异种骨与成骨细胞体外生物相容性研究

[目的]评价异种骨与成骨细胞体外生物相容性,为其在临床应用提供实验依据。[方法]将SD大鼠来源的成骨细胞分别在普通培养基和含异种骨浸提液的培养基中培养,于1、3、5、7 d用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyltetrazolium,MTT)法测定吸光度值,以评价细胞的增殖情况。采用Transwell试验,在倒置相差显微镜下观察细胞的迁移情况,计算穿膜成骨细胞数量,检测成骨细胞的迁移能力。应用流式细胞仪检测细胞周期变化,以评价异种骨浸提液对成骨细胞周期的影响。[结果]成骨细胞在普通培养基和含异种骨浸提液的培养基中采用MTT检测增殖结果无显著性意义(P>0.05)。在含异种骨浸提液的培养基中,成骨细胞在Transwell中穿膜细胞数为(13.40±2.51)个/视野,对照组为(8.00±1.87)个/视野,两组差异有显著性意义(P<0.05),实验组细胞迁移数量多于对照组。流式细胞仪检测显示,异种骨浸提液对细胞周期无影响。[结论]异种骨与成骨细胞有良好的生物相容性,为其临床应用提供了试验依据。     

激光立体成形多孔钛对成骨细胞的影响及生物相容性研究

[目的]评价激光立体成形技术制备的多孔钛材料对成骨细胞生长的影响和其生物相容性。[方法]以DMEM培养液和无菌生理盐水作为浸提介质,对激光立体成形技术制备的多孔钛材料制取浸提液,并在加有此浸提液的培养基中培养成骨细胞,对照组加入等量DMEM培养液和无菌生理盐水,在倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况;采用细胞计数试剂-8(CCK-8)法检测细胞增殖抑制情况以及黏附实验测定细胞黏附能力;对多孔钛分别进行四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定的细胞毒性试验、溶血试验以及短期全身毒性试验等生物相容性检测。[结果]1倒置显微镜观察显示,培养3 d后,发现成骨细胞在激光立体成形多孔钛组能够很好地粘附、生长和分化;CCK-8法和细胞黏附实验均证实,与对照组相比,激光立体成形多孔钛组中成骨细胞抑制率和黏附力均未受明显影响(P0.05);2激光立体成形多孔钛为USP毒性0级,即无细胞毒性;溶血率为3.00%,有良好的血液相容性;无短期全身毒性。[结论]采用激光立体成形技术制备的多孔钛材料有利于成骨细胞增殖,具有良好的生物相容性,在组织工程领域有着广阔的应用前景。     

新型骨替代材料-珍珠层的生物相容性研究

[目的]研究珍珠层的生物相容性。[方法]在体外培养的第3代成骨细胞中分别加入珍珠层（实验组）、橡胶（对照组）的材料浸提液，观察细胞形态、细胞膜和超微结构的变化；通过BrdU核掺入法检测细胞增殖情况、通过MTT法检测成骨细胞代谢活性。[结果]实验组细胞形态及细胞结构良好、细胞膜完整；对照组中细胞形态发生改变，细胞膜及胞浆内细胞器均有破坏；BrdU及MTT检测结果显示珍珠层对人成骨细胞的增殖和代谢活性无阻滞作用。[结论]珍珠层具有良好的生物相容性，可作为骨替代材料应用于骨缺损修复。     

丝素蛋白/羟基磷灰石细胞相容性及异位成骨作用

目的 观察两种丝素蛋白/羟基磷灰石(SF/HA)的细胞相容性及异位成骨作用.方法 相差显微镜及扫描电镜观察兔骨髓基质细胞(BMSCs)在两种SF/HA上的生长;测定ALP活性及噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖;材料浸提液的细胞毒性试验.将成骨诱导的兔BMSCs与材料复合培养3 d后植入兔背部肌肉中,进行异位成骨观察.结果 BMSCs在两种材料上能够良好地黏附和增殖,细胞活性及成骨性能不受材料影响,与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05);材料浸提液对细胞生长无毒性作用.异位成骨实验组随时间延长,新骨生成量增多;对照组则均无新骨形成.结论 两种丝素蛋白/羟基磷灰石具有良好的细胞相容性,构建的组织工程化骨具有良好的异位成骨作用.     

成骨细胞特异性钙黏蛋白涂布脱钙骨基质材料对BMSCs黏附及成骨分化能力的影响

目的 探讨成骨细胞特异性钙黏蛋白(cadhefin ectodomain Ⅱ,Cad-Ⅱ)涂布于同种异体脱钙骨基质材料(freeze-dried demineralized bone matrix,FDBM)对兔BMSCs黏附、增殖及成骨分化能力的影响.方法 取4周龄日本大耳白兔10只,体重0.61～0.88 kg,雌雄不限,常规分离培养BMSCs.取第2代BMSCs(细胞密度1×106个/mL)分别与经Cad-Ⅱ修饰的FDBM(实验组)和未经Cad-Ⅱ修饰的FDBM(对照组)复合,行MTT检测细胞增殖能力,细胞黏附实验检测细胞上架率和上架数,倒置相差显微镜、扫描电镜及HE染色观察细胞生长情况.另取第2代BMSCs(细胞密度5×105个/mL)分别与经Cad-Ⅱ修饰的FDBM(实验组)和未经Cad-Ⅱ修饰的FDBM(对照组)复合培养,行ALP活性检测和骨钙素免疫组织化学染色观察细胞成骨分化情况.结果 MTT检测发现BMSCs在经Cad-Ⅱ修饰的支架材料上能正常增殖,但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).实验组细胞上架率为87.41%±5.19%,明显高于对照组35.56%±0.75%(P<0.01);对照组每片材料细胞上架数平均为2.6×104个,实验组平均高达5.0×105个,明显多于对照组(P<0.05).倒置相差显微镜、扫描电镜及HE染色观察均显示实验组支架上黏附细胞数量明显多于对照组.成骨诱导培养7 d,实验组和对照组细胞均可表达骨钙素,具有成骨细胞表型;培养14 d,实验组和对照组ALP活性分别为29.33±1.53和18.31±1.32,骨钙素免疫组织化学染色阳性率分别为83%±7%和56%±7%,两组比较差异均有统计学意义(P<0.01);与同组7、21 d比较差异有统计学意义(P<0.01),7 d与21 d组间及组内比较差异均无统计学意义(P>0.05).结论 Cad-Ⅱ修饰的FDBM对BMSCs增殖无明显促进作用,但能提高细胞黏附性,并促进BMSCs向成骨细胞分化.     

成骨细胞条件培养液对BMSCs诱导分化作用研究

目的 探讨大鼠成骨细胞条件培养液对同种大鼠BMSCs的成骨诱导分化作用,为骨组织工程种子细胞的获得寻找一种新方法 . 方法 健康1周龄SD大鼠10只,雌雄不限,体重20～30 g,采用贴壁法和酶消化法分别获得BMSCs和成骨细胞,并进行鉴定.无菌条件收集第1～5代成骨细胞培养液上清,与完全培养基1:1混合,制备成骨细胞条件培养液,与第2代BMSCs共培养为诱导组,相同代次BMSCs与完全培养液共培养为对照组.倒置相差显微镜下观察共培养后BMSCs形态变化,MTT法检测BMSCs生长情况,免疫组织化学染色检测共培养后BMSCs的ALP、Col Ⅰ、骨钙素(osteocalcin,OCN)蛋白的表达,采用RT-PCR检测Col Ⅰ、OCN mRNA的表达. 结果 诱导组共培养7 d BMSCs体积变大,细胞由长梭形展开为扁平形和多边形,并带有突起;9 d细胞呈集落状生长.细胞生长曲线示BMSCs数量随培养时间延长而增加,对照组增殖能力较诱导组强;诱导培养4～7 d,对照组细胞数量与诱导组比较差异有统计学意义(P<0.05).诱导组培养12 d,ALP染色呈阳性表达;18 d 出现钙结节;21 d Col Ⅰ和OCN呈阳性表达;对照组均呈阴性表达.RT-PCR检测示诱导组培养21 d有Col Ⅰ、OCN mRNA表达,对照组未见表达. 结论 体外大鼠成骨细胞条件培养液有明显的诱导同种大鼠BMSCs向成骨样细胞分化的作用.     

不同保存方法对生物衍生骨支架材料细胞相容性的影响

目的了解不同保存方法对生物衍生骨支架材料细胞相容性的影响.方法冻干生物衍生骨用两种不同保存液同等条件4℃冷藏保存3个月,以保存相同时间冻干生物衍生骨为对照.实验分为A组:成骨细胞复合 1号保存液处理材料培养;B组:成骨细胞复合 2号保存液处理材料培养;C组:成骨细胞复合冻干骨培养;D组:单纯成骨细胞培养.以2×106个/ml密度的成骨细胞悬液复合材料培养1、3、5和7天.用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞的黏附和生长情况、检测细胞活力、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性及流式细胞仪分析细胞周期.结果成骨细胞与三种不同方法保存的材料均可黏附,并在材料孔隙内生长、分化和增殖.复合培养1和3天,各组间无显著差异;复合培养5和7天,黏附于材料的细胞活力大小依次为 A组>C组>B组 (P＜0.01,P＜0.05).复合培养7天,黏附于材料的细胞ALP活性大小依次为 A组>C组>B组(P＜0.01) .各组细胞周期未见明显变化,未见异倍体细胞.结论选择适宜的保存液对生物衍生骨支架材料的细胞相容性有一定优化作用.     

医用多孔钽材料对大鼠软骨细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响

[目的]观察国产多孔钽材料对大鼠软骨细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响,为其作为软骨组织工程支架材料临床应用提供实验依据。[方法]选用3周龄SD大鼠双侧股骨头、膝关节分离软骨组织,经Ⅱ型胶原酶消化,饱和湿度培养,传代。倒置显微镜下逐日观察细胞生长状态。待第2代细胞生长至80%左右时,通过甲苯胺蓝染色、番红O-固绿染色以及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色进行软骨细胞鉴定。以F12-DMEM为浸提介质分别制备100%、50%、25%多孔钽浸提液,软骨细胞加不同浓度多孔钽浸提液作为实验组,未加浸提液的软骨细胞作为对照组;MTT法检测多孔钽浸提液对软骨细胞增殖的影响及细胞毒性检测。将第2代软骨细胞接种到多孔钽支架上进行体外三维培养,而对照组是将软骨细胞接种到无支架的培养板上,倒置相差显微镜观察两组软骨细胞生长状态;胰酶消化复合于材料上的软骨细胞,流式细胞仪检测软骨细胞的细胞周期变化及细胞凋亡。[结果]软骨细胞接种初期大小不等,呈圆形悬浮于培养液中,24 h后贴壁细胞伸展呈三角形、多角形等。第7⁹ d待细胞生长呈现融合时即可传代。甲苯胺蓝染色显示软骨细胞胞浆内可见蓝紫色颗粒,番红O-固绿染色显示胞浆呈绿色、细胞核呈紫红色,Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色显示阳性信号位于胞浆及部分胞膜,以上方法证实了分离培养的细胞为软骨细胞;MTT法检测显示随着培养时间的延长,各浓度浸提液组细胞生长与对照组无明显差异,软骨细胞形态正常,贴壁增殖良好,相同时间点不同浓度的浸提液与对照组间细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05),提示软骨细胞在多孔钽浸提液中生长、增殖状态良好且多孔钽材料无毒性。多孔钽支架材料外观灰色光亮,表面及断面可见分布均匀的蜂窝状孔隙,孔径针尖大,支架材料不透光,将分离培养的第2代软骨细胞接种到多孔钽支架上后,复合培养24 h后,倒置相差显微镜可见材料边缘有少量软骨细胞黏附,细胞呈多角形;随着培养时间增加,材料边缘及培养板底部细胞黏附的数量逐渐增多,边缘软骨细胞生长良好;流式细胞仪检测显示实验组与对照组细胞均为正常二倍体细胞,两组细胞周期分布相似,实验组及对照组的细胞凋亡率及坏死细胞率差异均无统计学意义(P>0.05)。[结论]国产多孔钽材料无毒性,对软骨细胞增殖、细胞周期及凋亡无明显影响,适合作为软骨组织工程支架材料。     

联合rhBMP-2与成骨细胞诱导骨髓基质细胞成骨分化的实验研究

目的探讨rhBMP-2和成骨细胞联合诱导骨髓基质细胞(BMSCs)的成骨分化能力。方法应用全骨髓贴壁法分离培养4周龄SD大鼠的BMSCs,通过改进酶消化法结合反复贴壁法培养1日龄SD乳鼠成骨细胞。实验分为4组:rhBMP-2诱导组、成骨细胞诱导组、rhBMP-2+成骨细胞诱导组、单纯培养液组。倒置相差显微镜及扫描电镜观察细胞生长情况;分别收集第3、6、9天细胞培养液上清液定性及定量测定碱性磷酸酶并进行统计学分析。结果 rhBMP-2诱导组、成骨细胞诱导组、rhBMP-2+成骨细胞诱导组均检测出成骨细胞生成,其中,rhBMP-2+成骨细胞诱导组碱性磷酸酶含量明显大于前两组,差异有统计学意义(P0.05)。结论rhBMP-2、成骨细胞、rhBMP-2联合成骨细胞均能提供成骨微环境,并在体外诱导BMSCs向成骨细胞分化,rhBMP-2联合成骨细胞对BMSCs的成骨分化具有更优的诱导能力。     

多孔钽金属与成骨细胞生物相容性的实验研究

[目的]研究多孔钽金属体外与成骨细胞的生物相容性。[方法]按照ISO10993-12医疗器械生物学评价标准制备多孔钽金属材料浸提液,作用于人成骨细胞系hFOB1.19,标记为实验组,并设置空白对照组;MTT法检测材料浸提液对成骨细胞生长的影响;ELISA酶联免疫吸附法检测实验组及对照组碱性磷酸酶ALP及骨钙素OCN活性;将成骨细胞与多孔钽金属共培养,扫描电镜观察成骨细胞在材料上黏附和生长情况。[结果]实验组和对照组细胞增殖曲线、ALP和OCN活性相似,差异无统计学意义(P>0.05);成骨细胞与多孔钽金属材料共培养,显现出良好的黏附和生长行为。[结论]多孔钽金属对成骨细胞生长无不良影响,且适于成骨细胞黏附、生长及分化,具有良好的生物相容性。     

跖骨感染骨外露的显微外科治疗

[目的]回顾总结跖骨骨感染骨外露的显微外科治疗方法。[方法]自1995年～2005年采用显微外科技术治疗214例跖骨骨外露骨感染患者。[结果]全部病例获得随访1～10年，平均随访3年，14例游离植皮术后皮肤成活良好，199例术后皮瓣全部成活，1例腓肠神经营养血管皮瓣移位修复术出现远端部分皮肤坏死，后经换药处理后，伤口自然愈合。皮瓣移植术后质地良好，无溃疡复发。患足均可负重走路。[结论]应用显微外科技术治疗跖骨骨感染骨外露可获得较好的疗效。     

Genetic regulation of bone mass: from bone density to bone strength

Osteoporosis is a common disease characterized in adults by diminished bone density. Bone is an organ that evolves and grows throughout life, and establishing optimal bone density in childhood and adolescence serves to buffer bone loss later in life. Bone density, a measurable entity, is the clinical substitute for bone strength, or the ability to defend against fracture. Chronic diseases may adversely affect optimal peak bone density. Bone density is under genetic control, as revealed by three lines of investigations. These include (1) the finding of quantitative trait loci for bone density, (2) the finding that specific mutations in genes that are important in the development of osteoblast or osteoclast lineages alter bone density, and (3) the linkeage of known polymorphisms for genes involved in mineral homeostasis to bone density and/or fracture. Future therapeutics for improving peak bone density or delaying bone loss later in life may take advantage of the genetic nature of bone density development.This work was presented in part at the IPNA Seventh Symposium on Growth and Development in Children with Chronic Kidney Disease: The Molecular Basis of Skeletal Growth, 1–3 April 2004, Heidelberg, Germany     

重组合异种骨植骨修复骨囊肿所致骨缺损

2001年10月～2003年9月,笔者共收治28例骨囊肿患者,均采用病灶刮除,瘤腔灭活和重组合异种骨植骨治疗,获得满意疗效,体会如下。     

从骨免疫学到骨微生物学：肠道微生物如何调节骨骼

肠道微生物群被称为人体的第二个基因库,在维持人体平衡中起主要作用。不良饮食习惯、抗生素滥用、病理状态和生活环境改变会对肠道菌群产生负面影响,以引起多种疾病。最新研究发现肠道微生物群与骨质疏松症之间有着密切的联系,同时引入了一个新术语"骨微生物学",该研究领域旨在弥合骨骼生理学、胃肠病学、免疫学和微生物学之间的差距。本文简要介绍了肠道菌群通过免疫系统、新陈代谢和内分泌环境以及其他因素影响骨代谢的潜在机制,通过研究肠道菌群与骨骼健康之间的关系,不仅对于维持骨骼健康和最大程度地减少骨质疏松症很重要,而且对于肠道微生物群是否可作为骨质疏松症新型治疗靶标以及是否可用作骨折预测的生物标志物方面具有重要意义。     

复合人工骨修复骨良性病变切除后骨缺损

目的探讨骨良性病变切除后骨缺损的修复方法，并对其疗效进行评估。方法总结1999年1月-2003年10月我科应用混合自体骨松质的异体脱蛋白骨松质复合自体红骨髓治疗骨良性病变切除后骨缺损28例。年龄12—61岁，平均20，5岁。结果除2例因死亡失访外，其余26例均取得满意随访，平均骨愈合时间为4．2个月。骨腔大小或植骨量不同，骨愈合时间不同。骨腔越大，植骨越多，骨愈合时间越长。本组病例未见明显排斥反应及并发感染。随访至今，无一例复发。结论利用这种复合人工骨修复骨良性病变切除后骨缺损的方法可行性好，安全性高，自体损伤小，便于推广，可用于骨缺损的修复。     

Assessment of bone density and bone loss

Osteoporosis International - Dual-energy X-ray absorptiometry has become the standard for the evaluation of osteoporosis. It is useful both for identifying those people who are going to be at risk...     

Aneurysmal bone cyst of the occipital bone

A 13 years boy presented with a painless hard and fixed swelling in occipital region for the last three months. Plain X-ray, CT scan and MRI showed an expansile multi loculated cystic lesion in occipital bone. Histopathological examination revealed it to be an aneurysmal bone cyst. Treatment of choice is surgery. However, radiotherapy may be helpful in incompletely excised lesions.     

Development of bone canaliculi during bone repair

We recently found that silver impregnation staining with protargol (silver protein), that is, a modified Bodian method, is useful for histologically identifying the details of bone canaliculi structure, using thin sections of decalcified bone tissues. With this staining method, we conducted the present study to assess the development of bone canaliculi during the process of intramembranous ossification using a fracture-like stimulation model of the rat femur. After making a drill-hole in the cortex of the rat femur, decalcified thin sections were obtained after 3, 5, 7, and 14 days by the standard paraffin-embedding procedure. Silver staining for bone canaliculi was performed using our previously reported technique. The results showed that woven bone covered the fracture surface of the cortex after 5 days, then immature lamellar bone attached to the woven bone after 7 days, and finally the lamellar bone matured and became thick with appositional growth after 14 days. The osteocytes in the woven bone appeared at an early stage of bone repair and developed a few canaliculi that were short and irregularly distributed in the osteoid matrix, while the osteocytes in the lamellar bone at a late stage formed many bone canaliculi that were long and regularly distributed in mature bone matrix. Therefore, we concluded that woven bone osteocytes may be necessary for induction of the lamellar bone osteocytes followed by active appositional growth of the lamellar bone at the early stage of bone repair, and also that both bone tissues could be clearly distinguished from one another based on the pattern of development of bone canaliculi by the osteocytes, as seen with the use of our sensitive staining method.