RNA干扰对肝癌细胞CDC20表达的影响

目的 观察RNA干扰(RNAi)对肝癌细胞株Hepal-6中CDC20表达的抑制作用.方法 设计针对小鼠肝癌细胞Hepal-6 CDC20 mRNA的小干扰RNA(siRNA),以阳离子脂质体包埋后转染鼠肝癌细胞Hepal-6,转染48 h后,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法 检测Hepal-6细胞CDC20 mRNA及蛋白质表达的变化.结果 siRNA各组与正常对照组和阴性对照组比较,CDC20 mRNA的表达均受明显抑制,并呈剂量依赖性(在100、50、25 nmol/L浓度下,Mixed siRNA组与正常对照组mRNA表达比较:0.370±0.058比0.840±0.044,0.480±0.081比0.900±0.068,0.830±0.062比1.010±0.054,各组P＜0.01);CDC20蛋白质的表达亦均受抑制(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3及Mixed组与N-Cont或Blank组蛋白质表达比较:0.482±0.035/0.402±0.003/0.479±0.026/0.446±0.017比0.826±0.03l或0.835±0.024,各组P均＜0.01).结论 CDC20 siRNA可显著抑制小鼠肝癌细胞Hepal-6中CDC20 mRNA和蛋白质的表达.     

RNA干扰Oct4的表达对肝癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨干细胞相关基因Oct4与Wnt/β-catenin在人肝癌组织及肝癌细胞系中的相互作用.方法 PCR法检测Oct4、Wnt/β-catenin及其他相关基因在肝癌组织、癌旁组织及正常肝组织的表达差异.使用SiRNA-Oct4沉默人肝癌HepG2细胞Oct4的表达,实时荧光定量PCR法检测Wnt/β-catenin基因表达.检测RNAi后细胞迁移以及克隆形成能力.结果 肝癌患者的上述组织中,Oct4和β-catenin在癌内表达最高,癌旁次之,正常肝最低.使用SiRNA-Oct4沉默人肝癌HepG2细胞Oct4后,Oct4表达明显下调,β-catenin、Wnt10b表现为与Oct4表达呈正相关,TCF3表达与Oct4呈负相关.RNAi后HepG2细胞的迁移能力、克隆形成能力均下降.结论 Oct4在肝癌组织内高表达而在正常肝细胞中的表达极低.RNAi后HepG2细胞的迁移能力、克隆形成能力均下降可能与Wnt/β-catenin通路功能减弱有关.

Abstract：

Objective To investigate the expression of Oct4 in liver cancer, and the interrelation of the Oct4 and Wnt/β-catenin genes in hepatocellular carcinoma( HCC) cell line HepG2. Methods RTPCR technique was used to detect the expression of Oct4 and β-Catenin in HCC specimens; RNAi was used to knock-down the expression of Oct4 in HepG2, and the change of Wnt/β-catenin related genes were detected by Real time-PCR. Results In HCC specimens, the expression of Oct4 and β-Catenin in tumor and cirrhotic liver tissues were stronger than normal liver tissues. In SiRNA Oct4 HepG2 cells, the expression of Oct4 was downregulated, and β-catenin as well as Wnt10b were in a positive correlation with Oct4, TCF3 was in negative correlation with Oct4. Clone formation and move ability of the HepG2 were downregulated. Conclusions The expression of Oct4 was higher in tumor tissues than in normal liver tissues. Silencing Oct4 by SiRNA-0ct4 in HepG2 resulted in decreased ability of clone formation and cell movement.     

小干扰RNA阻抑人端粒酶催化亚基基因表达对肾癌细胞增殖及凋亡的影响

为研究RNA干扰对肾癌基因治疗作用，2004年本研究以针对人端粒酶催化亚基(human telomerase reverse transeriptase，hTERT)基因的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)转染肾透明细胞癌株786-0细胞，观察其对786-0细胞hTERT表达及增殖、凋亡的影响。     

RNA干扰沉默Cathepsin L基因表达对肝癌细胞生物学特性影响的实验研究

目的 探讨RNA干扰技术沉默Cathepsin L基因对肝癌细胞生物学特性的影响.方法 实验组为肝癌细胞CathepsinL siRNA转染基因沉默组(沉默组),实验对照为肝癌细胞空白对照组(空白组)和siRNA转染荧光蛋白对照组(荧光对照组).观察时间为Cathepsin L siRNA转染后1、3和6 d.观察各组肝癌细胞Cathepsin L siRNA转染效率.用免疫荧光、RT-PCR法及WB法检测肝癌细胞Cathepsin L表达,MTT法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡变化,侵袭小室法测定肝癌细胞侵袭力变化.结果 沉默组与空白组、荧光对照组比较,Cathepsin L mRNA水平和蛋白水平显著下降,细胞生长受抑制,增殖指数显著下降,细胞凋亡率显著增加,肝癌细胞侵袭力显著下降.结论 RNAi可有效沉默肝癌细胞Cathepsin L表达,降低肝癌细胞增殖活力及细胞侵袭力.     

RNA干扰对骨桥蛋白不同片段表达的影响

目的 观察RNA干扰技术对肝癌细胞株内骨桥蛋白(osteopontin,OPN)不同片段的抑制效果,以期为针对OPN的靶向治疗提供更准确、有效的位点.方法 应用合成OPN序列特异性双链RNA(OPNi-A、OPNi-B、OPNi-C),转染人HEP G2肝癌细胞株,用荧光定量PCR和免疫组化检测比较OPN的mRNA和蛋白表达情况.结果 OPNi-A、OPNi-B、OPNi-C转染HEP-G2后,A片段的荧光强度大于B片段和C片段.RNA干扰HEP-G2细胞株48 h后,A、B、C、三个片段的OPNmRNA的△CT值分别从干扰前的8.31±1.58、8.78±1.49、8.25±1.51上升至12.14±1.43、10.22±1.97、10.48±1.88 (P＜0.05)；三个片段的OPN蛋白水平免疫组化评分也从干扰前的6.44±1.67、5.43±2.05、5.45±2.52下降到2.84±1.52、4.43±1.65、3.95±1.43.结论 RNA干扰对肝癌细胞株内骨桥蛋白不同片段有不同的抑制作用.合成更具针对性的siRNA可能对抑制肝癌侵袭转移具有重要的科学和卫生经济学意义.     

RNA干扰对肝癌细胞巨噬细胞移动抑制因子基因表达的抑制作用

目的 观察特异性小干扰RNA(siRNA)对肝癌细胞巨噬细胞移动抑制因子(MIF)基因表达的抑制作用.方法 脂质体方法将siRNA转染肝癌细胞PLC、Hep3B.定量RT-PCR、Western blot检测MIF mRNA和蛋白、MAPK信号分子的表达.噻唑蓝(MTY)比色法、体外细胞侵袭实验检测细胞增殖和对重组基底膜(matrigel)穿透能力.结果 100 nmol/L的MIF siRNA使MIF mR-NA表达下调81.3%和89.1%,蛋白水平降低69.50%、72.31%,与对照组比较其差异有统计学意义(P均＜0.01).细胞增殖率下降16.79%和47.14%(P均＜0.05).穿透matrigel的细胞数为51.00±11.27和18.56±4.72,与对照组比较差异有统计学意义(P均＜0.05).磷酸化MAPK下调.结论 MIF siRNA有效抑制MIF表达及肝癌细胞增殖和迁移,可能部分通过抑制MAPK磷酸化起作用.     

靶向bcl-2基因StealthTM RNA干扰诱导肝癌细胞凋亡的作用

目的 应用RNA干扰技术,构建靶向bcl-2基因StealthTM RNA,转染入人肝癌细胞株,探讨RNA干扰诱导人肝癌细胞凋亡的机制.方法 确定并合成3对人肝癌bcl-2基因干扰序列;脂质体法转染入肝癌细胞株内;荧光显微镜下观察转染细胞并计算转染率;倒置显微镜下观察转染前后细胞形态学的改变;SP免疫细胞化学技术检测StealthTM RNA处理前后细胞bcl-2蛋白表达变化;流式细胞术检测StealthTM RNA干扰对癌细胞凋亡和周期的影响.结果 各组转染成功,荧光镜下显清晰的绿色荧光;各转染组转染率与时间有关,各组48 h的转染率最高(P＜0.01);转染组间StealthTM RNA Ⅰ组的转染效率最高(P＜0.01);倒置显微镜下观察见转染后见部分细胞边缘圆,折光度降低,细胞增殖减慢且易脱落;未转染组细胞呈上皮性贴壁生长,生长旺盛.免疫细胞化学显示,StealthTM RNA干扰后各转染组发现细胞的bcl-2表达减弱,与未转染组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).流式细胞术结果示,各转染组细胞凋亡率明显升高,并出现凋亡峰,StealthTM RNA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的凋亡率分别为(27.87±4.51)%、(24.50±0.89)%和(26.03±0.57)%,与未转染组细胞凋亡率(3.20±1.71)%,差异有统计学意义(P＜0.01).各转染组细胞发生显著的细胞周期阻滞,表现为S期细胞明显减少,G0/G1细胞明显增多.结论 靶向bcl-2基因StealthTM RNA成功的转染人肝癌细胞中,bel-2蛋白表达受抑制,并明显的诱导癌细胞发生凋亡.     

Nodal基因干扰对肝癌细胞生物学行为及血管生成拟态的影响

目的 探讨利用Nodal基因表达预测肝癌转移复发的可行性.方法 通过RNA干扰技术对人肝癌细胞Nodal基因表达的沉默,观察对肝癌细胞生物学行为及血管生成拟态形成的影响.设计4条Nodal基因特异干扰序列,通过质粒载体转染人肝癌细胞株SMMC-7721,分别以实时荧光定量PCR和Western blot检测Nodal基因和蛋白的表达水平.观察Nodal基因干扰对肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力及血管生成拟态的影响.结果 RNA干扰明显抑制了肝癌细胞Nodal基因的表达.在增殖实验第4、5、6天,干扰组的增殖率明显低于对照组(分别F=17 098.922,18 135.107,32641.075,均P＜0.05).转染48 h后,干扰组凋亡率明显高于对照组(F=1136.452,P＜0.05).在侵袭和迁移试验中,干扰组穿过transwell小室的细胞数明显低于对照组(分别F=83.6,1126.857,均P ＜0.05);转染24h和48 h后,干扰组均未形成血管生成拟态,明显区别于对照组.结论 干扰Nodal基因的表达,可明显抑制肝癌细胞的生物学行为及血管生成拟态的形成.     

小干扰RNA在肝癌治疗中的应用

小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)是21～23 nt的短双链RNA,将哺乳动物细胞内特异基因的mRNA特异性降解而使基因失活,引起转录后沉默该基因的作用.siRNA技术在人类恶性肿瘤的基因治疗有特异而强烈的作用,具有非常广阔的情景,但其稳定性是有待解决的新问题.本文针对siRNA在肝癌治疗中的研究现状进行综述.     

c-Jun基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的c-Jun基因表达,探讨其表达抑制后VSMCs增殖的变化.方法 设对照组(VSMCs不作处理)、阴性siRNA组(VSMCs转染无关序列的siRNA)及c-Jun siRNA组(VSMCs转染c-Jun siRNA).应用RT-PCR半定量法检测VSMCs中c-Jun的mRNA水平,Western blot法检测VSMCs中c-Jun的蛋白水平, 应用MTT比色法及3H-TdR掺入法检测VSMCs的增殖情况,流式细胞仪检测VSMCs的细胞周期变化.结果 c-Jun siRNA组的c-Jun mRNA及蛋白表达水平均较对照组明显降低(P＜0.05,P＜0.01),而阴性siRNA组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05).c-Jun siRNA组VSMCs的增殖活性较对照组明显降低(P＜0.05),细胞周期出现明显的G0/G1期阻滞;而阴性siRNA组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05).结论 RNA干扰介导的c-Jun基因沉默可显著抑制VSMCs的体外增殖.     

长链非编码RNA BCAR4对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响及机制

目的:探讨长链非编码RNA BCAR4(LncRNA BCAR4)在胰腺癌细胞中的表达以及对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:用qRT-PCR检测胰腺癌细胞系(AsPC-1、HPAC、BxPC-3、Panc-1)和正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7中LncRNA BCAR4的表达。将胰腺癌AsPC-1细胞分别转染BCAR4 siRNA序列和阴性对照siRNA序列,以无转染的AsPC-1细胞为空白对照,用CCK-8和流式细胞术检测细胞的增殖和凋亡,Western blot检测细胞中mTOR与P70S6K及磷酸化mTOR(p-mTOR)与磷酸化P70S6K(p-P70S6K)蛋白的表达。结果:LncRNA BCAR4在各胰腺癌细胞系中的相对表达量均明显高于正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7(均P0.05);AsPC-1细胞转染BCAR4 siRNA后表现为增殖能力明显降低、凋亡率明显升高、p-mTOR及p-P70S6K蛋白相对表达量明显降低(均P0.05)。结论:LncRNA BCAR4在胰腺癌细胞中表达升高,LncRNA BCAR4的高表达可促进胰腺癌细胞增殖抑制凋亡,机制可能与LncRNA BCAR4上调mTOR/P70S6K通路的磷酸化水平有关。     

长链非编码RNA MALAT1在肝癌组织中的表达及其在肝癌细胞增殖与侵袭转移中的作用

目的:探讨长链非编码RNA MALAT1在肝癌组织中的表达及意义。方法:用qRT-PCR检测85例肝癌组织及其配对癌旁组织中MALAT1的表达,分析MALAT1的表达与肝癌患者临床病理因素的关系;在肝癌SMMC-7721细胞中分别过表达与敲除基因MALAT1后,通过CCK-8与Transwell实验检测肝癌细胞增殖与侵袭转移能力的改变。结果:MALAT1在肝癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P0.01);MALAT1在肝癌组织中的表达与肿瘤大小、肝癌的分化程度、TNM分期、淋巴结转移明显有关(均P0.05)。肝癌SMMC-7721细胞过表达MALAT1后增殖、侵袭与转移能力明显增强,而敲低MALAT1后增殖、侵袭与转移能力明显减弱(均P0.05)。结论:MALAT1在肝癌组织中表达上调,MALAT1可促进肝癌细胞增殖、侵袭与转移,故可能与肝癌的发生发展密切相关。     

Nodal靶向RNA干扰对人肝癌细胞的影响

目的：观察RNA干扰技术对人肝癌细胞Nodal基因表达的干扰效应,探讨靶向Nodal基因在肝癌基因治疗中的可行性。方法：采用一段含针对Nodal特异shRNA序列的质粒载体,转染人肝癌细胞株SMMC-7721,观察其转染效率后,分别以实时荧光定量PCR和Western blot检测Nodal基因和蛋白的表达水平,并观察Nodal基因干扰对SMMC-7721细胞体外增殖的影响。结果：表达shRNA的质粒载体对SMMC-7721细胞有较高的转染效率,转染后可明显抑制SMMC-7721细胞Nodal基因和蛋白的表达,且对其体外增殖有明显抑制作用。结论：运用RNA干扰技术,可以有效地抑制肝癌细胞Nodal基因和蛋白的表达,并抑制细胞增殖,Nodal基因可望成为肝癌治疗的新靶点。     

Sonic Hedgehog 信号通路在肝癌细胞增殖中的作用

目的：探讨Sonic Hedgehog（SHH）信号通路在肝癌细胞增殖中的作用及抑制该通路的活性对肝癌细胞对化疗药物敏感性的影响。 方法：分别用不同浓度重组SHH N-末端肽（rSHH-N）、SHH中和抗体（anti-SHH）、SHH通路抑制剂cyclopamine作用人肝癌SMMC-7721细胞不同时间,用MTT法检测细胞增殖状态。比较 5-氟尿嘧啶（5-FU）、anti-SHH、cyclopamine、anti-SHH+5-FU、cyclopamine+5-FU对SMMC-7721细胞增殖抑制作用的差异。 结果：rSHH-N作用后,SMMC-7721细胞增殖明显增加,而anti-SHH和cyclopamine作用后,SMMC-7721细胞增殖明显降低,且均呈时间和浓度依赖性（均P<0.05）;anti-SHH或cyclopamine联合5-FU对SMMC-7721细胞增殖抑制作用明显强于各药单用（均P<0.05）。 结论：SHH信号通路在肝癌生长中起重要作用,阻断SHH信号通路能抑制肝癌细胞增殖且能增加肝癌细胞对化疗药物的敏感性。     

KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因联合survivin基因干扰抑制肝癌细胞生长的体内研究

目的：探讨腺病毒介导的KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因系统（Ad-KDRP-CD/TK）联合survivin基因干扰对肝癌细胞在裸鼠体内生长的抑制作用。
　　方法：将20只裸鼠随机分均为模型组（皮下植入BEL-7402肝癌细胞成瘤,不加任何处理）、双自杀基因转染组（皮下植入转染Ad-KDRP-CD/TK的BEL-7402细胞,成瘤后瘤内注射前药更昔洛韦与5-氟胞嘧啶）、survivinsiRNA转染组（皮下注射BEL-7402肝癌细胞,成瘤后瘤内注射survivinsiRNA/Lip-DMEM转染混合物）、联合转染组（双自杀基因转染+survivinsiRNA转染处理）。治疗2周后处死各组小鼠,称取肿瘤质量,计算肿瘤抑制率,检测瘤组织微血管密度（MVD）及survivinmRNA与蛋白表达。结果：各治疗组的肿瘤质量明显小于模型组（均P<0.05）,且联合转染组的抑瘤率最大（均P<0.05）;肿瘤组织MVD、survivinmRNA与蛋白水平均明显降低,且联合转染组的降低程度最为明显（均P<0.05）。
　　结论：双自杀基因联合survivin干扰是抑制鼠肝癌细胞在体内生长的有效途径。     

RNA干扰白细胞抗原-G增强自然杀伤细胞对肝癌的免疫监视

目的 构建表达人类白细胞抗原-G(HLA-G)基因shRNA载体,探讨其对自然杀伤细胞(NK)细胞杀伤效应的影响.方法 构建4个HLA-G-shRNA真核表达质粒,转染至Huh7细胞.检测HLA-G mRNA及蛋白质水平的表达.将NK-92MI细胞与靶细胞共同培养,以LDH释放法观察不同效靶比时NK-92MI细胞对靶细胞的杀伤效应.结果 经酶切及测序鉴定证实,插入序列与设计的序列相符.Real Time-PCR和Western-blot结果均表明重组载体抑制了Huh7细胞HLA-G基因的表达.NK-92MI细胞对转染HLA-G的shRNA的Huh7细胞杀伤作用明显升高(P<0.01).封闭NK-92MI细胞ILT2受体后,杀伤作用降低(P<0.01).结论 HLA-G shRNA可以增强NK细胞对肝癌细胞的杀伤效应.     

环状RNA FBLIM1在肝细胞癌中生物学功能的初步研究

目的:探讨环状RNA FBLIM1(circ FBLIM1)对肝细胞癌(HCC)增殖与侵袭能力的影响。方法:将HCC细胞系Hep G2、7402、97H分别转染circ FBLIM1干扰序列(si-circ FBLIM1)和阴性对照序列后,用q RT-PCR验证转染效果,然后分别用CCK-8实验和Transwell实验检测细胞的增殖情况与侵袭能力;将10只裸鼠皮下接种Hep G2细胞后随机均分为两组,分别以40μL si-circ FBLIM1或阴性对照序列进行原位注射,1次/4 d,每4天记录移植瘤体积,28 d后完整剥离肿瘤称重。结果:q RT-PCR结果显示,3种HCC细胞系转染si-circ FBLIM1后,circ FBLIM1的表达均明显降低(均P0.05)。CCK-8实验与Transwell实验结果显示,3种HCC细胞系转染si-circ FBLIM1后的增殖能力与侵袭能力均明显减弱(均P0.05)。裸鼠移植瘤实验结果显示,注射si-circ FBLIM1的移植瘤生长速度明显减慢,肿瘤体积与质量均明显降低(均P0.05)。结论:circ FBLIM1具有促进HCC细胞增殖与侵袭的作用,可能是HCC恶性生物学特征的重要调节因子,抑制circ FBLIM1的表达可能是HCC有效的治疗策略。     

PLK1在原发性肝癌组织中的表达

目的 探讨极样激酶1（Polo-like kinase 1,PLK1）在原发性肝癌细胞中的表达情况,并且探索其与肝癌病人临床病理特点及预后的关系。方法 采用免疫组化技术研究PLK1在40例原发性肝癌组织石蜡切片中的表达情况。数据分析采用SPSS13.0统计软件处理,P<0.05表示差异有统计学意义。结果 癌栓、包膜侵犯、肿瘤直径大小、BCLC分期等因素和PLK1的阳性表达呈明显相关性（P<0.05）; PLK1阳性组和阴性组之间在术前AFP数值上存在着明显的统计学差异（P=0.029）;通过生存分析,发现PLK1的表达情况和患者的生存时间没有明显关联;Kaplan-Meier法分析原发性肝癌的预后的单因素相关因子显示与包膜侵犯、TNM分期、癌栓及转移与生存期有相关性（P<0.05）。与性别、乙肝、肝硬化、肿瘤数目BCLC分期及临床分期无关。结论 PLK1的表达在肝癌的发展及其生物学行为方面有着较为密切的关系,是重要的分子标记物,PLK1可能在肝癌早期的诊断中有重要作用。     

长链非编码RNA RUSC1-AS1对肝细胞癌恶性生物学行的影响及其与微小RNA-326的关系

背景与目的:有研究表明长链非编码RNARUSC1-AS1(lnc RNARUSC1-AS1)与肿瘤的恶性生物学行为密切相关,但其对肝细胞癌(肝癌)的影响尚不清楚。笔者前期研究显示,lnc RNARUSC1-AS1与微小RNA-326(mi R-326)存在结合位点,因此本研究探讨lnc RNARUSC1-AS1在肝癌中的表达,以及是否通过靶向mi R-326调控肝癌细胞生物学行为。方法:用q RT-PCR检测41例肝癌组织和对应癌旁组织中lnc RNARUSC1-AS1与mi R-326的表达。以lnc RNARUSC1-AS1表达抑制质粒/阴性对照质粒、mi R-326模拟物/阴性对照序列、mi R-326抑制物/阴性对照序列为工具,采用MTT法、Transwell法、流式细胞术、Westernblot法观察接受不同转染处理的MHCC97-H细胞的增殖能力、迁移和侵袭能力、凋亡以及相关蛋白表达的变化。采用荧光素酶报告实验分析lnc RNARUSC1-AS1和mi R-326的靶向关系,并用q RT-PCR验证。结果:与癌旁组织比较,肝癌组织中lnc RNARUSC1-AS1表达水平明显升高,mi R-326表达水平明显降低(均P0.05)。转染lnc RNARUSC1-AS1表达抑制质粒或mi R-326模拟物后,肝癌MHCC97-H细胞的增殖能力以及迁移与侵袭能力明显降低,细胞凋亡率明显升高,cyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表达水平明显降低,P21、Bax蛋白表达水平明显升高(均P0.05)。MHCC97-H细胞转染lnc RNARUSC1-AS1表达抑制质粒的同时mi R-326抑制物,前者对MHCC97-H细胞以上作用被取消(均P0.05)。双荧光素酶报告实验及q RT-PCR验证结果显示,mi R-326为lnc RNARUSC1-AS1的靶分子。结论:lnc RNARUSC1-AS1在肝癌中表达上调,其可通过靶向调控mi R-326的表达促进肝癌细胞的恶性生物学行。