内脏利什曼病患者骨髓及血内病原体特异性kDNA片段PCR扩增用于诊断的研究

目的 :建立简易、准确的诊断内脏利什曼病和病原体鉴定技术。方法 :采用作者设计的杜氏利什曼原虫 ( L.d.)种特异引物 和 ,经 PCR扩增样品内病原体 k DNA2 97bp片段 ,检测 2 2例确诊内脏利什曼病 ( VL )患者骨髓、血、血清共 55份样品和 4例临床疑诊为黑热病患者的骨髓 (共 2 6例 ,59份样品 )。结果 :( 1) PCR法与骨髓涂片镜检符合率为 96.2 % ( 2 5/2 6) ;( 2 ) PCR法检测骨髓、血及血清的总阳性率为 95.4 % ( 2 1/2 2 ) ;( 3) PCR法检测 2 2例骨髓、 16例血样品及 17例血清样品 ,阳性率分别为 91% ( 2 0 /2 2 )、 68.8% ( 11/16)及 2 9.4 % ( 5/17)。 15例骨髓对照样品得自 9例白血病患者及 6例健康人。血及血清对照样品各得自 5例健康人。全部对照未见扩增产物 ,均为阴性。结论 :采用引物 和 进行 PCR扩增检测血内 k DNA特异片段诊断内脏利什曼病有较好前景。     

地高辛标记杜氏利什曼原虫kDNA重组片段特异性分析及序…

用地高辛标记杜氏利什曼原虫ｋＤＮＡ重组片段作为探针，与不同种株利什曼原虫ｋＤＮＡ斑点杂交，获得杜氏利会曼原虫一种特异性ｋＤＮＡ片段，双脱氧核苷酸链终止法测定片段长３２１ｂｐ，计算机检索及同源性分析比较再次表明该片段具有较高的种特异性。该片段可作为针用于利什曼病病原体的检测，有助于虫株鉴定，也可以作为聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增的靶序列。     

内脏利什曼病患者骨髓及血内病原体特异性kDNA片…

目的：建立简易、准确的诊断内脏利什曼病和病原体鉴定技术。方法：采用作者设计的杜氏利什曼原虫（Ｌ．ｄ．）种特异引物Ｉ和Ⅱ，经ＰＣＲ扩增样品内病原体ｋＤＮＡ２９７ｂｐ片段，检测２２例确诊内脏利什曼病（ＶＬ）患者骨髓、血、血清共５５份样品和４例临床疑诊为黑热病患者的骨髓（共２６例，５９份样品）。结果：（１）ＰＣＲ法与骨髓涂片镜检符合率为９６．２％（２５／２６）；（２）ＰＣＲ法检测骨髓、血及血清的总阳性率     

PCR扩增技术用于犬内脏利什曼病病原体kDNA的检测

本文报导了用作者设计的一对寡核苷酸引物Ⅰ和Ⅱ以及文献报导的一对引物A、B检测内脏利什曼病病犬的骨髓、脾和外周血内的病原体kDNA,并和骨髓涂片检查利什曼原虫的结果进行了比较。共检测人工感染犬12只,骨髓涂片阳性者8例,其中PCR检测骨髓组织样品阳性者7例,检测脾组织样品阳性者3例;对照组犬脾、骨髓和外周血所有组织样品均为阴性。根据实验结果认为此法用于检测犬内脏利什曼病病原体kDNA有较好的效果。     

地高辛标记杜氏利什曼原虫kDNA重组片段特异性分析及序列测定

用地高辛（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－１１－ｄＵＴＰ）标记杜氏利什曼原虫ｋＤＮＡ重组片段作为探针，与不同种株利什曼原虫ｋＤＮＡ斑点杂交，获得杜氏利什曼原虫一种特异性ｋＤＮＡ片段，双脱氧核苷酸链终止法测定该片段长３２１ｂｐ，计算机检索及同源性分析比较再次表明该片段具有较高的种特异性。该片段可作为探针用于利什曼病病原体的检测，有助于虫株鉴定，也可以作为聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增的靶序列。     

我国不同流行区内脏利什曼原虫分离株kDNA的PCR-SSCP分析

目的： 分析我国不同类型流行区内脏利什曼原虫 （Ｌ．ｄ．） 分离株ｋＤＮＡ。方法： 应用利什曼原虫属特异引物１３Ａ, １３Ｂ及据杜氏利什曼原虫四川人分离株ｋＤＮＡ 微环特异片段序列设计合成的引物Ⅰ、引物Ⅱ, ＰＣＲ扩增不同流行区利什曼原虫分离株ｋＤＮＡ, 获特定片段, 进行ＳＳＣＰ分析。结果： 用引物Ⅰ和引物ⅡＰＣＲ扩增内脏利什曼原虫分离株ｋＤＮＡ, 在同样试验条件下, 山丘地区和荒漠地区Ｌ．ｄ． 分离株扩增出２９７ ｂｐ 特定片段, 而平原地区Ｌ．ｄ．分离株及新疆皮肤利什曼原虫未扩增出２９７ ｂｐ 特定片段。将上述各虫株的２９７ ｂｐ 特定片段进行ＳＳＣＰ分析, 可见两个山丘地区的Ｌ．ｄ．分离株ｓｓＤＮＡ 迁移率相同, 而与荒漠地区新疆７７１分离株则相差较大。用引物１３Ａ, １３ＢＰＣＲ 扩增平原地区的Ｌ．ｄ．山东分离株和Ｌ．ｄ．江苏分离株、山丘地区的Ｌ．ｄ．汶川分离株、Ｌ．ｄ．甘肃分离株,均扩增出１２０ ｂｐ 特定片段。经ＳＳＣＰ分析,平原地区的Ｌ．ｄ．山东分离株和Ｌ．ｄ．江苏分离株的ｓｓＤＮＡ迁移率完全相同; 山丘地区的Ｌ．ｄ．汶川分离株和Ｌ．ｄ． 甘肃分离株ｓｓＤＮＡ迁移率相同, 但与平原地区者明显不同; 婴儿利什曼ｓｓＤＮＡ迁移     

快速ELISA法诊断犬内脏利什曼病及应用价值的研究

本研究建立一种用PVC薄膜作载体,将前鞭毛体可溶性抗原包被在PVC凹板上采用HRP-SPA作第二抗体及无每的TMB作底物的加速ELISA方法,该法简便、经济、实用。与经典ELISA平行对照检测24份骨髓穿刺证实的内脏利什曼病犬血清,结果：快速ELISA法阳性符合率为100%（24/24）,而经典ELISA法为95.83%(23/24);对47份采自非流行区的正常犬血清,两法均仅有1例呈假阳性反应,占左.13%;用快速ELISA法检测实验感染了旋毛虫、肺吸虫、钩虫、弓形虫等犬血清共26份,均未见交叉反应,用该法又调查了四川汶川县黑热病重流行区的124份犬血清,同时进行骨髓涂片检查,结果快速ELISA查出阳性犬39只,占31.45%(39/124),骨髓涂片查见利什曼原虫者有24只,占19.35%(24/124),这24只犬血清对快速ELISA法均呈阳性反应。     

用PCR扩增及Southern印迹杂交对新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病病原体kDNA同源性研究

本研究自新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病（ＣＬ）患者的皮肤病变组织内抽取微量的利什曼原虫ｋＤＮＡ，采用引物１３Ａ、１３Ｂ进行ＰＣＲ扩增，获１２０ｈＰ扩增产物（ＣＬ－ＰＣＲ－ＡＰ），并转移到尼龙膜上，分别与地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－１１－ｄＵＴＰ）标记的Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．ｇｅｒｂｉｌｌｉ、Ｌ．ｍａｊｏｒｋＤＮＡ探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，结果可见病变组织内ｋＤＮＡＰＣＲ－ＡＰ仅与Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａｋＤＮＡ探针有明显的杂交信号带，提示该地区皮肤利什曼病病原体ｋＤＮＡ与Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ有较强的同源性。为进一步分析该病原体与Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ和Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ新疆各分离株的同源关系，我们采用杜氏利什曼原虫（Ｌ．ｄ）种特异引物Ⅰ和Ⅱ对患者病变组织进行ＰＣＲ扩增，未见扩增产物。用地高辛标记的ＣＬ－ＰＣＲ－ＡＰ探针对Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ新疆各分离株进行打点杂交，结果显示该地区ＣＬ病原体与Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ新疆分离株以及其它利什曼原虫呈阴性反应。以上结果证实Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａｋＤＮＡ与克拉玛依地区ＣＬ患者的ＣＬ－ＰＣＲ－ＡＰ之间的同源关系。     

用重组 rK39抗原试纸条快速诊断内脏利什曼病

[目的 ]评价以恰氏利氏曼原虫类 kinesin基因中编码 39个氨基酸的基因片段 (r K39)为重组抗原 ,用于血清学诊断内脏利什曼病的价值。 [方法 ]在新疆喀什地区对 13例经脾检和骨髓穿刺阳性的内脏利什曼病患者 ,取一滴病人全血或血清滴在 r K39抗原试纸条底部的吸收垫上 ,血清中蛋白随缓冲液向试纸条上部移动 ,其中相应特异抗体可与 r K39抗原带结合 ,而产生阳性条带。同时 ,本文亦用相同阳性血清作了关于 r K 39抗原的 Western印迹分析对照。 [结果 ]EL ISA分析显示病人血清抗体滴度在 10 - 2～ 10 - 4 ,与所见到的 r K39试纸条上的反应强度符合。Western印迹分析亦显示阳性血清可识别 r K39蛋白条带。[结论 ]与传统诊断内脏利什曼病方法相比较 ,r K39试纸条更快速 ,特异 ,灵敏和低损伤性 ,可用于低发病率流行区的内脏利什曼病的诊断和筛选     

USEFULNESS OF kDNA PCR IN THE DIAGNOSIS OF VISCERAL LEISHMANIASIS REACTIVATION IN CO-INFECTED PATIENTS

SUMMARY

It is important to develop new methods for diagnosing relapses in the co-infection of visceral leishmaniasis (VL) and HIV to enable earlier detection using less invasive methods. We report a case of a co-infected patient who had relapses after VL treatment, where the qualitative kDNA PCR showed a good performance. The kDNA PCR seems to be a useful tool for diagnosing VL and may be a good marker for predicting VL relapses after treatment of co-infected patients with clinical symptoms of the disease.     

CASE STUDY OF A PATIENT WITH HIV-AIDS AND VISCERAL LEISHMANIASIS CO-INFECTION IN MULTIPLE EPISODES

SUMMARY

Report of a 45-year-old male farmer, a resident in the forest zone of Pernambuco, who was diagnosed with human immunodeficiency virus (HIV) in 1999 and treated using antiretroviral (ARV) drugs. In 2005, the first episode of visceral leishmaniasis (VL), as assessed by parasitological diagnosis of bone marrow aspirate, was recorded. When admitted to the hospital, the patient presented fever, hepatosplenomegaly, weight loss, and diarrhea. Since then, six additional episodes of VL occurred, with a frequency rate of one per year (2005-2012, except in 2008). In 2011, the patient presented a disseminated skin lesion caused by the amastigotes of Leishmania, as identified by histopathological assessment of skin biopsy samples. In 2005, he was treated with N-methyl-glucamine-antimony and amphotericin B deoxycholate. However, since 2006 because of a reported toxicity, the drug of choice was liposomal amphotericin B. As recommended by the Ministry of Health, this report emphasizes the need for HIV patients living in VL endemic areas to include this parasitosis in their follow-up protocol, particularly after the first infection of VL.     

EXPERIMENTAL STUDY ON APPLICATION OF PCR IN DIAGNOSIS OF KALA-AZAR

用ＰＣＲ方法对２５名确诊的黑热病病人和６０例对照进行黑热病诊断的实验研究。结果显示：其灵敏度９６％（２４／２５），特异度１００％（６０／６０），假阳性率０％，假阴性率４％，符合率９９％，约登指数为０．９６。ＰＣＲ方法能在外周血清仅为１μ１情况下测出其中原虫的ＤＮＡ。     

新疆地区皮肤利什曼病病原体SSU rDNA PCR扩增及限制性酶切分析

我们采用引物R200和R300，对新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病（CL）患者的皮肤病变组织内抽提的微量利什曼原虫SSUrDNA，以及有关利什县原虫种株的SSUrDNA进行PCR扩增，然后分别采用限制住内切酶Rsal和Hhal对PCR扩增产物进行限制性酶切分析。结果显示：采用RsaⅠ进行限制性酶切分析，克拉玛依地区2例CL患者皮肤病变组织标本的PCR扩增产物经酶切后，其电泳图形与L．tropica完全相同。显示克拉玛依地区CL病原体SSUrDNA的PCR扩增产物与L．tropica存在相同的限制性内切酶图谱。     

EXPANSION OF VISCERAL LEISHMANIASIS IN THE STATE OF RIO DE JANEIRO, BRAZIL: REPORT OF THE FIRST AUTOCHTHONOUS CASE IN THE MUNICIPALITY OF VOLTA REDONDA AND THE DIFFICULTY OF DIAGNOSIS

Visceral Leishmaniasis has been showing remarkable epidemiological changesin recent decades, with marked expansion and an emergence of cases in urban areas ofthe North, Southeast and Midwest regions of Brazil. The Kala-azar cases reportedhere, despite being very characteristic, presented a great difficulty of diagnosis,because the disease is not endemic in Volta Redonda. The child underwent twohospitalizations in different hospitals, but got the correct diagnosis only after 11months of symptom onset. In this report we discuss the main differential diagnosesand call attention to the suspected symptoms of visceral leishmaniasis in patientswith prolonged fever, hepatosplenomegaly and pancytopenia, even in areas nottraditionally endemic for the disease.     

rK39抗原应用于我国西北地区内脏利什曼病诊断的研究

目的：评价ｒＫ３９抗原诊断内脏利什曼病的价值。方法：利用利什曼原虫的类Ｋｉｎｅｓｉｎ基因中编码３９个氨基酸重组片段的表达产物ｒＫ３９为抗原，对我国甘肃、四川、新疆等部分地区的１０７名黑热病患者进行ＥＬＩＳＡ诊断。结果：血清１∶１００稀释，ｒＫ３９重组抗原的工作浓度为１∶３０００，检出的抗体阳性率为９６．２％（１０３／１０７），与原虫检出的符合率为１００％。在６５例５岁以下病人中，阳性检出率为９５．３％（６２／６５）。挑选３１名抗体阳性滴度较高者，使用ｒＫ３９的工作浓度仍为８０ｎｇ／孔，则阳性的最高滴度可达１０－３。除１例麻风病患者抗体ＯＤ＞０．４３外，２７例正常人、２０例疟疾病人、２０例血吸虫病病人及２７例结核病患者血清均无交叉反应出现。结论：用重组抗原ｒＫ３９作为黑热病诊断，在我国尚属首次，此法特异性及敏感性高，且有稳定的重复性。