人硫氧还蛋白-1基因克隆及其重组载体的构建与鉴定

目的 克隆人硫氧还蛋白-1（human thioredoxin-1, hTrx1）基因,并构建含有该目的基因的重组载体。方法 以人胃癌细胞系BCG823、MNK45的总RNA为模板,设计含有酶切位点的特异性引物,用逆转录PCR的方法,扩增hTrx1编码蛋白的cDNA片段,连接至EZ-T载体,形成EZ-T-hTrx1。对EZ-T-hTrx1进行双酶切后将目的片段连接至pcDNA3.1myc-His,形成pcDNA3.1myc-His-hTrx1,并进行双酶切、测序鉴定。结果 双酶切鉴定显示hTrx1 cDNA成功连入pcDNA3.1myc-His质粒;测序结果显示目的片段连入质粒,且与GenBank（NM003329）完全一致。该实验成功构建出含hTrx1的重组载体pcDNA3.1myc-His-hTrx1。结论 hTrx1基因的克隆以及重组载体pcDNA3.1myc-His-hTrx1的成功构建,为进一步探讨hTrx1的生物学活性及其对肿瘤发生的作用机制奠定了基础。     

人谷氧还蛋白1基因克隆及真核表达载体的构建

目的 从ECV304细胞中克隆谷氧还蛋白1(glutaredoxin1,Grx1)的cDNA序列并构建真核表达载体pcD-NA3.1( )-Grxl.方法 利用Trizol一步法从ECV304细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术从中获得Grx1的cD-NA,将质粒pcDNA3.1( )进行双酶切、CIP处理并回收纯化,与纯化后的Grx1cDNA连接构成重组表达载体pcD-NA3.1( )-Grx1,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆鉴定并进行测序分析.结果 经RT-PCR和测序鉴定,成功地克隆了人Grx1cDNA.结论 从ECV304细胞中获得Grx1的cDNA,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1( )-Grx1,对Grx1在体外表达、进一步研究其在氧化应激中的作用及其作用机制具有重要意义.     

一种人硫氧还蛋白基因修饰肝细胞的制备

[目的]制备出一种人硫氧还蛋白(hTrx)基因修饰的肝细胞.[方法]逆转录聚合酶链反应法扩增出hTrx cDNA,应用重组逆转录病毒制备hTrx基因修饰大鼠肝细胞.白蛋白免疫组化SABC法进行肝细胞活性鉴定,MTT比色试验进行抗氧化应激能力检测.[结果]克隆出hTrx开放阅读框cDNA并制备出重组逆转录病毒,感染真核细胞后可分泌融合表达的hTrx并具有生物学活性.制备出hTrx基因修饰大鼠肝细胞,免疫组化SABC法显示肝细胞功能正常,MTT比色法检测具有较强的抗氧化应激能力(P＜0.05),并可有效增殖.[结论]成功制备出一种具有较强抗氧化应激的hTrx基因修饰肝细胞.     

硫氧还蛋白系统与中枢神经系统疾病

有关中枢神经系统疾病发病机制的学说很多，自由基学说一直倍受关注。即如果中枢神经系统产生的自由基过多且未能及时清除，将会引起细胞结构的破坏进而功能丧失，最终导致中枢神经系统疾病的发生。广泛存在于各种组织细胞中的硫氧还蛋白(thioredox in，Trx)与疏氧还蛋白还原酶(thioredoxinreductase，TR)和NADPH一起组成     

人硫氧还原蛋白cDNA的克隆及序列测定

目的 克隆人硫氧还原蛋白（Human Thioredoxin,hTRX)cDNA序列并进行序列测定。方法 应用RT－PCR技术，以143（TK^-）人骨肉瘤细胞RNA为模板，扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因，并克隆至pGEM－T Easy载体中进行基因序列测定。结果 将所得序列与GenBanK(J04026)提供的序列比较，其酶活性中心（Trp-Cys-Gly-Pro-Cys)和基序与已知序列一致，第180、284位碱基与已知序列不同，编码的氨基酸也发生了改变。结论 克隆得编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因，为进一步探讨hTRX的生物活性的应用奠定了基础。     

硫氧还蛋白及硫氧还蛋白相互作用蛋白在结肠息肉癌变中的表达及意义

【摘要】 目的 探讨硫氧还蛋白（thioredoxin,Trx）与硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interacting protein,TXNIP）在结肠息肉、结肠腺瘤及结肠癌中的表达,分析Trx、TXNIP在结肠息肉癌变中的作用。 方法 收集河北北方学院附属第一医院2019年1月～2019年10月就诊的结肠息肉（结肠息肉组）20例、结肠腺瘤（结肠腺瘤组）40例、结肠癌（结肠癌组）20例以及正常结肠(正常结肠组)20例,通过ELISA法检测血清Trx、TXNIP的含量,采用胰岛素还原法检测血清Trx活性,苏木精-伊红染色（HE）法观察各组织的形态学,应用免疫组织化学法检测组织中Trx、TXNIP的表达,实时荧光定量PCR检测组织中Trx mRNA与TXNIP mRNA的表达水平。 结果 与正常结肠组比较,结肠腺瘤组与结肠癌组患者血清中Trx含量和活性明显升高,结肠息肉组、结肠腺瘤组患者与结肠癌组患者血清中TXNIP含量较正常结肠组明显下降,差异均有统计学意义（P＜0.05）;在结肠腺瘤组和结肠癌组组织中Trx阳性表达率明显高于正常结肠组,而TXNIP阳性表达率明显低于正常结肠组,差异均有统计学意义（P＜0.05）;与正常结肠组比较,结肠息肉组、结肠腺瘤组及结肠癌组组织中Trx mRNA的表达水平均明显上调,TXNIP mRNA的表达水平均明显下调,差异具有统计学意义（P＜0.05）。 结论 Trx在结肠息肉癌变中高表达,而TXNIP表达降低,表明两者都参与结肠癌前病变与癌组织的发生及发展,两者均在结肠息肉癌变过程中起着重要的作用。     

硫氧还蛋白在凋亡途径中的作用机制

硫氧还蛋白(Trx)是体内广泛存在的氧化还原蛋白,其家族中两种重要的硫氧还蛋白:硫氧还蛋白1(thioredoxin1,Trx1)和硫氧还蛋白2(thioredoxin2,Trx2)都含有保守的-Cys-Gly-Pro-Cys-还原序列。由于Trx具有调节细胞生长增殖和抗凋亡的作用,因此Trx在凋亡途径中的作用机制就成为了对抗肿瘤的研究热点。     

硫氧还蛋白与阿尔茨海默病的研究进展

硫氧还蛋白（Thioredoxin,Trx）是一种高度保守且广泛表达的小分子蛋白,具有维持体内细胞内外氧还原平衡、清除自由基、抑制细胞凋亡以及调节转录因子活性等功能,在细胞信号转导中也发挥重要的作用。阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）发病机理与体内自由基清除能力下降、神经元的丢失与凋亡有紧密的联系,近年来有关Trx与AD的发病机理的研究日渐增多。本文拟对Trx与AD的关系进行综述,理清Trx在AD中的作用,旨在为AD的治疗挖掘新途径。     

硫氧还蛋白2的研究进展

硫氧还蛋白2(Trx2)是特异位于线粒体的小分子蛋白,它在抗氧化应激、阻止线粒体介导的细胞死亡、调节某些基因的表达等方面起着关键作用。最新研究表明,Trx2还可促进血管再生、减少高血压病理生理改变,抑制神经退行性变、保护脑细胞,且高表达Trx2的细胞对致癌剂有更强的抵抗力。因此,Trx2与心血管、神经系统、肿瘤等疾病的发病机制密切相关。现综述Trx2的结构、生物学功能和有关机制,以及该蛋白在相关疾病中的基础研究。     

硫氧还蛋白互作蛋白在乳腺癌中的研究进展

硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)可以与硫氧还蛋白(TRX)直接结合,作为其内源性抑制蛋白,参与调节细胞内氧化应激水平。TXNIP作为一种抑癌蛋白,在人乳腺癌组织细胞中处于低表达状态,并且与细胞增殖、凋亡、患者预后等相关。本文就乳腺癌中TXNIP的结构、调节氧化应激的功能及抑癌机制做一综述,以证明TXNIP作为乳腺癌分子治疗的新靶点具有潜在价值。     

谷胱甘肽S－转移酶pi基因与逆转录病毒载体的重组体构建

为了在细胞水平上研究谷胱甘肽Ｓ－转移酶ｐｉ（ＧＳＴ－ｐｉ）基因的表达活性对化学致癌物诱导细胞转化作用的影响及探讨肿瘤基因预防的可能性，作为第一步，本实验构建了ＧＳＴ－ｐｉｃＤＮＡ与逆转录病毒载体ｐＸＴ_１的重组体。     

表达人泛素样修饰子基因细胞株的构建及其鉴定

目的：构建人泛素样修饰子(hUBL)基因的逆转录病毒载体并转染293T细胞，以探讨其生物学功能。方法：将hUBL克隆到原核表达质粒PET28a中，构建重组质粒PET28a-hUBL，转化BL2l菌，以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用其纯化蛋白免疫小鼠，获得多克隆抗体。重组蛋白用Westernblot鉴定。将hUBL基因克隆到逆转录病毒质粒中并转染293T细胞，用免疫组化染色法鉴定hUBL基因的表达。结果：hUBL在大肠杆菌中获得高效表达，并纯化了hUBL—PET28a的融合蛋白，以此为抗原制备了高效价的抗hUBL蛋白的小鼠多克隆抗体。免疫组化染色表明，hUBL重组逆转录质粒可在293T细胞中高效表达hUBL蛋白。结论：成功地构建了hUBL重组逆转录病毒载体，使得其在293T细胞中表达，获得稳定表达的细胞株。     

人Gfil基因克隆及重组Gfil慢病毒表达载体的构建

目的 克隆人Gill基因的全长cDNA,构建用于真核细胞表达的含有Gfil基因ORF区的重组慢病毒表达载体pLOX-Gfil,为研究Gfil基因的功能打下基础.方法 应用RT-PCR从人K562细胞系中扩增出Gfil cDNA片段·经回收纯化与pGEM-T载体连接并转化感受态菌DH5a,通过蓝白筛选酶切鉴定出阳性菌落,质粒提取,BamH I限制性内切酶酶切获得目的 基因,插入慢病毒载体pLOX中并转化感受态细菌DH5a.质粒提取后进行酶切及PCR鉴定,对阳性克隆进行DNA序列分析.结果 RT-PCR扩增获得含有约1.2 kb的DNA片段,酶切及PCR鉴定证实pLOX-Gfil含有大小正确的正向Gfil cDNA,DNA序列分析的结果 与发表于GenBank上的序列(NM005263)完全一致.结论 成功克隆人Gfil基因并构建用于真核细胞表达的重组慢病毒载体pLOX-Gfil.     

人DC-SIGN基因克隆及其转基因细胞的构建

目的克隆人DC-SIGN基因,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体,获得稳定表达DC-SIGN分子的L929基因转染细胞。方法利用RT-PCR的方法从人外周血单核细胞来源的树突状细胞（DC）总RNA中克隆出人DC-SIGN基因,通过双酶切（EcoRI,BamHI）装入逆转录病毒载体pGEZ-Term中,脂质体法共转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清感染L929细胞,72h后,加入Zeocin进行筛选,挑选出能稳定表达DC-SIGN蛋白的L929细胞株。结果构建了用于表达的含DC-SIGN基因的重组逆转录病毒载体,经转染包装细胞293T后,获得具有感染能力的重组DC-SIGN逆转录病毒和转染L929细胞,继而经RT-PCR、流式细胞仪表型检测,筛选出了稳定表达人DC-SIGN蛋白的L929转基因细胞。结论构建了含人DC-SIGN基因重组逆转录病毒载体和稳定表达人DC-SIGN蛋白的细胞株,为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。     

人IL-17F重组逆转录病毒载体的构建及其在293T细胞中的稳定表达

目的构建hIL-17F重组逆转录病毒载体并研究它在293T细胞中的表达。方法以测序验证的pUCm-T/hIL-17F为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因片段(包括20aa信号肽序列,而且hIL-17F基因内EcoR I酶切位点GAA T TC→GAA C TC同义点突变,即AA T→AA C,均为Asn),并正向插入逆转录病毒载体pSIV-1后经PCR、双酶切和测序鉴定。将构建正确的pSIV-1/hIL-17F与辅助病毒载体pHIT456和pHIT60混合后,采用脂质体法共转染293T包装细胞,获得具有感染能力的成熟重组逆转录病毒感染293T细胞,经G418筛选获得阳性细胞株,并应用PCR、RT-PCR和dot-ELISA法检测hIL-17F目的基因在293T细胞中的整合、转录和表达。结果成功构建了hIL-17F基因内EcoRI酶切位点GAA T TC→GAA C TC同义点突变的重组逆转录病毒载体pSIV-1/hIL-17F,并在293T细胞中稳定表达。结论以逆转录病毒为载体感染的稳定表达rhIL-17F的293T转基因细胞株的首次获得,为进一步研究hIL-17F的生物学功能及其机制奠定了良好的基础。     

人硫氧还蛋白还原酶cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：克隆人硫氧还蛋白还原酶(TR)基因并构建原核表达载体，获得TR蛋白。方法：采用反转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术，从人胚脑组织中扩增出TRcDNA片段，克隆至pGEM—T载体并转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒pGEM—TR；经序列分析证实后，提取pGEM—TR重组体，由双酶切得到目的片段，并插入pET9c原核表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组质粒pET—rhTR。异丙基硫代—β—D—半乳糖苷(IPTG)诱导pET—rhTR在BL21中表达，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及免疫蛋白印迹(Western blot)分析重组蛋白。结果：克隆的TRcDNA与人胎盘组织TRcDNA同源性为99％；pET—rhTR在大肠杆菌中高效表达，目的蛋白占菌体总蛋白量的36％，其分子质量为55ku。TRcDNA序列被GenBank收录，登录号为AF208018。结论：成功克隆了人脑组织来源的TR基因，该基因在大肠杆菌中得到高表达，为进一步研究其功能奠定基础。     

逆转录病毒载体介导的hLIF基因真核稳定表达体系的建立

目的 构建逆转录病毒载体介导的人白血病抑制因子(human leukemia inhibitory factor,hLIF)基因真核稳定表达细胞株.方法 采用DNA重组技术,构建并鉴定重组逆转录病毒载体pEGZ/MCS-HA-hLIF;以脂质体转染法,将重组逆转录病毒载体与辅助质粒HIT456、HIT60共转染入包装细胞系293T包装逆转录病毒,感染人胚肾成纤维细胞系,经zeocin筛选获得真核稳定表达细胞株;采用RT-PCR法和ELISA法鉴定hLIF基因的转录和翻译,并检测表达上清中hLIF因子对人白血病细胞HL-60的生物学活性.结果 PCR产物电泳后于609 bp处见特异性条带.双酶切出现两条带,其中位于609 bp处可见相应条带.核酸测序结果与GenBank中所报道的hLIF基因的CDS序列完全一致.RT-PCR结果显示表达细胞中存在hLIF基因转录,ELISA结果测定表达上清中hLIF的浓度为110.134 pg/ml.结论 携带hLIF基因的重组逆转录病毒载体pEGZ/MCS-HA-hLIF构建成功,并且获得了稳定表达hLIF基因的人胚肾成纤维细胞株,这为此基因的临床应用和实验研究打下了基础.