,高表达TCRVα24、Vβ11、CD3、CD161,低表达CD56;而纯化后的CIK细胞则以CD8+T细胞为主,高表达CD3、CD56,低表达CD161,几乎不表达TCRVα24和Vβ11。在抗原刺激下,CD3+CD56+CIK细胞的IFN-γ、TNF-α、Perforin、FasL、TRAIL表达水平均高于NKT细胞,但CD3+CD56+CIK细胞几乎不分泌IL-4,而NKT细胞则分泌高水平的IL-4;CD3+CD56+CIK细胞对肿瘤细胞株K562、U937、Jurkat的杀伤率均远远高于NKT细胞。结论TCRVα24+NKT细胞和CD3+CD56+CIK细胞是两类完全不同的细胞群,在抗肿瘤免疫和免疫调节中可能起着不同的作用。     

脐血与外周血NKT细胞的体外扩增及其表型比较

为了建立体外有效扩增脐血与外周血天然杀伤T细胞(NKT细胞)的方法并研究其表型的差异,分别采用单加IL-2及同时加IL-2和α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)的方法,从人脐血单个核细胞(UCB-MNC)和人外周血单个核细胞(PB-MNC)中扩增NKT细胞;用流式细胞检测技术测定NKT细胞(TCR Vα24+TCR Vβ11+)的比例及其它表型特征。结果显示:UCB-MNC在第7天时,其TCR Vαβ+NKT细胞的扩增量占淋巴细胞的(24.48±4·19)%,是原来的(8.74±4.37)×102倍(P<0.01),而且大多不表达NK1.1(CD161);TCR Vβ11+较TCRVα24+高表达;第14天时,PB-MNC中的TCR Vαβ+NKT细胞扩增量占淋巴细胞的(11.1±3.61)%,是原来的(3·72±2·01)×102倍(P<0.01),且NK1.1高表达,TCR Vβ11+与TCR Vα24+表达率基本一致。结论:α-Galcer对NKT细胞有特异的扩增功能,且脐血NKT的扩增效率较外周血高。以表型划分,脐血中的NKT细胞多为NK1.1-,而外周血多为NK1.1+,是一种新的NKT细胞亚型。     

不同来源的树突状细胞体外扩增比较研究

【目的】对脐血和外周血树突状细胞(DC)体外扩增进行比较,探索更好的DC来源。【方法】取正常人脐血及外周血,以Ficoll分离提取白细胞,去除悬浮细胞后,分别加入含有GM-CSF、TNF-α及GM-CSF、IL-4的完全培养基中培养,于4、8、10 d进行表型(CD1α、CD83、CD80、HLA-DR)分析及形态观察,1周左右分别检测同种异体混合淋巴细胞反应培养,比较诱导细胞增殖的能力。【结果】脐血诱导的DC细胞数明显大于外周血来源的DC细胞数(脐血2.05±0.05,外周血0.45±0.01),两组有显著差异(P<0.05)。比较两种来源的DC在形态及细胞表型上无显著差异(P>0.05),两者刺激同种异体混合淋巴细胞增殖的能力无显著差异。【结论】脐血和外周血均可成功诱导成熟DC,脐血诱导DC增殖比外周血效率高。     

胎儿骨髓基质细胞协同外源性细胞因子对脐带血CD34^＋细胞的体外扩增作用

SCF和FL可促进造血干 祖细胞的增殖 ,是强有力的共刺激因子 ,而骨髓基质细胞所产生的c kit及Flk 2水平很低 ,因此基质细胞培养结合含有SCF或FL的细胞因子组合可提高造血干 祖细胞的扩增效率[1 ] 。SCF IL 3 IL 6 G CSF EPO和SCF IL 3 IL 6 FL EPO二种组合可高效扩增造血干 祖细胞[2 ] ,因此我们拟以上述二种细胞因子组合结合胎儿骨髓基质细胞培养以观察对脐带血CD3 4 细胞的体外扩增作用。材料与方法脐带血样品采自本院妇产科 ,胎儿骨髓采自 5 - 6月水囊引产的健康胎儿的四肢骨。胎儿骨髓基质细胞贴壁层的建立采用…     

不同细胞因子组合对人脐血单个核细胞体外扩增及CD49d和CXCR4表达的影响

为了探讨不同的细胞因子组合对脐血单个核细胞体外的扩增作用及扩增后CD49d和CXCR4的变化，将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7天，在0天，7天检测有核细胞数，CD34^＋细胞数及CD34^＋CXCR4^＋，CD34^＋CD49d^＋的细胞数和集落形成单位（CFU）数．根据不同细胞因子组合实验分组为：对照组；SF组（SCF＋FL）；SFT组（SCF＋FL＋TPO）和SFT6组（SCF＋FL＋TP0＋IL-6）。结果表明，和对照组相比，SF组合仅能低水平支持脐血造血细胞扩增，加入TPO后即SCF／FL／TPO组合能有效的扩增脐血细胞，但SFT和SFT6两组之间差异却无明显发生（P〉0．05）；SF，SFT和SFT63组的细胞因子组合均可提高脐血CD34^＋细胞CD49d，CXCR4的表达，但3组之间差异无显著性（P〉0．05）。结论：SF组合可协同扩增人造血细胞，但协同作用较弱；TPO在脐血造血干／祖细胞体外扩增中起重要调节作用，而IL-6作用不显著；SCF／FL／TPO 3种因子组合不仅可促进脐血造血祖细胞的扩增，而且可上调脐血造血细胞CD49d，CXCR4表达。     

NKT细胞及其功能

近年来发现存在一类与传统的αβT细胞(CD4~+CD8~+)不同的T细胞,其αβTCR结构单一,既有T细胞抗原受体又有NK受体且显示T细胞与NK细胞两方面性质,因而称为NKT细胞。NKT细胞通过识别由非经典的MHCI类分子——CD1d分子递呈的糖脂类抗原(a-半乳糖酰基鞘氨醇,α-Gal-Cer)或寄生虫的糖磷脂酰肌醇(GPI),在Th1和Th2的细胞因子的产生及穿孔素介导的细胞毒作用中发挥了重要的作用。     

脐血来源树突状细胞的体外诱导及扩增

本研究的目的是分析脐血的细胞组成 ,研究加入细胞因子培养前后脐血树突状细胞的变化 ,探索体外诱导、扩增树突状细胞的方法并进行表型鉴定。选择正常成人外周血 9份 ,脐血 12份 ,分离单个核细胞。在脐血单个核细胞中加入细胞因子GM CSF、IL 3、SCF和EPO ,培养 4周。应用流式细胞仪和CD4、CD8、CD19、CD34、CD38、CD1a、CD11c及CDw12 3单克隆抗体测定正常成人外周血、培养前后 1,2 ,3,4周脐血细胞表面抗原及树突状细胞情况。结果表明 :正常成人外周血CD34 细胞 0 .0 2× 10 5 ml,CD1a 细胞 0 .0 1× 10 5 ml,CD11c 细胞 4 .32×10 5 ml,CD83 细胞 1.31× 10 5 ml,CDw12 3 细胞 1.4 1× 10 5 ml。新鲜脐血中CD34 细胞 0 .2 2× 10 5 ml,CD1a 细胞 0 .2 7× 10 5 ml,CD11c 细胞 5 .87× 10 5 ml,CD83 细胞 1.94× 10 5 ml,CDw12 3 细胞 2 .73× 10 5 ml。加入细胞因子GM CSF ,IL 3,SCF ,EPO后培养 1- 4周的脐血单个核细胞分化为CD1a ,CD11c ,CD83 ,CDw12 3 树突状细胞 ,在培养的 2 - 4周 ,脐血树突状细胞数量明显增多 ,此后逐渐减少。通过培养 ,树突状细胞数量增加 ,CD1a 细胞达 11.0 2× 10 5 ml,CD11c 细胞 2 8.2 4× 10 5 ml,CD83 细胞 10 .5 7× 10 5 ml,CDw12 3 细胞 18.7× 10 5     

骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血CD133+细胞体外扩增作用的研究

为了探讨胚胎骨髓基质细胞（FBMSC）联合细胞因子对脐血单个核细胞（MNC）中CD133＋细胞的体外扩增作用,将新鲜脐血（CB）中分离出来的MNC接种于无血清培养体系中培养14天。实验分为4组：C组为空白对照组,不含基质细胞和细胞因子;S组为单用基质细胞组;F组为单用细胞因子组;SF组为联合使用基质细胞和细胞因子组。在第0,6,10及14天检测有核细胞总数、CD133＋细胞数及集落形成单位（CFU）数。结果表明：各时间点SF组有核细胞总数的扩增倍数均高于其它组;除了第14天外,SF组在第6、10天时CD133＋细胞数、CFU数的扩增倍数均高于其它组。结论：胚胎骨髓基质细胞对延缓造血细胞的分化具有重要的作用,基质细胞联合细胞因子可以有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133＋细胞,这是一种比较接近于临床移植要求的造血细胞体外扩增方法。     

不同细胞因子组合对脐血巨核细胞的体外扩增效应

目的　探讨在体外液体培养条件下不同细胞因子组合促进脐血单个核细胞向巨核系增殖分化的效应。方法　将TPO(thrombopoietin)、SCF(stemcellfactor)、SCGF(stemcellgrowthfactor)、IL- 3、EPO(erythropoietin)等细胞因子组合成不同的实验组,在无血清液体培养体系中,体外扩增脐血单个核细胞 (CBMC)14d。扩增后于不同时间点用流式细胞仪检测CD61 细胞的比例,同时计数活细胞数,从而求得较好的细胞因子组合组。结果　经 14d培养后,SCF TPO组扩增效果最好,活细胞总数和CD61 细胞数量分别增加了 3. 14±0. 62倍和 48. 40±5. 71倍,显著高于单用TPO组的 1. 81±0. 36倍和 18. 72±3. 73倍。TPO IL 3组使CD61 细胞数量增加了 25. 82±3. 88倍,但扩增后CD61 细胞比例仅为 9. 34% ±1. 92%,低于TPO组的12. 21%±2. 27%;TPO SCGF组和TPO EPO组的扩增效果与单用TPO组相比无统计学差异 (P>0. 05)。结论　SCF能协同TPO增强巨核系造血,增加培养体系中巨核细胞的纯度和数量。     

不同细胞因子组合对体外培养人脐带血造血干细胞的扩增效果

目的:观察细胞因子对培养的人脐带血造血干细胞的扩增效果,寻求体外最佳细胞因子组合。方法:实验于2002-06/2004-04在承德医学院基础研究所及承德医学院附属医院中心实验室完成。①以足月顺产健康新生儿的脐带血(由承德医学院附属医院妇产科提供,新生儿家属均签署实验知情同意书)作为实验标本。无菌条件下平均采血量30～60mL,梯度离心分离脐带血单个核细胞。②细胞体外扩增DMEM培养体系(含体积分数0.2的胎牛血清)为0.25μg/L干细胞因子,0.25μg/L白细胞介素3,0.5μg/L白细胞介素6,0.25μg/L粒-巨噬细胞集落刺激因子,0.8μg/L粒细胞集落刺激因子,0.05μg/L血小板生成素,0.8μg/LFLt-3配基。此7种细胞因子及剂量按不同组合分为6组:干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6组、干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 粒-巨噬细胞集落刺激因子组、干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 粒细胞集落刺激因子组、干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 粒-巨噬细胞集落刺激因子 粒细胞集落刺激因子组、干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 血小板生成素 FLt-3配基组、干细胞因子 血小板生成素 FLt-3配基组。各组单个核细胞终浓度为1×108个L-1。③培养第7,14,21天进行细胞形态学观察;培养第0,5,10,14,18,21天观察不同细胞因子组合对脐带血干细胞扩增的效果;应用流式细胞仪对培养前后细胞表面标志CD34 进行检测。结果:①脐带血干细胞形态学观察结果:体外培养第14天,细胞胞体小,胞浆量少,胞核体积大,多不规则,为早期造血干细胞。②细胞体外扩增培养情况:应用干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 血小板生成素 FLt-3配基这一细胞因子组合,脐带血干细胞可保持>98%的细胞存活率;培养第7天出现典型早期造血干细胞,第21天细胞总数达到高峰(F=60.228,P<0.01)。③细胞表面标志CD34 的动态变化:干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 血小板生成素 FLt-3配基这一细胞因子组合为生长刺激剂,应用后体外培养的造血干细胞于第14天达高峰,与培养前比较差异有显著性意义(F=20.782,P均<0.01),之后逐渐下降。结论:应用干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 血小板生成素 FLt-3配基细胞因子组合可长期维持脐带血干细胞的体外生长,且体外培养第14天是临床移植的最佳时机。     

体外扩增CD4＋CD25＋Treg细胞的效果比较及体外免疫抑制功能鉴定

本研究比较3种不同细胞组分扩增CD4＋ CD25＋ Treg的效果并鉴定其免疫抑制功能.用免疫磁珠分选法从小鼠脾细胞中分选出CD4＋T细胞、CD4＋ CD25＋ Treg细胞和CD4＋ CD25-T细胞,负载CD3/CD28克隆抗体MACSiBead联合IL-2共同刺激,分别对CD4＋T细胞、CD4＋ CD25＋ Treg细胞和CD4＋ CD25-T细胞进行体外扩增培养,流式细胞术检测扩增后CD4＋ CD25＋ Treg细胞的比例及Foxp3基因的表达,用混合淋巴细胞反应（MLR）检测CD4＋ CD25＋ Treg对CD4＋ CD25-T细胞增殖的抑制作用,CCK-8方法检测细胞抑制率.结果表明：经过2周培养,3组细胞均有明显的扩增.CD4＋T细胞组扩增倍数为（77.8±5.32）倍,CD4＋ CD25＋ Treg细胞的比例由（6.61±1.00）％增加到（15.33±1.31）％.CD4＋ CD25-T细胞组扩增迅速,倍数为（95.20 ±7.67）倍,CD4＋ CD25＋ Treg细胞的比例由培养前（0.37±0.13）％增加到（9.84±0.98）％.磁珠分选后的CD4＋ CD25＋ Treg细胞的扩增倍数为（41.20±6.92）倍,细胞纯度由（86.75±1.25）％下降到（85.32±1.62）％,Foxp3表达由（76.92±1.13）％下降到（75.33±2.11）％,扩增前后的细胞纯度和Foxp3表达,差异无统计学意义（P＞0.05）.体外抑制实验显示体外扩增的CD4＋ CD25＋ Treg细胞对CD4＋ CD25-T细胞增殖有明显的抑制作用,对效应性T细胞增殖的抑制效能与其细胞数呈正相关.结论：本研究在体外成功扩增了小鼠CD4＋ CD25＋ Treg细胞,并且具有免疫抑制功能,其中CD4＋ CD25＋ Treg细胞组扩增的CD4＋ CD25＋ Treg细胞数量多,细胞纯度高.     

G-CSF动员的外周血Vα24+NKT细胞体外扩增及免疫表型

NKT细胞识别由抗原呈递细胞(APC)表面CD1d分子提呈的脂类抗原,人工合成的α-半乳糖酰基鞘胺醇(α-galactosylceramide,α-GalCer,KRN7000)可以激活NKT细胞[1].     

人树突状细胞体外诱导分化扩增方法

树突状细胞（ＤＣ）是目前已发现的抗原递呈功能最强的抗原递呈细胞。来源于人外周血单核细胞和骨髓／脐血ＣＤ３４＾＋造血干细胞在体外经不同培养体系诱导后,能得到具有一定数量的功能性ＤＣ,表现为典型的形态、表型和功能特征,为今后的临床应用提供基础。,     

密闭系统体外扩增脐带血CD34＋细胞：多中心研究

背景和目的The Dideco’Pluricell System是-CE认证的可进行造血干细胞扩增的装置。它是由一环鸟甘酸细胞因子及其反应试剂盒，一密闭的扩增室和一细胞洗涤装置组成。我们对此系统以8份新鲜脐带血（UCB）作CD34＋细胞扩增，进行一项多中心研究。材料和方法在培养期间，检测中位有核细胞计数、中位CD34＋细胞计数、扩增倍数、细胞生存力和细胞凋亡。在0，7，12天时，作克隆分析和免疫表型鉴定。以聚合酶链反应对细胞扩增后的产物，进行细胞基因型、内毒素水平和支原体检测。     

小鼠骨髓树突状细胞体外扩增方法的探索

背景：树突状细胞(Dendritic cells，DC)是抗原提呈功能最强的细胞，但因数量极微限制了它的应用。目的：建立小鼠骨髓DC体外大量扩增方法。设计：完全随机对照研究。地点和对象：实验地点：基础医学部中心实验室；C57BL／6(H-2k^b)小鼠，BALB／c(H-2k^d)小鼠各6只。干预：用粒一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与白细胞介素4(IL-4)体外培养小鼠骨髓细胞。主要观察指标：用相差显微镜观察形态学变化，3H-TdR掺入法检测细胞增殖能力，FACS检测细胞表面分子，ELISA检测细胞因子。结果：扩增的DC形态学特征典型，具有强烈的激活T细胞增殖能力，表达IaKb，CD11c，CD80，CD86，ICAM-1分子以及分泌IL-12，IL-6，TNF-α和IL-1β水平增强。结论：该法在体外扩增的大量的DC细胞，具很强的免疫学活性。     

人树突状细胞体外诱导分化扩增方法

树突状细胞(DC)是目前已发现的抗原递呈功能最强的抗原递呈细胞。来源于人外周血单核细胞和骨髓/脐血CD34~ 造血干细胞在体外经不同培养体系诱导后,能得到具有一定数量的功能性DC,表现为典型的形态、表型和功能特征,为今后的临床应用提供基础。     

骨髓基质细胞对多细胞因子介导人脐血单个核细胞体外扩增的影响

背景:体外扩增脐血造血细胞的目的是促进脐血造血细胞的植入能力,细胞因子介导的脐血造血细胞能使细胞数有效扩增,但同时也耗竭了具有分化潜能的造血干细胞.目的:观察骨髓基质细胞对多细胞因子组合介导人脐血单个核细胞体外扩增及扩增后黏附分子和CXCR4表达的影响.方法:将分离的人脐血单个核细胞接种在预先建立的人骨髓基质细胞层上,分组培养:对照组仅含有脐血单个核细胞;多种细胞因子+脐血单个核细胞组;骨髓基质细胞+脐血单个核细胞组;骨髓基质细胞+多种细胞因子+脐血单个核细胞组.培养0,7 d检测有核细胞数, CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数.结果与结论:单纯骨髓基质细胞和单用细胞因子组均可有效地扩增脐血造血细胞,并提高造血细胞上CD49d,CD62L及 CXCR4表达.而单用细胞因子组促进脐血造血细胞扩增能力较单纯骨髓基质细胞强,提高造血细胞CD49d,CD62L及 CXCR4表达能力较单纯骨髓基质细胞差.提示骨髓基质细胞虽可支持脐血造血细胞扩增,但难以实现造血细胞的大量扩增,但在骨髓基质细胞层的支持下,多细胞因子可有效地促进脐血造血细胞的扩增,并优于单用细胞因子及骨髓基质细胞,证实骨髓基质细胞可协同多细胞因子有效地促进脐血单个核细胞的扩增,促进造血干细胞的黏附和趋化能力.