食品中志贺活菌叠氮溴乙锭实时荧光聚合酶链反应技术研究

目的 利用叠氮溴乙锭（ethidium monoazide bromide,EMA）实时荧光聚合酶链反应（PCR）技术,建立一种简便、快速、特异、灵敏的在食品中检测志贺活菌的方法。方法 根据志贺菌ipaH基因保守序列设计特异性引物和探针。用不同EMA浓度、不同光照次数优化样品EMA前处理条件。用已知菌验证志贺活菌检测的敏感性和志贺死菌检测的抑制性。用31株志贺菌、26株单增李斯特菌、24株沙门菌、25株副溶血弧菌、11株阪崎肠杆菌、10株致病性大肠埃希菌和1株大肠埃希菌验证方法的特异性和稳定性。同时用本研究方法和常规分离培养法,对30件模拟样品进行实样验证。结果 志贺活菌EMA实时荧光PCR方法的循环阈值（Ct）=32.10~3.19log（菌量）（R2=0.994）。最低检测浓度为2.20 CFU/反应。对死菌DNA抑制效率99.97%。31株志贺菌Ct值最低为15.04,最高为26.54,而97株非志贺菌的Ct值均35或无Ct值（呈一条直线）。重复试验Ct值变异系数3。30件模拟样品采用本研究方法和常规分离培养法的检测结果一致,但采用EMA实时荧光PCR方法耗时不超过7.5 h,而常规分离培养方法则需要3～5 d。结论 EMA实时荧光PCR技术是一种快速简便、特异性强、灵敏度高、仅检测志贺活菌的方法,建议在食品检测中推广应用。     

Taqman-探针荧光定量PCR鉴定溶藻弧菌方法的建立

目的建立一种基于DNA回旋酶B亚单位基因(gyrB)基因的Taqman-探针荧光定量聚合酶链式反应(PCR)鉴定溶藻弧菌的方法。方法以溶藻弧菌标准株(ATCC)和溶藻弧菌野生株(WT)为研究对象,通过软件设计溶藻弧菌gyrB基因的特异性PCR引物及Taqman-探针,采用荧光定量PCR仪进行检测,评价该检测方法的特异性和灵敏度。结果 Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对溶藻弧菌gyrB基因的检测灵敏度为10~(-3)mg/L;在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌6种其他常见致病菌时未出现阳性扩增,特异性均为100%。结论成功建立Taqman-探针荧光定量PCR是一种特异性、灵敏度均较好的鉴定溶藻弧菌的方法,该方法适用于溶藻弧菌的快速检测,具有应用价值。     

IPaH-1基因在志贺氏菌表达的检测及PCR条件的优化

目的检测IPaH1基因在志贺氏菌特异性表达水平并对PCR条件进行优化。方法应用设计的针对IPaH1基因的特异性引物,通过PCR法检测IPaH1基因在鲍氏志贺氏菌、野生志贺氏菌、大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌(O157:H7)、肠炎沙门氏菌、阪崎肠杆菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、单增生李斯特菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌的表达水平,并对PCR反应中退火温度、最佳引物浓度等进行优化。结果①在志贺氏菌检测到IPaH1基因特异性表达,而大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌(O157:H7)、肠炎沙门氏菌、阪崎肠杆菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、单增生李斯特菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌未见表达;②PCR法扩增志贺氏菌IPaH1基因时,第一对引物IPaH1-1的最适退火温度为55.0℃-59.0℃,第二对引物IPaH1-2为51.0℃-55.0℃;两对引物理想终浓度均为0.1μM。结论 IPaH1基因特异表达于志贺氏菌;应用设计的引物通过PCR法扩增志贺氏菌IPaH1基因的最适退火温度分别为55.0℃-59.0℃、51.0℃-55.0℃,最适引物终浓度均为0.1μM。     

Taqman-探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌方法的建立

目的 建立一种Taqman荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法。方法 以副溶血弧菌标准株(ATCC-VPJS421)和其它常见致病菌标准株为研究对象,通过Gene Bank获取toxR基因的序列,采用生物信息学软件设计特异性PCR引物及Taqman探针,在SLAN 96P荧光定量PCR仪进行扩增检测,评价该检测方法的特异度和灵敏度。结果 ①设计的引物能够扩增出特异性条带; ②扩增体系中0.5 μl探针的扩增效果优于1.0 μl探针; ③Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对副溶血弧菌toxR基因的检测灵敏度为10^-1 mg/L; ④在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、梅氏弧菌和弗尼斯弧菌等10种常见致病菌时未出现阳性扩增,特异度为100%。结论 成功建立Taqman探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法,该方法特异度、灵敏度均较好,适用于副溶血弧菌的快速检测,具有良好的应用价值。     

2,3,5-三苯基氯化四氮唑在增菌液中的应用研究

目的 确立2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)在增菌液中,对不同的细菌产生抑制和被完全抑制时的浓度。 方法 用金黄色葡萄球菌、福氏志贺菌、沙门菌、大肠埃希菌、普通变形杆菌、副溶血性弧菌配制不同的菌液浓度,分别加到含1.0 mg/ml琼脂粉的普通营养肉汤增菌液中(副溶血性弧菌用3%氯化钠碱性蛋白胨水代替普通营养肉汤),再加入不同量的10.0 mg/ml TTC储备液,记录TTC对各菌产生抑制和被完全抑制时的浓度。 结果 在菌量30~300 cfu/ml时,金黄色葡萄球菌、福氏志贺菌、沙门菌、大肠埃希菌、普通变形杆菌、副溶血性弧菌开始被抑制和被完全抑制时的TTC浓度分别为 0.02、0.1、0.2、0.6、0.6、0.1 mg/ml 和0.1、0.7、0.5、2.0、2.0、0.2 mg/ml。 结论 检测样品时,在增菌液中加入1.0 mg/ml的琼脂粉和适量的TTC可提高致病菌的检出率,可直观样品中细菌数量。选择含不同TTC浓度的增菌液,可选择性地进行筛选增菌,进一步提高检出率。     

多重PCR方法鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌

目的 建立一种快速检测和鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法。方法 根据六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的毒力基因eae、stx1、stx2、elt、estIa、estIb、aggR、ipaH、afaD及16S rRNA基因rrs建立多重PCR反应体系,优化引物浓度、PCR反应条件等,评价该方法的特异性和灵敏度,并用该方法鉴定本实验室保存的174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌,将结果与单重PCR、本实验室已建立的鉴定五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法结果进行对比。结果 10对PCR引物均可特异性扩增相应基因片段。该反应体系对174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌的鉴定结果与单重PCR检测结果一致,本研究的多重PCR检测下限可达4.56 101 CFU/反应(1.14 104 CFU/ml)。结论 本研究采用毒力基因及内参照基因建立的多重PCR方法可在一个反应体系中鉴定和区分致泻性大肠埃希菌和志贺菌,为临床快速检测、疾病预防控制实验室筛查、腹泻的暴发溯源等提供了方便快捷的技术支持。     

多重PCR快速检测3种食源性致病菌

目的建立一种能同时检测金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门菌3种致病菌的多重PCR检测方法。方法采用LB培养液对金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门菌标准菌株进行增菌。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、产单核李斯特氏菌的hlvA基因、沙门氏菌的invA基因设计引物,通过多重聚合酶链反应（PCR）对上述3种食源性致病菌的目的基因进行扩增,同时对反应体系进行优化。结果对平均浓度为5cfu／ml的金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门氏菌在LB培养液中进行8h振荡培养,可以检出阳性结果;把金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌、沙门菌、志贺菌、蜡样芽孢杆菌、大肠埃希菌0157、阪崎肠杆菌7种菌混合在一起提取混合基因组DNA进行PCR扩增,显示出很好的特异性结果。结论建立的多重PCR检测方法适用于金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门菌的快速检测,具有快速、简便、灵敏的特点,可广泛应用于食品卫生检测、食物中毒应急处理和临床检验等领域。     

沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR快速检测技术的建立与应用

目的建立快速同时检测沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌的多重聚合酶链反应(PCR)技术。方法根据沙门菌hilA基因、志贺菌ipaH基因及副溶血性弧菌tdh基因序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系,测定特异性和灵敏度。结果该多重PCR技术能在8 h内同时检测3种目的菌,通过检测其他9种常见食源性致病菌,结果表明该方法特异性好,多重PCR检测灵敏度分别为:沙门菌104cfu/mL,志贺菌102cfu/mL,副溶血性弧菌104cfu/mL。并进行了人工模拟食品和粪便样品的检测。结论初步建立能在8h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR检测技术。     

2009-2013年北京市海淀区食源性致病菌检测结果分析

目的 了解海淀区食品中食源性致病菌污染现状及动态变化趋势,为食源性疾病控制提供科学依据.方法 2009-2013年按照北京市监测网工作计划要求对海淀区采集的20类食品根据国标方法进行沙门菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠埃希菌O157：H7/NM、空肠弯曲菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、阪崎肠杆菌等8种食源性致病菌检测.结果 在检测的19类822份食品中,共分离出4种52株食源性致病菌,总检出率为6.33％,其中副溶血性弧菌24株,金黄色葡萄球菌14株,单核细胞增生李斯特菌12株,创伤弧菌2株.结论 海淀区食品受到不同程度的致病菌污染,存在食物中毒和发生食源性疾病的隐患,应加强食品监督管理以减少可能引起食源性疾病的危险因素.     

沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR快速检测技术的建立与应用

目的建立快速同时检测沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌的多重聚合酶链反应（PCR）技术。方法根据沙门菌hilA基因、志贺菌ipaH基因及副溶血性弧菌tdh基因序列设计引物，进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系，测定特异性和灵敏度。结果该多重PCR技术能在8h内同时检测3种目的菌，通过检测其他9种常见食源性致病菌，结果表明该方法特异性好，多重PCR检测灵敏度分别为：沙门菌10^4cfu／mL，志贺菌10^2cfu／mL，副溶血性弧菌10^4cfu／mL。并进行了人工模拟食品和粪便样品的检测。结论初步建立能在8h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR检测技术。     

2008年浙江省海盐县市售食品中食源性致病菌污染调查分析

目的了解浙江省海盐县市售食品中食源性致病菌污染状况。方法对海盐县6个主要的集贸市场和2个超市采集7大类13个食品品种601份,进行7类食源性致病菌检测。结果海盐县7大类13个品种601份食品中检出致病菌38株, 检出率为6.32%,其中沙门菌16株,副溶血性弧菌12株,金黄色葡萄球菌10株;生肉和水产品中致病菌检出率分别为12.94%和7.95%;16株沙门菌,除2株未分型外,另14株均为B群,分7个血清型,优势血清型为德尔卑沙门菌、印地安纳沙门菌、阿贡纳沙门菌。结论生肉和水产品是海盐县主要污染食品;沙门菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌是该县食品中常见的污染菌;海盐县食品中沙门菌污染的血清型分布以德尔卑沙门菌为主,其次为印地安纳沙门菌、阿贡纳沙门菌。     

Detection of Staphylococcus aureus enterotoxin A and B genes with PCR-EIA and a hand-held electrochemical sensor

Two electrochemical assays for detecting Staphylococcus aureus enterotoxin A and B genes were developed. The assays are based on PCR amplification with biotinylated primers, hybridization to a fluorescein-labeled probe, and detection with horseradish peroxidase-conjugated anti-fluorescein antibody using a hand-held electrochemical detector. The limit of detection (LOD) for both assays was approximately 16 copies of the sea and seb genes. The assays were evaluated in blinded studies, each with 81 samples that included genomic and cloned S. aureus DNA, and genomic DNA from Alcaligens, Bacillus, Bacteroides, Bordetella, Borkholderia, Clostridium, Comanonas, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Francisella, Haemophilus, Klebsiella, Listeria, Moraxella, Neisseria, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Streptococcus, Vibrio and Yersinia species. Both assays showed 100% sensitivity. The specificity was 96% for the SEA assay and 98% for the SEB assay. These results demonstrate the feasibility of performing probe-based detection of PCR products with a low-cost, hand-held, electrochemical detection device as a viable alternative to colorimetric enzyme-linked assays of PCR products.     

广东省江门市区食品中食源性致病菌及耐药性监测研究

目的 了解江门市区各类食品中沙门菌、金葡菌、细胞增生李斯特菌(Lm)、副溶血性弧菌及O157:H7的污染状况及耐药性状.方法 采用国家标准检测方法,并参照全国食源性检测工作手册,对样本分别进行沙门菌、金葡菌、Lm、副溶血性弧菌及0157H7的分离、生化及血清学鉴定.结果 从9类550份食品中,共检出致病菌99株,总检出率为18.00%.其中Lm检出40株,检出率最高为7.27%;其次为沙门菌检出31株,检出率为5.64%;金葡菌检出28株,检出率为5.09%,副溶血性弧菌和大肠杆菌0157:H7均未检出.对分离出沙门菌、金葡菌及Lm进行药敏试验,结果表明3种致病菌对部分抗生素多重耐药.结论 江门市区食品中主要危害因素为沙门菌、金葡菌、Lm及其对抗生素多重耐药.     

多重PCR结合基因芯片技术检测11种致病菌方法的建立

目的建立一种运用多重PCR方法结合基因芯片技术快速、准确检测11种常见致病菌的方法。方法筛选志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157、副溶血性弧菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、产气荚膜梭菌、空肠弯曲菌的特异基因作为目的基因。设计相应的引物及探针,进行多重PCR扩增,制备寡核苷酸芯片。将多重PCR扩增产物与带有11种特异探针的基因芯片杂交。用扫描仪扫描,判定细菌种类。结果该基因芯片可特异性地检测11种致病菌,具有良好的特异性,基因组DNA检测灵敏度可达2×10-3ng。结论多重PCR结合基因芯片技术检测11种不同致病菌的方法特异性好,灵敏度高,具有较好的实用性。