丙戊酸钠对大鼠海马神经元癫痫样放电后细胞外信号调节激酶磷酸化水平的影响

目的细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)参与癫痫的发生,但其与抗癫痫药物之间的关系不明确,文中旨在观察丙戊酸钠对大鼠海马神经元癫痫样放电后磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的影响。方法取24 h内新生Wistar大鼠,雌雄不拘,迅速断头取脑。建立神经元癫痫样放电模型,将神经元分为空白对照组和丙戊酸钠组,量效实验中,于神经元癫痫样放电前30 min时加入不同浓度的丙戊酸钠(50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L),运用免疫荧光技术测定p-ERK1/2在不同浓度时的表达;时效实验中,分别于癫痫样放电前30 min,放电后0 min、30 min、2 h和6 h加入50mg/L丙戊酸钠,采用Wester blot观察p-ERK1/2的变化。结果量效实验中,不同浓度的丙戊酸钠均能降低ERK1/2的磷酸化水平,且无显著性差异。时效实验中,于放电前30 min时加入丙戊酸钠对ERK1/2的磷酸化水平抑制最明显,与以后各时间点间都有显著性差异。结论海马神经元癫痫样放电后ERK1/2被过度持久的激活,在早期小剂量有效浓度的丙戊酸钠能显著抑制此反应中ERK1/2的磷酸化水平。     

丙戊酸钠对大鼠海马神经元癫痫样放电后P-CREB1表达的影响

目的:研究丙戊酸钠对大鼠海马神经元癫痫样放电后磷酸化腺感苷反应元件结合蛋白1(Phosphorylated cAMP responsiveelement binding protein1,P-CREB1)表达的影响.方法:wistar新生鼠,迅速断头取脑,体外培养海马神经元,建立神经元癫痫样放电模型.将神经元分为空白组、模型组、丙戊酸钠低剂量(50 mg/L)组、丙戊酸钠高剂量(100 mg/L)组,运用免疫荧光技术观察P-CREB1在神经元癫痫样放电后在细胞内的表达部位,采用wester blot技术测定P-CREB1在不同分组中的表达强度.结果:通过免疫荧光技术,在各组中都可以看到P-CREB1在细胞核内表达,以模型组最明显;运用Western blot,发现表达趋势与免疫荧光一致,并且,给予丙戊酸钠后,P-CREB1表达减弱,且高剂量组与低剂量组之间差异有统计学意义(P<0.05).结论:海马神经元无镁处理后呈癫痫样放电,同时P-CREB1被过度激活,而有效浓度的丙戊酸钠可抑制此反应P-CREB1的磷酸化水平.     

糖尿病大鼠脑缺血再灌注海马CA4区神经元中磷酸化ERK1/2的表达上调

目的 探讨细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)在糖尿病脑缺血再灌注大鼠海马CA4区神经元表达的意义.方法 在链脲佐菌素性糖尿病大鼠脑缺血再灌注模型基础中,应用TUNEL、免疫组化方法 观察糖尿病脑缺血组与正常血糖脑缺血组在全脑缺血15 min、再灌注1 h海马CA4区神经元凋亡和磷酸化ERK1/2(P-ERK1/2)的表达变化.结果 糖尿病脑缺血组在缺血15 min、再灌注1 h海马CA4区神经元凋亡发生率均明显高于正常血糖脑缺血组(P<0.05);糖尿病脑缺血组各时间点磷酸化ERK1/2明显增高,于再灌注1 h明显高于正常血糖组(P<0.01).结论 糖尿病加重脑缺血再灌注神经元的损伤,其机制可能与ERK1/2的激活有关.     

灵芝酸对痫样放电海马神经元ERK1/2磷酸化水平的影响

目的：探讨灵芝酸对癫痫样放电海马神经元ERK1/2磷酸化水平的影响。方法：以24h内新生Wistar大鼠为细胞源,用Neurobasal培养液培养海马神经元。①应用激光共聚焦显微镜检测培养神经元的纯度及其鉴定。②应用MTT法测灵芝酸的最适无毒浓度。③在研究最大无毒浓度的灵芝酸对痫样放电海马神经元ERK1/2磷酸化水平影响的实验中,将细胞随机分为：①正常对照组：将培养至第9天的海马神经元全液换成正常细胞外液处理3h,然后恢复正常培养3h后取材;②模型组：将培养至第9天的海马神经元全液换成无镁细胞外液处理3h,然后恢复正常培养3h后取材;③治疗组：将培养至第9天的海马神经元根据灵芝酸浓度不同,分为低、中、高三个浓度组（浓度分别为20μg/mL、80μg/mL、320μg/mL）,将各组的维持培养液全液换成无镁细胞外液处理3h,然后全液换成维持培养液配制不同浓度灵芝酸混悬液处理3h后取材。ELISA方法检测ERK1/2磷酸化水平的表达。结果：成功离体培养海马神经元,并用酶联免疫分析ERK1/2磷酸化水平的表达。各实验组中均有ERK1/2的表达并且各治疗组均能降低ERK1/2磷酸化水平,浓度为80μg/mL时结果最明显。结论：海马神经元癫痫样放电后ERK1/2被激活,在有效浓度的灵芝酸能显著抑制此反应中ERK1/2的磷酸化水平。     

戊四氮致痫大鼠中ERK信号通路的研究

目的:研究细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)信号通路在癫痫大鼠脑内的表达规律及其意义。方法:建立戊四氮致痫大鼠模型,在痫性发作30 min、1.5 h5、h和8 h应用免疫组织化学和Western印迹法对海马ERK1、ERK2和p-ERK1/2蛋白水平的表达进行研究,并加用ERK通路阻断剂PD98059干预。结果:正常大鼠脑内有少量的ERK1和ERK2阳性神经元,未见有p-ERK1/2阳性神经元。戊四氮致痫后30min p-ERK1/2开始表达,ERK1和ERK2表达较对照组开始增强(P<0.05),1.5 h后p-ERK1/2强烈表达(P<0.05),5 h后3者的表达开始减弱。PD98059干预组ERK1/2的活化较癫痫组显著受抑(P<0.05)。Western Blot结果显示,癫痫组大鼠ERK1、ERK2和p-ERK1/2蛋白表达较对照组明显增强(P<0.05),PD98059干预组3种蛋白水平显著低于癫痫组(P<0.05)。1.5 h时点的蛋白表达水平高于其他各时点相应组(P<0.05)。同时PD98059完全抑制了大鼠的痫性发作。结论:ERK信号途径在戊四氮致痫模型中被激活,参与癫痫发作的病理生理过程,并可能具有上游始动发生的作用。     

偏头痛模型大鼠三叉神经脊束核磷酸化ERK1/2水平变化

目的 探讨ERK1/2在偏头痛中枢发病机制中的作用.方法 6只SD大鼠随机数字表法分为：正常组（N组）、假手术组（C组）、偏头痛模型组（M组）、二甲基亚砜组（DMSO）（D组）和ERK1/2抑制剂PD-98059组（PD组）,每组n=12.进行三叉神经脊束核神经元放电记录和ERK1/2磷酸化水平检测.结果 （1）放电频率变化百分比：造模后,三叉神经脊束核细胞外放电频率增加,造模后2h为造模前的（325.88±47.32）％;M放电频率（325.9±47.3）％高于N组（100.0±0.0）％和C组（107.3±16.4）％.D组放电频率（319.3±42.5）％与M组（325.9±47.3）％相比,差异无统计学意义;PD组放电频率（218.5±31.7）％低于M组（325.9±47.3）％和D组（319.3±42.5）％.（2）磷酸化水平：M组、D组ERK1/2磷酸化水平高于N组和C组;D组与M组相比,磷酸化水平无明显变化;PD组磷酸化水平低于其余四组.结论 偏头痛中枢敏感化过程中,三叉神经脊束核神经元兴奋性和ERK1/2磷酸化水平增加,ERK1/2抑制剂PD-98059能减少神经元兴奋性和ERK1/2磷酸化水平,说明ERK1/2可能参与大鼠偏头痛中枢敏感化的形成.     

磷酸化ERK1／2在糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤中的表达意义

目的：探讨细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）在糖尿病脑缺血再灌注大鼠神经元中表达的作用.方法：采用链脲佐菌素（STZ）诱导和双血管阻塞联合放血法建立糖尿病大鼠全脑缺血模型,应用TUNEL、免疫组化方法观察糖尿病脑缺血组与正常血糖脑缺血组在全脑缺血15min、再灌注1,3h海马CA4区神经元凋亡和磷酸化ERK1/2（P-ERK1/2）的表达变化.结果：糖尿病脑缺血组在缺血15min、再灌注1,3h各时间点海马CA4区神经元凋亡发生率均明显高于正常血糖脑缺血组（P〈0.05）;糖尿病脑缺血组在各时间点磷酸化ERK1/2均有较高表达,于再灌注1,3h明显高于正常血糖组（P〈0.01）.结论：ERK1/2可能参与并介导了糖尿病加重的脑缺血再灌注神经元的损伤.     

应激抑郁模型大鼠脑内ERK1/2含量和活性的变化

目的探讨慢性轻度不可预见性应激抑郁模型大鼠脑内ERK1/2含量和活性的变化,为进一步从信号传导的角度阐明抑郁症的分子病理机制提供线索.方法20只SD 2～3月龄雄性大鼠,随机分为正常对照组10只、应激抑郁模型组10只,应激抑郁模型组经过21 d慢性轻度不可预见性应激,以旷场行为总分评定其应激前后行为学改变.正常对照组和抑郁模型组在应激后即断头处死,采用蛋白印迹技术检测大鼠额叶皮质、海马、下丘脑、纹状体磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)和非磷酸化ERK1/2的表达.结果经过21 d的慢性应激,应激大鼠旷场行为总分较应激前显著减少(P＜0.001).应激后抑郁模型组额叶部位p-ERK1、p-ERK2含量较正常对照组低,差异有显著性(P＜0.001),ERK1/2的表达两组间比较差异无显著性(P＞0.05);海马部位p-ERK1、p-ERK2含量也较正常对照组低,但差异无显著性,海马部位ERK1/2的表达两组间比较差异无显著性(P＞0.05);纹状体和下丘脑部位p-ERK1/2、ERK1/2含量在应激前后均无明显变化.结论应激大鼠额叶部位p-ERK1/2含量的降低提示ERK信号传导通路的下调可能参与了应激所致抑郁的机制.     

海马神经元无镁致痫性损伤对CREB磷酸化水平的影响

目的：观察原代培养的海马神经元经无镁人工脑脊液诱发癫痫样放电后,cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response-element binding protein,CREB）磷酸化表达水平的变化。方法：将所培养的神经元随机分成癫痫组和对照组,癫痫组中的神经元培养至第10天时,经无镁人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid,ACSF）处理3 h建立癫痫样放电模型,对照组中的神经元培养至第10天时,使用正常人工脑脊液处理3 h。使用Western blot检测p-CREB和β-actin的表达,免疫荧光双重标记磷酸化CREB（p-CREB）和神经元核抗原（neuronal nuclei,NeuN）的表达。结果：Western blot显示p-CREB水平在癫痫样放电后2 h即较对照组增强且在6 h达到高峰,在12 h和24 h都维持在增强水平,差异皆有统计学意义（P＜0.01）。取癫痫样放电后6 h的神经元行免疫荧光检测,其荧光强度绝对值较对照组明显增强,差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：p-CREB水平在海马神经元无镁致痫性损伤后增强,可能在癫痫样放电中起到重要作用。     

MAPKERK1/2信号转导途径在实验性癫痫大鼠海马结构的激活

目的:探讨细胞外信号调节激酶在癫痫持续状态(SE)大鼠脑内的活性变化规律及其意义.方法:建立氯化锂-匹罗卡品癫痫持续状态模型,在不同时间点用免疫组化法检测海马结构ERK1/2的磷酸化状态(p-ERK1/2),并观察组织病理学改变.结果:生理盐水对照组p-ERK1/2在海马结构仅见于神经纤维.SE30min后ERK1/2在胞体强烈激活,2h时达到高峰,6h后各区均明显减少,12h后降至基础水平,在所有时间点,ERK1/2在齿状回的活化程度均显著高于CA1和CA3区.海马结构各区可见到许多神经元发生变性和坏死.结论:MAPK ERK1/2信号转导途径在匹罗卡品致痫过程中被激活,并可能在发 作后海马神经元急性损伤与保护的病理生理过程以及长时程形态学变化的形成中起作用.     

碱性成纤维细胞生长因子对染铅大鼠海马神经元胞浆ERK的保护作用

目的研究碱性成纤维细胞生长因子（b FGF）对染铅大鼠海马神经元细胞外调节蛋白激酶（ERK）的保护作用。方法神经元培养7 d后,用0.6μg/L的b FGF以及不同浓度铅处理细胞,然后测定ERK活力。结果铅处理神经元30 min后,在铅浓度0.1~2.0μmol/L时ERK活性明显升高,其中2.0μmol/L时最高。经过b FGF处理以后的细胞,在铅浓度1.0~4.0μmol/L时ERK活性与对照组相比无明显差异。结论染铅浓度不同对ERK活性影响也不同,b FGF可以保护神经元中ERK活性。     

氯胺酮对成年小鼠海马神经元P—ERK1／2表达和学习记忆能力的影响

目的研究氯胺酮对成年小鼠海马神经元P—ERK1／2表达和学习记忆能力的影响。方法成年雄性昆明小鼠分为生理盐水组（16ml／kg）、氯胺酮K1组（50mg／kg）、氯胺酮K2组（100mg／kg）和氯胺酮K3组（200mg／kg）。氯胺酮K3组又分为K3a组（6h）、K3b组（12h）和K3c组（24h）,每组各10只,每组连续腹腔注射不同剂量氯胺酮7天,每天1次。采用Y迷宫进行记忆能力测试;提取海马组织总蛋白,免疫印迹检测P—ERK1／2表达。结果与生理盐水组相比,K1组和K2组成年小鼠学习记忆保持率、P—ERK1／2表达的差异无统计学意义（P〉0．05）,而K3组成年小鼠学习记忆保持率、P—ERK1／2表达均低于生理盐水组、K1组和K2组（P〈0．05）。结论过量氯胺酮可能通过抑制成年小鼠海马神经元P—ERK1／2表达损害其学习记忆能力。     

全脑缺血复灌不同时间对大鼠海马神经元损伤及JNK通路的影响

目的探讨大鼠全脑缺血和复灌不同时间对海马神经元损伤、C-Jun氨基末端激酶（JNK）表达以及JNK激活的影响。方法采用四血管法（4-vessel-occlusion,4-vo）法制作大鼠全脑缺血模型,随机将51只SD大鼠分成假手术组、缺血组和缺血再灌注组,用Western blot检测海马组织JNK的表达和P-JNK的含量。另取9只大鼠缺血10min或缺血20min后复灌7d,甲醛灌注固定后取海马组织用于组织学评价。结果JNK在全脑缺血10min表达明显增加,缺血20min时达到峰值;全脑缺血20min复灌阶段JNK在复灌6h表达明显增加并达到-高峰,复灌12h到达最高峰;P-JNK含量在全脑缺血20min后复灌1h达到高峰,复灌12h再次出现高峰。结论20min全脑缺血后JNK高表达持续时间延长,JNK激活时间更早,更为显著,表明长时间缺血时JNK通路介导的损害作用更大。     

大鼠蛛网膜下腔出血后海马区磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2表达与细胞自噬的关系

目的 探讨大鼠蛛网膜下腔出血(SA H)后海马区细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)表达与神经细胞自噬的关系. 方法 采用枕大池二次注血法制作SA H大鼠模型,将120只雄性SD大鼠采用数字表法分成假手术组(Sham)、SA H组、U0126(ERK1/2抑制剂)低剂量组及U0126高剂量组.低剂量和高剂量U0126组分别于造模前30 min侧脑室注射U01265和10 g/L.水迷宫行为学测试大鼠的行为学变化;光镜观察海马区神经细胞形态结构;免疫组织化学法和免疫印迹法检测海马区磷酸化 ERK1/2(p-ERK1/2)和自噬标志蛋白(Beclin-1及LC3-Ⅱ)的表达水平. 结果 与Sham组比较,SA H组大鼠在72 h的逃避潜伏期时间明显延长、穿台次数明显减少(P<0.05),各时间点神经元存活比率均明显降低,且SA H组p-ERK1/2,Beclin-1及LC3-Ⅱ表达均增加,于24 h达高峰;与 SA H 组比较,低、高剂量 U0126组大鼠相应时间点的潜伏期明显延长、穿台次数明显减少(P<0.05),各时间点神经元存活比率均明显降低,且p-ERK1/2,Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达及存活神经细胞比率降低(P<0.05);与低剂量U0126组比较,高剂量U0126组的大鼠相应时间点的逃避潜伏期明显延长、穿台次数明显减少(P<0.05),p-ERK1/2及存活神经细胞比率降低(P<0.05),但2组间的Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白比较差别均无统计学意义(P>0.05). 结论 大鼠SA H后海马区p-ERK1/2激活对神经细胞有保护作用,且这种保护作用与神经细胞自噬有关.     

阻滞ERK1/2通路对大鼠弥漫性脑损伤组织c-fos基因表达的影响

目的 研究大鼠弥漫性脑损伤（DBI）后细胞外信号调节激酶1／2（ERK1／2）通路特异性阻断剂U0126对c-fos基因表达的影响。方法 按Marmarou方法制作大鼠DBI模型，尾静脉注射U0126。Western blot法检测脑组织磷酸化ERK1／2（pERK1／2）的表达，RT-PCR法检测c-fos mRNA的表达，免疫组织化学法检测pERK1／2和c-fos蛋白在损伤脑组织中的分布。结果 DBI后脑组织中pERK1／2表达增高，5min达峰值，并持续高水平表达至72h。c-fos与pERK1／2变化趋势相似，但峰值出现较晚。注射U0126后，pERK1／2表达受抑制，c-fos mRNA表达减少（P〈0．05），c-fos阳性细胞平均灰度值升高（P〈0．05）。结论大鼠DBI后ERK1／2通路被过度和持久激活，阻滞ERK1／2活化可以下调c-fos基因的表达。     

美金刚保护缺血神经元分子机制的研究

目的 探讨N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体非竞争性抑制剂美金刚（memantine）对脑缺血再灌注（I/R）损伤的影响及其分子机制.方法 制备四动脉结扎（4-VO）大鼠全脑缺血模型.实验分为4组（n=6）：假手术组（sham组）,缺血/再灌注组（I/R组）,美金刚处理组和生理盐水组.在缺血后立刻腹腔注射美金刚或生理盐水.焦油紫染色观察海马CA1区神经元的存活情况,免疫印迹检测大鼠海马中p-ERK1/2的表达.结果 与sham组相比,I/R组神经元死亡增加,p-ERK1/2表达下调;与I/R组相比,美金刚处理组显著降低了神经元的死亡率,同时也明显升高了p-ERK1/2的表达.结论 美金刚抑制了I/R引起的神经元死亡.其机制可能与美金刚抑制突触外NMDA受体的过度激活进而激活ERK通路有关.     

异氟醚对转APP基因小鼠脑内海马神经元蛋白质损伤和蛋白聚集的影响

目的：观察吸入麻醉药异氟醚对转APP基因小鼠脑内海马神经元蛋白质损伤和蛋白聚集的影响,并探讨海藻糖对异氟醚诱导的神经毒性的干预作用。方法：60只12月龄转APP基因小鼠随机分为对照组、异氟醚组（Iso组）和海藻糖组（Tre组）,每组20只。对照组小鼠不给予任何药物,将其置于持续通入2 L·min^-1氧气的麻醉箱中2h;Iso组和Tre组小鼠于麻醉前30 min分别经腹腔注射2 mL生理盐水或海藻糖（400 μg·kg^-1）稀释液,然后给予1.4%异氟醚吸入麻醉2 h。麻醉后6 h 取小鼠海马组织制备脑组织匀浆,应用 DCFH-DA荧光法检测小鼠海马组织中活性氧（ROS）水平;麻醉后24 h应用免疫组织化学法和Western blotting法检测小鼠海马组织中蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸和β-淀粉样蛋白（Aβ）_1-42蛋白表达水平,应用透射电镜检测海马神经元中蛋白聚集物的形成,应用TUNEL染色法观察小鼠海马组织中神经元凋亡率。结果：与对照组比较,Iso组小鼠海马组织中ROS水平、氧化蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸、Aβ_1-42蛋白表达水平和神经元凋亡率均明显增加（P < 0.05）;与Iso组比较,Tre组小鼠海马组织中ROS水平、氧化蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸、Aβ_1-42蛋白表达水平和神经元凋亡率均明显降低（P < 0.05）。结论：异氟醚能诱导转APP基因小鼠海马神经元蛋白质损伤和蛋白聚集,加剧氧化应激反应,增加脑内海马神经元凋亡,海藻糖能够拮抗异氟醚诱导的神经毒性。     

人参多糖对K562细胞凋亡与细胞周期的影响及其机制

目的探讨人参多糖(ginseng polysaccharide,GPS)诱导白血病细胞K562凋亡和周期阻滞的机制。方法取对数生长期的K562细胞,调整密度为7×108/L,空白对照组予以常规培养;GPS组加入400 mg/L GPS。流式细胞仪测定细胞的凋亡率及细胞周期分布变化;RT-PCR检测细胞ERK表达的变化。免疫组化的方法检测细胞中p-ERK、NF-κB、Cyclin D1蛋白定位及表达量的变化。Western blot检测细胞中ERK、p-ERK、NF-κB、Cyclin D1蛋白的变化。结果与对照组比较,K562细胞在400 mg/L GPS的作用下,体外培养24、48、72 h后,GPS组细胞凋亡率显著增高(P<0.05),周期分布检测结果显示,与对照组相比,GPS组K562细胞G0/G1期细胞数量呈时间依赖性增多(P<0.05),G2+M、S期细胞数量则明显减少(P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,400 mg/L GPS处理48 h组ERK mRNA的表达水平明显低于对照组(0.20vs 0.50,P<0.05)。免疫组化显示p-ERK、NF-κB、Cyclin D1主要分布在细胞核和细胞质,与对照组相比,GPS组K562细胞内p-ERK、NF-κB、Cyclin D1的表达明显减弱。Western blot检测结果显示,ERK总蛋白无明显变化(P>0.05),而p-ERK、NF-κB、Cyclin D1随时间变化有减少趋势,且在48 h减少明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论人参多糖GPS可促使K562细胞周期阻滞在G0/G1期,并诱导K562细胞凋亡,且均呈时间依赖性。GPS促进K562细胞凋亡、导致其细胞周期阻滞的机制可能是通过抑制ERK/NF-κB信号通路的激活,进而下调Cyclin D1来实现的。